Human Neuro-endocriene tumor cellijnen als een drie-dimensionaal model voor de studie van de mens Neuro-endocriene Tumor Therapy

Het algemene doel van het volgende experiment is om een eenvoudige en makkelijke methode te ontwikkelen voor het produceren van uniforme, driedimensionale neuroendocriene tumor-sferoïden, en een eenvoudige methode om de HistoGel-inbedding te verwerken voor het bestuderen van de histologie van deze sferoïden. Dit wordt bereikt door 24-wells platen gelijkmatig te coaten met aeros, waarop menselijke neuroendocriene tumorcellen in een single-cell suspensie worden gezaaid. De plaat wordt vervolgens een nacht geïncubeerd op een orbitale schudder in de incubator bij een snelheid van minder dan 40 RPM, en daarna overgebracht naar een stabiel plank in de incubator.

Sferoïden vormen zich tegen de derde of vierde dag, en hun groei en integriteit worden gemonitord via fasecontrastmicroscopie om hun histologie te bestuderen. De 3D-sferoïden worden ingebed in opgewarmde HistoGel voorafgaand aan de routinematige paraffineverwerking; de resultaten tonen de groei van neuroendocriene tumor 3D-sferoïden op basis van beelden verkregen tijdens fasecontrastmicroscopie. De histologie van de 3D-sferoïden wordt geanalyseerd middels H&E- en immunohistochemische kleuring van paraffinebloksecties van de 3D-sferoïden.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de bestaande methode is dat deze eenvoudig, toegankelijk, betrouwbaar en kosteneffectief is. Deze methode kan het onderzoek in het veld van geneesmiddelenontwikkeling faciliteren door te helpen bij het snel identificeren van therapeutische geneesmiddelen voor patiënten met neuroendocriene tumoren. In het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode er in het begin moeite mee hebben om 3D-steroïden met een uniforme vorm en grootte te kweken.

De sleutel tot succes is om ervoor te zorgen dat uw 24-wells platen gelijkmatig zijn gecoat met agaroze en dat uw enkelcel-suspensies goed gedispergeerd en accuraat zijn. Om de histologie van de 3D-steroïden te begrijpen, moeten we parenverwerking en immunochemische kleuring uitvoeren. Histologische inbedding van de 3D-steroïden is de cruciale stap die later vandaag zal worden gedemonstreerd. Om 1% agaroze voor het coaten van 24-wells platen te bereiden, voegt u één gram agaroze toe aan 100 milliliter gedeïoniseerd water in een fles van 250 tot 500 milliliter en autoclaveert u deze om de agaroze na sterilisatie te steriliseren.

Plaats de fles gedurende ongeveer een uur in een waterbad van 70 °C. De aeros moet te allen tijde steriel worden gehouden totdat deze is afgekoeld tot 70 °C. Gebruik in een veiligheidskabinet een repeaterpipet om 200 µL aeros in elke put van de 24-well plaat te dispenseren.

Gebruik vlakbodemplaten voor dit protocol. Elk type 24-wells vlakbodemplaat is geschikt, mits de platen onder een fasecontrastmicroscoop kunnen worden afgebeeld. Draai de agarose in de well rond om deze gelijkmatig over de bodem te verspreiden. 200 µL agarose is optimaal voor het vormen van een concaaf oppervlak, zodat de sferoïden consistente bolvormige structuren vormen.

Na ongeveer 10 minuten zijn de met aeros gecoate 24-wellplaten klaar voor gebruik. De Bon-1 cellen die in dit experiment worden gebruikt, zijn menselijke pancreatische neuroendocriene tumor- of NET-cellen, gekweekt in D-M-E-M-F 12 medium met 10% FBS in een steriele weefkweekschaal in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Wanneer de Bon-1 cellen in monolaag een confluentie van 70 tot 80% bereiken, worden er in een veiligheidskabinet enkelcel-suspensies bereid.

Verwijder het medium en was de cellen twee keer met PBS. Los de cellen uit de kweekschaal door één milliliter trypsine toe te voegen en vijf minuten te incuberen bij 37 °C. Controleer onder de microscoop of alle cellen los zijn van de schaal en voeg vervolgens negen milliliter groeimedium toe aan de trypsine.

Pipetteer de oogcellen een paar keer op en neer om een homogene enkelcel-suspensie te verkrijgen. Gebruik een celzeef van 70 micron om de cellen te filteren. Verzamel de gefilterde cellen en bereid, na het uitvoeren van een celtelling, een suspensie van 5.000 cellen per milliliter in D-M-E-M-F 12 met 10% FBS groeimedium.

Het aantal te zaaien cellen moet empirisch worden bepaald op basis van de grootte van de sferoïden op dag zes. Idealiter streeft u naar een sferoïdegrootte met een diameter tussen 300 en 400 µm. Om deze reden zaaien we duizend cellen per 200 µL per putje.

Om deze procedure te starten, wordt 200 µL van de enkelcel-suspensie over elke aeros-gecoate put van de eerder voorbereide 24-wells platen aangebracht; sluit de 24-wells platen af met steriele sealingtape om verdamping te voorkomen. Plaats de aeros-gecoate 24-wells platen met BON-1 cellen op een orbitale schudder bij een zeer trage agitatie in een bevochtigde incubator van 37 °C met 5% koolstofdioxide in de lucht en incubeer deze gedurende de nacht. Verplaats de platen de volgende ochtend naar een stabiel platform en laat de culturen verder groeien in de incubator. Herhaal dit elke drie dagen.

Voeg 200 µL groeimedium toe aan elke well van de platen. Om de organoïden niet te verstoren, raakt u met de pipetpunt de wand van de well aan en laat u het medium langs de wand in de well stromen. Controleer de vorming van organoïden in de 24-wellplaten onder een microscoop. De behandeling van de 3D-organoïden met geneesmiddelen wordt gestart op dag zes van de kweek.

Wanneer de sferoïden een diameter van ongeveer 300 tot 400 micron hebben, wordt dit aangemerkt als dag nul voor de drugbehandeling op dag zes. Elke put van de platen bevat ongeveer 400 microliter medium om te garanderen dat de drugbehandelingen in elke put een uiteindelijke concentratie van 1x hebben. Maak voor elke behandelingsdosis drie keer de gewenste concentratie; verdun de passende hoeveelheid drugstock in 5 milliliter groeimedium in een conische buis van 15 milliliter, wat voldoende is voor acht replica's. De PHE in elke rij van de 24-wells platen worden gekenmerkt als vehicle dose 1, 2, 3, 4 en 5. Er zijn vier replica's voor elke behandelingsdosis op elke 24-wells plaat.

Gewoonlijk worden 3D phe behandeld in ten minste 2 platen met 24 putjes, wat resulteert in ten minste acht herhalingen voor elke behandelingsdosis. Voordat de behandeling aan elk putje wordt toegevoegd, worden de platen met 24 putjes gecentrifugeerd om ervoor te zorgen dat alle condensatie op de plafondtape in het putje terechtkomt, vanwege de drijvende eigenschap van het 3D-steroïd. Het medium in elk putje wordt na centrifugatie niet verwijderd.

Om verstoring van de sferoïden te voorkomen, wordt 200 µL van elke behandelingsdosis voorzichtig langs de wand van de betreffende putjes toegevoegd. Seal de 24-wells platen met sealing tape en incubeer de culturen in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% koolstofdioxide in de lucht. Monitor de 3D-steroïdculturen na de medicamenteuze behandeling op elk gekozen tijdstip met een fasecontrastmicroscoop.

Een 5x objectief is ideaal omdat de PHE bij een 10x objectief het beeldveld snel overschrijden. Leg beelden vast van de steroïde in elke put op elk tijdstip voorafgaand aan HistoGel. De ingebedde netto 3D-steroïden worden verzameld uit de 24-wells platen en gefixeerd in 10% Formine.

Plaats een buis met koude HistoGel in een bekerglas gevuld met water. Verhit het bekerglas in een magnetron gedurende één minuut of totdat de gel volledig is vloeibaar gemaakt. Houd de buis gedurende de rest van de procedure in hetzelfde met water gevulde bekerglas.

Gebruik een wegwerpplasticpipet. Breng alle steroïde over naar een biopsievriesmal. Laat de steroïde een minuut rusten zodat deze naar de bodem van de biopsievriesmal zakt.

Verwijder de vloeistof in de biopsie-cryovorm met Kim wipes. Duw het steroïd zeer voorzichtig met een tandenstoker naar het midden van de bodem van de biopsie-cryovorm. Gebruik vervolgens de Pasteur-pipet om het steroïd zeer voorzichtig in het midden van de biopsie-cryovorm te houden.

Voeg een dunne laag opgewarmde HistoGel toe aan de cryovorm voor biopsieën. Voeg niet te veel HistoGel toe. Voeg slechts voldoende toe om de steroïden in het centrum te stabiliseren.

Laat het steroïde in de HistoGel één tot twee minuten op kamertemperatuur rusten of totdat de HistoGel gestold is. Vul de rest van de biopsie-cryovorm met opgewarmde HistoGel en laat deze ongeveer 10 minuten op kamertemperatuur stollen. Vlak voordat u dit OIDs HistoGel-blok uit de biopsie-cryovorm drukt.

Laat de cryovorm één minuut op ijs rusten en tik vervolgens het intacte steroïde HistoGel-blokje eruit. Wikkel het blokje in een stuk bio-wikkelfolie en plaats het in een weefsel- en biopsiecassette. Bewaar de weefsel- en biopsiecassette in een houder met 70%ethanol.

Vervolgens worden routineprocedures voor weefselverwerking voor paraffine-inbedding uitgevoerd wanneer er is gegroeid op aeros-gecodeerde 24-wellplaten. Verschillende NET-cellijnen vertonen verschillende morfologieën, zoals hier te zien is. De humane pancreatische NET-cellijn BON-1 en de humane long-NET-cellijn H 7 27 vormden 3D-sferoïden.

In tegenstelling hiermee vertonen menselijke pancreatische net-cellen grote, druifachtige poreuze massa's, die niet als sferoïden worden beschouwd. Na het zaaien van de cellen op de agarose-gecoate 24-well plaat vindt de vorming van multicellulaire sferoïden doorgaans plaats op de derde of vierde dag, en de sferoïden worden ronder tegen de zesde dag.

Vanwege de beperking van voedingsstoffen en zuurstof beginnen cellen in de dichte kern van het steroïde rond dag 10 af te sterven en tegen dag 17 beginnen de steroïden te desintegreren. Vanwege de grote omvang of in sommige gevallen de uitstoting van het necrotische koord, kan het steroïde doorgaans groeien tot een diameter van 1000 microns.

In dit experiment werden 3D-organoïden van dag zes gekozen als startpunt voor de behandeling met de histondeacetylase-remmer trichostatine A of TSA. Er is eerder gerapporteerd dat histondeacetylase-remmers antiproliferatieve en pro-apoptotische effecten hebben op NET-cellen. Deze afbeeldingen volgen de morfologie van de 3D-organoïden aan het begin van de behandeling en na 24, 48, 72 en 96 uur.

V geeft de behandeling met het vehikel aan, wat in dit geval DMSO is. D één tot D vijf vertegenwoordigen de behandeling met toenemende doses TSA. De grootte van de OID van elk individu werd automatisch geschat door een speciaal ontwikkeld MATLAB-computerprogramma.

Per dosis TSA-behandeling werden op elk tijdstip ten minste acht sphs gemeten, en de resultaten zijn in deze grafiek uitgezet ten opzichte van het vehikel. Alle doses TSA vertoonden een bepaalde mate van groeiremming bij 3D OID's. Bij TSA-concentraties van 125 nano molar en 250 nano molar werd de groei van 3D-steroïden sterk onderdrukt om de histologie van de netto 3D-steroïde te begrijpen.

H&E-kleuring en immunohistochemische kleuring werden uitgevoerd op de 3D-steroïde die gedurende 17 dagen was gekweekt. KI 67 is een marker voor prolifererende cellen, terwijl cleaved caspase three een marker is voor apoptotische cellen. De resultaten geven aan dat de cellen van de buitenste laag van de 3D-steroïde actief prolifereren, maar dat de cellen in de kern grotendeels necrotisch of apoptotisch zijn.

Na deze procedure kunnen aanvullende assays, zoals de cell titer glow assay, worden uitgevoerd om de cellevensvatbaarheid van deze 3D-steroïden te bepalen. Na de ontwikkeling kan deze techniek worden uitgebreid naar 96-wellplaten voor het uitvoeren van high-throughput screenings, wat de ontdekking van therapeutische geneesmiddelen in kankeronderzoek zal vergemakkelijken.