High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen
January 27th, 2013
Werkwijzen voor het ontwikkelen en valideren van een kwantitatieve fluorescentie assay voor het meten van de activiteit van de actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanalen voor high-throughput screening verbinding gepresenteerd.
Het algemene doel van deze procedure is het ontdekken van nieuwe verbindingen die de activiteit van inwaarts rectificerende kaliumkanalen moduleren. Dit wordt bereikt door eerst tetracycline-induceerbare, HK 2 9 3 cellen, die een KIR-kanaal van belang tot expressie brengen, in een 384-wellplaat te plateren. De tweede stap is om de cellen te laden met een fluorescerende thalliumreporterkleurstof genaamd flu in twee.
Vervolgens wordt de niet-geïncorporeerde kleurstof van de cellen gewassen en vervangen door een assaybuffer met een voertuigccontrole of testverbindingen. De laatste stap is het toevoegen van een stimulusbuffer aan de wells om thalliumflux te initiëren. Uiteindelijk wordt een fluorescentieplatelezer gebruikt om de verbindingen te identificeren die de beweging van thalliumionen door het KIR-kanaal veranderen. Slecht.
Het belangrijkste voordeel van deze methode boven bestaande technieken zoals manuele patch-clamp elektrofysiologie is dat het de onderzoeker in staat stelt om honderden experimenten tegelijkertijd en duizenden experimenten dagelijks uit te voeren. Deze methode stelt de onderzoeker in staat om bibliotheken van duizenden kleine moleculen te screenen om modulatoren van inwaarts rectificerende kaliumkanalen te ontdekken. Een dag voor het thalliumfluxexperiment worden de cellen gedissocieerd en wordt de dichtheid van de celsuspensie gekwantificeerd zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Vervolgens wordt het BH-medium met 10% gedialyseerd FBS gebruikt om 20.000 monoklonale cellen, stabiel getransfecteerd met een KIR-kanaalgen van belang, in elke well van een BD pure coat Amin-gecoate 384-wellplaat te plateren met behulp van een thermo multi drop combi of een multikanaals pipettor. De volgende dag worden de plaatjes onder een microscoop geïnspecteerd om ervoor te zorgen dat de cellen adherant zijn en gelijkmatig over de bodem van de wells zijn verdeeld.
Gebruik vervolgens een ELX 4 0 5 microplate washer om het celcultuurmedium te vervangen door HBSS-assay. Buffer op 20 microliter per well. Bereid daarna de flus in 2:00 AM D-ladingsoplossing voor door de buis kort te centrifugeren om 50 microgram flus in twee poeder op te lossen in 100 microliter anhydrisch DMSO.
Voeg nu 50 microliter van een 20%gewicht per volume onische F1 27 DMSO-oplossing toe aan de kleurstof. Meng ze voorzichtig door te pipetten. Voeg vervolgens 150 microliter flus in 2:00 AM onische F1 27 toe aan 35 milliliter HBSS-assaybuffer en meng voorzichtig.
Voeg vervolgens 20 microliter kleurstof-ladingsbuffer toe aan elke well die al 20 microliter HBSS-assay.Buffer bevat. Incubeer de cellen op kamertemperatuur gedurende ongeveer een uur terwijl de cellen met kleurstof worden geladen. Bereid een thalliumstimulusplaat voor door 0,5 gram natriumbicarbonaat vers op te lossen in 50 milliliter vijfvoudig thalliumstimulusbuffer.
Voeg vervolgens 50 microliter van de oplossing toe aan elke well van een polypropyleen 384-wellplaat. Na de cellen geladen te hebben met flus in 2:00 AM.Was de plaat met een ELX 4 0 5 microplate washer. Voeg vervolgens 20 microliter of 40 microliter HBSS-assay. Buffer terug toe aan elke well en de plaat is nu klaar voor de experimenten.
Laad de thallium- en celplaten in een Hema Matsu functioneel drug screening systeem of gelijkwaardig kinetisch beeldplatelezer met geïntegreerde vloeistofvortelopslagmogelijkheden en gebruik geschikte filters voor fluorescerine-gebaseerde kleurstoffen zoals flu oh vier. Stel vervolgens een eenvoudig toevoegprotocol in om 10 microliter van vijf X Thallium-serie toe te voegen aan de corresponderende wells van de celplaat die 40 microliter HBSS-assaybuffer bevat. Neem vervolgens de baselinefluorescentie op met een frequentie van één hertz gedurende minimaal 10 seconden.
De fluorescentie van well tot well zou uniform en stabiel moeten zijn over de plaat zodra optimale celplatering, wassen en d-ladingsomstandigheden zijn vastgesteld. Gebruik intussen de geïntegreerde 384-kanaals pipettor om het thalliumstimulusbuffer tegelijkertijd aan elke well toe te voegen en de opname gedurende minimaal twee minuten voort te zetten, zodat de snelheid en piek van de thallium-geïnduceerde toename van fluorescentie worden vastgelegd voor offline analyse. In de volgende reeks experimenten evalueert u de uniformiteit en reproduceerbaarheid van de assay door een controleremmer in elke tweede well van elke kolom en rij van een 384-wellplaat te plateren en DMSO toe te voegen aan de andere wells als voertuigccontrole.
Gebruik een multikanaals pipettor. Maak een DMSO-verbindingsplaat door een remmer van het doelwit KIR-kanaal te pipetten met de eerder bepaalde concentratie van 80 microliter per well en 0,1%DMSO-voertuig in een 384-well polypropyleenplaat. Dit gebeurt door een bekende remmer te beginnen in well A één en afwisselend naar well B twee en zo verder tot well B 24.
Herhaal deze procedure met DMSO beginnend in well, B één en zo verder tot well A 24. Laad vervolgens de cel-, verbindings- en thalliumstimulusplaten in de platelezer. Stel vervolgens een tweede toevoegprotocol in om 20 microliter van de twee X-concentratieserie van de verbinding toe te voegen aan de corresponderende wells van de celplaat die 20 microliter HBSS-assaybuffer bevat.
Voeg de verbindingen toe aan de celplaat en incubeer ze maximaal 20 minuten op kamertemperatuur. Neem de baseline flus in twee fluorescentie gedurende minimaal 10 seconden op. Voeg vervolgens 10 microliter van vijf x thalliumbuffer toe aan elke well van de celplaat.
Herhaal het experiment op drie opeenvolgende dagen om de reproduceerbaarheid van de resultaten vast te stellen. Gebruik thalliumflux in DMSO en met geneesmiddelen behandelde cellen om een waarde voor Z prime te berekenen. Een statistische maatstaf voor de variatie van well tot well tussen de twee populaties van wells. Bereken Z prime met behulp van deze formule op basis van de gemiddelden en standaarddeviaties van P en N, waarbij P de ongeremde fluxwaarde is en N de volledig geremde fluxwaarde is.
Een assay met ZPrime-waarden groter
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert methoden voor het ontwikkelen en valideren van een kwantitatief fluorescentie-assay om de activiteit van inwaarts rectifierende kalium (Kir) kanalen te meten. De procedure is bedoeld om nieuwe verbindingen te ontdekken die Kir-kanaalactiviteit moduleren door middel van high-throughput screening.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Farmacologie
Achtergrond
- Inwaarts rectifierende kaliumkanalen (Kir) spelen een cruciale rol in de exciteerbaarheid van cellen.
- Inzicht in Kir-kanaalmodulatie kan leiden tot nieuwe therapeutische strategieën.
- Fluorescentie-assays bieden een high-throughput methode voor het screenen van verbindingen.
- Thalliumflux is een betrouwbare indicator van Kir-kanaalactiviteit.
Doel van het onderzoek
- Om een kwantitatief assay voor Kir-kanaalactiviteit te ontwikkelen.
- Om high-throughput screening van potentiële modulatoren te vergemakkelijken.
- Om verbindingen te identificeren die de beweging van thalliumionen door Kir-kanalen veranderen.
Gebruikte methoden
- Het plateren van tetracycline-induceerbare HK293-cellen die het Kir-kanaal tot expressie brengen in een 384-well plate.
- Het laden van cellen met een fluorescente thallium reporterkleurstof.
- Het wassen van niet-geïncorporeerd kleurstof en het vervangen door assaybuffer met controles of testverbindingen.
- Het toevoegen van een stimulusbuffer om thalliumflux te initiëren en het meten van fluorescentie met een plate reader.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van verbindingen die de beweging van thalliumionen significant veranderen.
- Validatie van de effectiviteit van de assay voor high-throughput screening.
- Demonstratie van de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de assay.
- Mogelijkheid voor het ontdekken van nieuwe Kir-kanaalmodulatoren.
Conclusies
- De ontwikkelde assay is een waardevol hulpmiddel voor het screenen van Kir-kanaalmodulatoren.
- Het kan helpen bij de ontdekking van nieuwe therapeutische verbindingen.
- Toekomstige studies kunnen de geïdentificeerde verbindingen verder valideren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Developing robust assays for ion channel targets remains a bottleneck in early drug discovery, particularly for inward rectifier potassium channels where pharmacological tools are limited. This fluorescence-based thallium flux assay enables scalable, quantitative screening of small-molecule libraries to identify modulators with therapeutic potential. By supporting hit identification and lead optimization workflows, the method addresses a critical gap in target validation for cardiovascular, neurological, and pain indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Kir channel function through dose-dependent fluorescence readouts that correlate with ion flux activity.
- Operational Value: Supports screening of thousands of compounds daily, accelerating target hypothesis testing compared to low-throughput electrophysiology.
- Predictive Value: Generates quantitative data suitable for Z-prime calculation, ensuring assay reliability for go/no-go decisions in probe discovery campaigns.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses commercially available FluoZin-2 dye to detect transmembrane thallium flux, providing a standardized fluorescence signal for compound screening.
- Reproducibility: Requires consistent Z-prime values ≥0.5 across multiple days, establishing robustness for industrial-scale screening centers.
- Scalability: Compatible with 384-well plate formats and automated liquid handling, enabling integration into high-throughput screening pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Target Relevance: Directly supports investigation of Kir channels implicated in hypertension, atrial fibrillation, and pain, aligning with disease-modulating hypotheses.
- Lead Identification: Facilitates discovery of small-molecule modulators that can be optimized for selectivity and drug-like properties.
- Mechanistic De-risking: Provides functional validation of compound effects on channel activity, reducing ambiguity in downstream preclinical profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling progression from primary screening to hit confirmation and structure-activity relationship studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of compound libraries to identify activators or inhibitors of Kir channel function.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible fluorescence readouts suitable for primary hit selection in 384-well formats.
- Analytics: Enables calculation of EC80 values and inhibition curves from concentration-response data, supporting potency and efficacy comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing validated chemical probes for target engagement studies in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to most potassium channel targets due to thallium permeability, promoting cross-project assay standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct functional readouts of channel modulation, improving target confidence.
- Operational Value: Standardizes assay execution across teams through defined protocols for cell loading, compound treatment, and flux measurement.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling rapid evaluation of large compound libraries, reducing reliance on low-throughput methods.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of Kir-targeted programs through reliable hit confirmation and reproducibility metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescent dye handling, and kinetic plate reader operation for accurate flux measurements.
- Dependent on access to fluorescence plate readers with injectors and appropriate filter sets for FluoZin-2 or analogous dyes.
- Necessitates standardization of cell plating density, washing steps, and dye loading times to ensure well-to-well uniformity.
- Involves safety considerations due to thallium toxicity, requiring proper PPE, waste disposal, and containment procedures.
- Assay performance must be validated using known inhibitors to establish inhibition curves and Z-prime thresholds before large-scale screening.
