High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen
27 januari 2013
Werkwijzen voor het ontwikkelen en valideren van een kwantitatieve fluorescentie assay voor het meten van de activiteit van de actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanalen voor high-throughput screening verbinding gepresenteerd.
Het algemene doel van deze procedure is het ontdekken van nieuwe verbindingen die de activiteit van inwaarts rectificerende kaliumkanalen moduleren. Dit wordt bereikt door eerst tetracycline-induceerbare, HK 2 9 3 cellen, die een KIR-kanaal van belang tot expressie brengen, in een 384-wellplaat te plateren. De tweede stap is om de cellen te laden met een fluorescerende thalliumreporterkleurstof genaamd flu in twee.
Vervolgens wordt de niet-geïncorporeerde kleurstof van de cellen gewassen en vervangen door een assaybuffer met een voertuigccontrole of testverbindingen. De laatste stap is het toevoegen van een stimulusbuffer aan de wells om thalliumflux te initiëren. Uiteindelijk wordt een fluorescentieplatelezer gebruikt om de verbindingen te identificeren die de beweging van thalliumionen door het KIR-kanaal veranderen. Slecht.
Het belangrijkste voordeel van deze methode boven bestaande technieken zoals manuele patch-clamp elektrofysiologie is dat het de onderzoeker in staat stelt om honderden experimenten tegelijkertijd en duizenden experimenten dagelijks uit te voeren. Deze methode stelt de onderzoeker in staat om bibliotheken van duizenden kleine moleculen te screenen om modulatoren van inwaarts rectificerende kaliumkanalen te ontdekken. Een dag voor het thalliumfluxexperiment worden de cellen gedissocieerd en wordt de dichtheid van de celsuspensie gekwantificeerd zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Vervolgens wordt het BH-medium met 10% gedialyseerd FBS gebruikt om 20.000 monoklonale cellen, stabiel getransfecteerd met een KIR-kanaalgen van belang, in elke well van een BD pure coat Amin-gecoate 384-wellplaat te plateren met behulp van een thermo multi drop combi of een multikanaals pipettor. De volgende dag worden de plaatjes onder een microscoop geïnspecteerd om ervoor te zorgen dat de cellen adherant zijn en gelijkmatig over de bodem van de wells zijn verdeeld.
Gebruik vervolgens een ELX 4 0 5 microplate washer om het celcultuurmedium te vervangen door HBSS-assay. Buffer op 20 microliter per well. Bereid daarna de flus in 2:00 AM D-ladingsoplossing voor door de buis kort te centrifugeren om 50 microgram flus in twee poeder op te lossen in 100 microliter anhydrisch DMSO.
Voeg nu 50 microliter van een 20%gewicht per volume onische F1 27 DMSO-oplossing toe aan de kleurstof. Meng ze voorzichtig door te pipetten. Voeg vervolgens 150 microliter flus in 2:00 AM onische F1 27 toe aan 35 milliliter HBSS-assaybuffer en meng voorzichtig.
Voeg vervolgens 20 microliter kleurstof-ladingsbuffer toe aan elke well die al 20 microliter HBSS-assay.Buffer bevat. Incubeer de cellen op kamertemperatuur gedurende ongeveer een uur terwijl de cellen met kleurstof worden geladen. Bereid een thalliumstimulusplaat voor door 0,5 gram natriumbicarbonaat vers op te lossen in 50 milliliter vijfvoudig thalliumstimulusbuffer.
Voeg vervolgens 50 microliter van de oplossing toe aan elke well van een polypropyleen 384-wellplaat. Na de cellen geladen te hebben met flus in 2:00 AM.Was de plaat met een ELX 4 0 5 microplate washer. Voeg vervolgens 20 microliter of 40 microliter HBSS-assay. Buffer terug toe aan elke well en de plaat is nu klaar voor de experimenten.
Laad de thallium- en celplaten in een Hema Matsu functioneel drug screening systeem of gelijkwaardig kinetisch beeldplatelezer met geïntegreerde vloeistofvortelopslagmogelijkheden en gebruik geschikte filters voor fluorescerine-gebaseerde kleurstoffen zoals flu oh vier. Stel vervolgens een eenvoudig toevoegprotocol in om 10 microliter van vijf X Thallium-serie toe te voegen aan de corresponderende wells van de celplaat die 40 microliter HBSS-assaybuffer bevat. Neem vervolgens de baselinefluorescentie op met een frequentie van één hertz gedurende minimaal 10 seconden.
De fluorescentie van well tot well zou uniform en stabiel moeten zijn over de plaat zodra optimale celplatering, wassen en d-ladingsomstandigheden zijn vastgesteld. Gebruik intussen de geïntegreerde 384-kanaals pipettor om het thalliumstimulusbuffer tegelijkertijd aan elke well toe te voegen en de opname gedurende minimaal twee minuten voort te zetten, zodat de snelheid en piek van de thallium-geïnduceerde toename van fluorescentie worden vastgelegd voor offline analyse. In de volgende reeks experimenten evalueert u de uniformiteit en reproduceerbaarheid van de assay door een controleremmer in elke tweede well van elke kolom en rij van een 384-wellplaat te plateren en DMSO toe te voegen aan de andere wells als voertuigccontrole.
Gebruik een multikanaals pipettor. Maak een DMSO-verbindingsplaat door een remmer van het doelwit KIR-kanaal te pipetten met de eerder bepaalde concentratie van 80 microliter per well en 0,1%DMSO-voertuig in een 384-well polypropyleenplaat. Dit gebeurt door een bekende remmer te beginnen in well A één en afwisselend naar well B twee en zo verder tot well B 24.
Herhaal deze procedure met DMSO beginnend in well, B één en zo verder tot well A 24. Laad vervolgens de cel-, verbindings- en thalliumstimulusplaten in de platelezer. Stel vervolgens een tweede toevoegprotocol in om 20 microliter van de twee X-concentratieserie van de verbinding toe te voegen aan de corresponderende wells van de celplaat die 20 microliter HBSS-assaybuffer bevat.
Voeg de verbindingen toe aan de celplaat en incubeer ze maximaal 20 minuten op kamertemperatuur. Neem de baseline flus in twee fluorescentie gedurende minimaal 10 seconden op. Voeg vervolgens 10 microliter van vijf x thalliumbuffer toe aan elke well van de celplaat.
Herhaal het experiment op drie opeenvolgende dagen om de reproduceerbaarheid van de resultaten vast te stellen. Gebruik thalliumflux in DMSO en met geneesmiddelen behandelde cellen om een waarde voor Z prime te berekenen. Een statistische maatstaf voor de variatie van well tot well tussen de twee populaties van wells. Bereken Z prime met behulp van deze formule op basis van de gemiddelden en standaarddeviaties van P en N, waarbij P de ongeremde fluxwaarde is en N de volledig geremde fluxwaarde is.
Een assay met ZPrime-waarden groter
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert methoden voor het ontwikkelen en valideren van een kwantitatieve fluorescentie-assay om de activiteit van inward rectifier kaliumkanalen (Kir-kanalen) te meten. De procedure is erop gericht nieuwe verbindingen te ontdekken die de Kir-kanaalactiviteit moduleren via high-throughput screening.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Farmacologie
Achtergrond
- Inwaarts gelijkrichtende kaliumkanalen (Kir) spelen een cruciale rol bij de cellulaire exciteerbaarheid.
- Inzicht in de modulatie van Kir-kanalen kan leiden tot nieuwe therapeutische strategieën.
- Fluorescentie-assays bieden een high-throughput methode voor het screenen van verbindingen.
- Thalliumflux is een betrouwbare indicator voor Kir-kanaalactiviteit.
Doel van de studie
- Om een kwantitatieve assay te ontwikkelen voor Kir-kanaalactiviteit.
- Om high-throughput screening van potentiële modulatoren te faciliteren.
- Om verbindingen te identificeren die de beweging van thalliumionen door Kir-kanalen beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Het uitplaten van tetracycline-induceerbare HK293-cellen die het Kir-kanaal tot expressie brengen in een 384-wellplaat.
- Het laden van cellen met een fluorescente thallium-reporterkleurstof.
- Het uitwassen van niet-geïncorporeerde kleurstof en het vervangen hiervan door assaybuffer met controles of testverbindingen.
- Het toevoegen van een stimulusbuffer om de thalliumflux te initiëren en het meten van de fluorescentie met een plaatlezer.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van verbindingen die de beweging van thalliumionen significant beïnvloeden.
- Validatie van de effectiviteit van de assay voor high-throughput screening.
- Demonstratie van de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de assay.
- Potentieel voor het ontdekken van nieuwe Kir-kanaalmodulatoren.
Conclusies
- De ontwikkelde assay is een waardevol instrument voor het screenen van Kir-kanaalmodulatoren.
- Het kan helpen bij de ontdekking van nieuwe therapeutische verbindingen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op de geïdentificeerde verbindingen voor verdere validatie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het ontwikkelen van robuuste assays voor ionkanaal-targets blijft een knelpunt in de vroege fase van medicijnontwikkeling, in het bijzonder voor inward rectifier kaliumkanalen waar farmacologische hulpmiddelen beperkt zijn. Deze fluorescentie-gebaseerde thalliumflux-assay maakt schaalbare, kwantitatieve screening van bibliotheken met kleine moleculen mogelijk om modulatoren met therapeutisch potentieel te identificeren. Door workflows voor hit-identificatie en lead-optimalisatie te ondersteunen, vult deze methode een kritisch gat in de target-validatie voor cardiovasculaire, neurologische en pijnindicaties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de functie van Kir-kanalen mogelijk via dosisafhankelijke fluorescentie-metingen die correleren met de ionenstroomactiviteit.
- Operationele waarde: Ondersteunt de dagelijkse screening van duizenden verbindingen, waardoor het testen van target-hypothesen wordt versneld in vergelijking met elektrofysiologie met een lage doorvoercapaciteit.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve gegevens die geschikt zijn voor Z-prime-berekeningen, wat de betrouwbaarheid van de assay waarborgt voor go/no-go-beslissingen in campagnes voor de ontdekking van probes.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Maakt gebruik van commercieel beschikbare FluoZin-2 kleurstof om transmembraan thalliumflux te detecteren, wat een gestandaardiseerd fluorescentiesignaal biedt voor compound-screening.
- Reproduceerbaarheid: Vereist consistente Z-prime waarden ≥0,5 over meerdere dagen, wat de robuustheid vaststelt voor screeningscentra op industriële schaal.
- Schaalbaarheid: Compatibel met 384-well plaatformaten en geautomatiseerde vloeistofbehandeling, waardoor integratie in high-throughput screening-pipelines mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie van het doelwit: Ondersteunt direct het onderzoek naar Kir-kanalen die betrokken zijn bij hypertensie, atriumfibrilleren en pijn, in overeenstemming met ziekte-modulerende hypothesen.
- Identificatie van leadverbindingen: Faciliteert de ontdekking van kleine moleculaire modulatoren die geoptimaliseerd kunnen worden voor selectiviteit en geneesmiddelachtige eigenschappen.
- Mechanische risicoreductie: Biedt functionele validatie van de effecten van verbindingen op de kanaalactiviteit, waardoor onduidelijkheden in de daaropvolgende preklinische profilering worden verminderd.
Integratie van pipeline en workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-identificatie, waardoor progressie mogelijk is van primaire screening naar hit-bevestiging en structure-activity relationship-studies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesegestuurde screening van verbindingenbibliotheken om activatoren of inhibitoren van de Kir-kanaalfunctie te identificeren.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare fluorescentie-uitlezingen die geschikt zijn voor primaire hit-selectie in 384-well formaten.
- Analytics: Maakt de berekening van EC80-waarden en inhibitiecurven mogelijk op basis van concentratie-responstgegevens, wat vergelijkingen van potentie en effectiviteit ondersteunt.
- Translational Research: Sluit aan op preklinisch werk door gevalideerde chemische probes te leveren voor target engagement-studies in ziekterelateerde modellen.
- Enterprise Reuse: Aanpasbaar aan de meeste kaliumkanaal-targets vanwege de thallium-permeabiliteit, wat standaardisatie van assays over verschillende projecten heen bevordert.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door directe functionele uitlezingen van kanaalmodulatie te bieden, waardoor het vertrouwen in het target wordt vergroot.
- Operationele waarde: Standaardiseert de uitvoering van assays tussen teams door middel van gedefinieerde protocollen voor celbelading, behandeling met verbindingen en fluxmeting.
- Strategische waarde: Verhoogt de kapitaalefficiëntie door een snelle evaluatie van grote bibliotheken met verbindingen mogelijk te maken, waardoor de afhankelijkheid van methoden met een lage doorvoer wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering van Kir-gerichte programma's via betrouwbare hit-bevestiging en reproduceerbaarheidsmetrieken.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, het hanteren van fluorescente kleurstoffen en het bedienen van een kinetische plaatlezer voor nauwkeurige fluxmetingen.
- Afhankelijk van toegang tot fluorescentieplaatlezers met injectoren en geschikte filtersets voor FluoZin-2 of analoge kleurstoffen.
- Vereist standaardisatie van de celplaatdichtheid, wasstappen en tijdstippen voor het laden van de kleurstof om uniformiteit tussen de putjes te waarborgen.
- Omvat veiligheidsoverwegingen vanwege de toxiciteit van thallium, waarbij geschikte PBM, afvalverwerking en insluitingsprocedures vereist zijn.
- De prestaties van de assay moeten worden gevalideerd met behulp van bekende remmers om inhibitiecurves en Z-prime drempelwaarden vast te stellen vóór grootschalige screening.
