Name: High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Ontdek hoe je een kwantitatieve fluorescentie-assay ontwikkelt om de activiteit van inward rectifier kaliumkanalen (Kir) te meten via high-throughput screening. Deze methode identificeert nieuwe modulatoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door financiering uit National Institutes of Health subsidies 1R21NS073097-01 en 1R01DK082884 (JSD) en de Stichting voor de National Institutes subsidie ​​PIER11VCTR.

<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Gegevensverwerking: Nadat de gegevens zijn verzameld, een gebruikelijke stap in de analyse omvat normaliseren elke put fluorescentie respons, F, zijn initiële waarde aan het begin van het experiment F 0. Dit wordt gewoonlijk aangeduid als de &quot;statische ratio&quot; en symbool &quot;F / F 0&quot;. Wanneer F 0 wordt gedomineerd door de indicatorkleurstof de statische operatie verhouding aanzienlijk zal corrigeren vele factoren zoals disuniformities in verlic...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetracycline induceerbare expressievector </td></tr><tr><td> T-Rex-HEK293 cellen </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetracycline-induceerbare cellijn </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / Plus Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfectiereagens </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Celcultuurmedia </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Celcultuurmedia </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Celcultuurmedia </td></tr><tr><td> Blasticidine S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Celcultuurmedia </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Celcultuurmedia </td></tr><tr><td> HBSS-divalente gratis </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Cel wassen </td></tr><tr><td> Trypsine-0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Cel dissociatie </td></tr><tr><td> Tetracycline-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Inductie reagens </td></tr><tr><td> Gedialyseerde FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Plating media </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Fluorescerende kleurstof </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Dye laden </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Testbuffer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Testbuffer </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + stimulus buffer </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + stimulus buffer </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + stimulus buffer </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + stimulus buffer </td></tr><tr><td> Thallium sulfaat </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + stimulus buffer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + stimulus buffer </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Solvent </td></tr><tr><td> Acht-kanaals elektronische pipet </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Cel plating in 384 -putjesplaten </td></tr><tr><td> BD PureCoat amine beklede 384-putjes </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Assay microplaten </td></tr><tr><td> Echo gekwalificeerd 384-Well polypropyleen microplaat (384pp) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Compound bron microplaten </td></tr><tr><td> 384-wells polypropyleen microplaten </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi reagens dispenser </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 microplaat wasmachine </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Geautomatiseerde cel wassen </td></tr><tr><td> Echo vloeibare handler </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo geautomatiseerde liquid handling platform </td><td> Agilent Technologies </td><td> Standaard model </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic imaging plaat lezer </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Lijst van materialen en reagentia.

high-throughput screening voor kleine-molecule modulators van actieve rectifier kaliumkanalen

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specifieke leden van de regeling actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanaal familie worden gepostuleerd drug targets voor een verscheidenheid van aandoeningen, waaronder hypertensie, atriumfibrilleren, en pijn 1,2. Voor het grootste deel, echter, is de vooruitgang in de richting van het begrijpen van hun therapeutisch potentieel of zelfs elementaire fysiologische functies is vertraagd door het gebrek aan goede farmacologische tools. Inderdaad, de moleculaire farmacologie van de actieve gelijkrichter familie ver achter die van de S4 superfamilie van voltage-gated kalium (Kv) kanalen, waarbij een aantal nanomolaire affiniteit en zeer selectieve modulatoren peptide toxine ontdekt 3. De bijengif toxine tertiapin en derivaten daarvan zijn krachtige remmers van Kir1.1 en Kir3 kanalen 4,5, maar peptiden een beperkt nut therapeutisch als experimenteel vanwege hun antigene eigenschappen en slechte biologische beschikbaarheid, metabolische stabiliteit en weefsel penetrantie. De ontwikkeling van krachtigeen selectieve kleine moleculen sondes met verbeterde farmacologische eigenschappen zal een sleutel tot het volledig begrijpen van de fysiologie en therapeutisch potentieel van Kir-kanalen zijn. De Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN), ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Gemeenschappelijk Fonds heeft mogelijkheden gecreëerd voor academische wetenschappers sonde ontdekking campagnes te starten voor moleculaire targets en signaalwegen die behoefte hebben aan een betere farmacologie 6. De MLPCN biedt onderzoekers toegang tot de industrie-schaal screening centra en medicinale chemie en informatica ondersteuning op laag-moleculaire sondes om de functie van genen en genproducten netwerken toe te lichten te ontwikkelen. De kritische stap in het verkrijgen van toegang tot de MLPCN is de ontwikkeling van een robuuste target-of route-specifieke assay die vatbaar voor high-throughput screening (HTS). Hier beschrijven we hoe u een fluorescentie gebaseerde thallium (Tl +) flux ASSA ontwikkeleny van Kir kanaalfunctie voor high-throughput screening verbinding 7,8,9,10. De assay is gebaseerd op de permeabiliteit van de K + kanaalporie de K + Tl + congener. Een commercieel verkrijgbare fluorescerende Tl + reporter kleurstof wordt gebruikt flux van Tl + detecteren door de porie. Er zijn minstens drie beschikbare kleurstoffen die geschikt zijn voor Tl + flux assays: BTC, FluoZin-2 en FluxOR 7,8. Dit protocol beschrijft assay-ontwikkeling met behulp FluoZin-2. Hoewel oorspronkelijk ontwikkeld en verkocht als een zink indicator, FluoZin-2 vertoont een robuuste en dosisafhankelijke toename in fluorescentie-emissie bij Tl + binding. We begonnen te werken met FluoZin-2 voor FluxOR beschikbaar was 7,8 en zijn doorgegaan met dat 9,10 doen. De stappen in assay ontwikkeling zijn in wezen identiek voor alle drie kleurstoffen en gebruikers moeten bepalen welke kleurstof meest geschikt is voor de specifieke needs. We bespreken ook de test de prestaties van benchmarks die moeten worden bereikt om in aanmerking komen voor de toegang tot het MLPCN. Sinds Tl + gemakkelijk doordringt de meeste K + kanalen, moet de test kunnen worden aangepast aan de meeste K + kanaal doelstellingen.

Het gebruik van een tetracycline-induceerbaar expressiesysteem een handige interne controle voor het onderscheid Tl + flux via endogene routes en Kir kanaal plaats. Figuur 1 toont voorbeelden van cel plating kaarten in verschillende experimenten. De posities van putjes met geïnduceerde of tetracycline-geïnduceerde cellen worden aangeduid met verschillende kleuren. Figuur 2A toont de bron plaat kaart gebruikt om de optimale concentratie voor Tl + assay ontwikkeling ...

Werkwijzen voor het ontwikkelen en valideren van een kwantitatieve fluorescentie assay voor het meten van de activiteit van de actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanalen voor high-throughput screening verbinding gepresenteerd.

High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen

Specifieke leden van de familie van inwaartse gelijkrichter-kaliumkanalen (Kir) worden verondersteld drugtargets te zijn voor een verscheidenheid aan aandoeningen, waaronder hypertensie, ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontdekken van nieuwe verbindingen die de activiteit van inward-rectifier kaliumkanalen moduleren. Dit wordt bereikt door eerst tetracycline-induceerbare HK 2 9 3-cellen, die een KIR-kanaal van belang tot expressie brengen, uit te platen in een 384-wellplaat. De tweede stap bestaat uit het laden van de cellen met een fluorescente thallium-reporterkleurstof genaamd flu in two.Vervolgens wordt de niet-geïncorporeerde kleurstof uit de cellen gewassen en vervangen door assaybuffer die een vehikelcontrole of testverbindingen bevat. De laatste stap is de toevoeging van een stimulusbuffer aan de putjes om de thalliumflux te initiëren. Ten slotte wordt een fluorescentieplaatlezer gebruikt om de verbindingen te identificeren die de beweging van thalliumionen door het KIR-kanaal veranderen.Slecht.Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande technieken, zoals handmatige patchclamp-elektrofysiologie, is dat het de onderzoeker in staat stelt om honderden experimenten gelijktijdig en duizenden experimenten per dag uit te voeren. Deze methode stelt de onderzoeker in staat om bibliotheken van duizenden kleine moleculen te screene

high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een real-time screening procedure voor het identificeren van geneesmiddelen die een interactie met G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter...

Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen

Optische biosensor technieken kunnen detecteren veranderingen in de massa in de buurt van het plasmamembraan van levende cellen en laten ons toe om cellulaire reacties in zowel individuele cellen en populaties van cellen te volgen. Dit protocol detectie van de modulatie van kaliumkanalen door G-proteïne gekoppelde receptoren in intacte cellen die deze benadering beschreven.

Gebruik van Label-free Optische biosensoren om Modulatie van kaliumkanalen Detect door G-proteïne gekoppelde receptoren

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

De interactie tussen HCN kanalen en hun ondersteunende subunit is geïdentificeerd als een therapeutisch doel in depressieve stoornis. Hier wordt een fluorescentie-polarisatie- methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van dit eiwit-eiwit interactie, gepresenteerd.

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Hier presenteren we een kwantitatief en schaalbaar protocol voor het uitvoeren van gerichte kleine molecuulschermen voor kinase-regulatoren van de naïeve-primed pluripotente transitie.

Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening

A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

Dit protocol beschrijft een methode voor de studie van elektrogene membraaneiwitten door het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Deze test biedt een platform voor de functionele uitlezing van meerdere ionkanalen endogeen uitgedrukt in epitheelcellijnen.

Een op fluorescentie gebaseerde test van membraanpotentiaal voor functionele studie met hoge doorvoer van twee endogene ionkanalen in twee epitheelcellijnen

Het huidige protocol benadrukt de toepassing van western blotting-techniek om de functies en activiteiten van neuronale K-Cl co-transporter KCC2 te bestuderen. Het protocol beschrijft het onderzoek naar KCC2-fosforylering op kinaseregelplaatsen Thr906/1007 via western blotting. Ook aanvullende methoden om KCC2-activiteit te bevestigen worden kort gemarkeerd in deze tekst.

Studie van de functies en activiteiten van Neuronale K-Cl Co-Transporter KCC2 met behulp van Western Blotting

Dit protocol beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde, high-throughput screeningsmethode om geneesmiddelen met kleine moleculen te identificeren die de activering van β2-integrine op menselijke neutrofielen remmen.

Een op flowcytometrie gebaseerde high-throughput techniek voor het screenen van integrineremmende geneesmiddelen

De farmacologische targeting van ionkanalen is een veelbelovende benadering voor de behandeling van solide tumoren. Gedetailleerde protocollen worden verstrekt voor het karakteriseren van ionkanaalfunctie in kankercellen en het testen van de effecten van ionkanaalmodulatoren op de levensvatbaarheid van kanker.

Screening van ionkanalen in kankercellen

Ontdek hoe je een kwantitatieve fluorescentie-assay ontwikkelt om de activiteit van inward rectifier kaliumkanalen (Kir) te meten via high-throughput screening. Deze methode identificeert nieuwe modulatoren.

High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen

Meer video's verkennen