Name: piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Leer hoe je primaire humane T-cellen stabiel genetisch wijzigt met het niet-virale piggyBac-transposonsysteem. Deze methode zorgt voor langdurige transgenexpressie en biedt een robuust platform voor T-celtherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SS wordt gedeeltelijk ondersteund door de HHMI Med in Grad Training Grant door de TBMM Program. MHW wordt gedeeltelijk ondersteund door een loopbaanontwikkeling onderscheiding van de Department of Veterans Affairs en de genereuze steun van dr. en mevrouw Harold M. Selzman. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door NIH lymfoom SPORE subsidie ​​P50CA126752 en NIH R01 DK093660.

Day 0 1. Isolatie van PBMC uit humaan bloed <ol><li> Verzamel 20 ml vers menselijk bloed met behulp van venapunctie in Na-Vacutainer buizen. </li><li> Mix bloed en geavanceerde RPMI 1640 in 1:1 (v / v) verhouding. </li><li> Voeg 20 ml lymphoprep medium aan een 50 ml centrifugebuis (25 ° C). Langzaam 25-30 ml bloed RPMI 1640 mix bovenop de Lymphoprep. </li><li> Centrifugeer op 400 xg gedurende 40 min zonder remmen. </li><li> Verzamel zowel verschillende en fuzzy lagen met behulp van een disposable pipet in 10 ml 1x PBS (25 ° C) en breng het volume op 50 ml met 1x PBS. </li><li> Centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Volledig Zuig het supernatant en voeg 20 ml van Advanced RPMI 1640. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het supernatant. Voeg 10 ml compleet T-cel medium aangevuld met 5 ng / ml rhIL-15 voorverwarmd bij 37 ° C. </li><li> Tel het aantal cellen en de plaat in een 24 well weefselkweek vachted plaat bij 2 x 10 6 cellen / putje in compleet T-cel medium aangevuld met 5 ng / ml rhIL-15 steriel water aan omringende putjes. Incubeer overnacht in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> Dag 1 2. Coating platen met anti-CD28 en anti-CD3 antilichaam voor het stimuleren van T-cellen <ol><li> Verdun anti-CD28 en anti-CD3 antilichamen in steriel water bij een concentratie van 1 ug / ml elk. </li><li> Voeg 500 ul elk antilichaam oplossing 5 aangegeven putjes van een niet-beklede weefselkweek plaat met 24 putjes. </li><li> Voeg steriel water om uit te rusten van de putten. Wikkel de plaat in krimpfolie en plaats in een 4 ° C koelkast. </li></ol> 3. Nucleofectie van gestimuleerde T-cellen <ol><li> Voorverwarmen T-cel media bij 37 ° C en supplement met 5 ng / ml rhIL-15. Bereid volledige nucleofector oplossing door toevoeging van 500 pi Nucleofector Supplement 1 2,25 ml van Nucleofector oplossing. </li><li> Eenliquot 5 ug elk van transposon (Zeo-pT-CMV-EGFP) en transposase (pCMV-piggyBac) in een 1,5 ml microfugebuis. Opmerking: Het kan nodig zijn de transposase en transposon DNA bedrag voor optimale genafgifte optimaliseren en te minimaliseren cellulaire toxiciteit. De plasmiden kunnen worden bij de auteurs op verzoek. </li><li> Harvest PBMCs van de 24 wells weefselkweekplaat in een 50 ml buis. Tel het aantal cellen. Bewaar 2 x 10 6 cellen voor gebruik als controle tijdens flowcytometrie. </li><li> Voeg 7-10 x 10 6 cellen om een 15 ml en centrifugeer bij 400 xg, 5 min, aspireren supernatant en vinger trap de pellet. </li><li> Voeg 100 ul van T cel volledige nucleofectie oplossing los cel pellet. </li><li> Voeg de oplossing-celmengsel aan de buis met de plasmiden. </li><li> Voeg de oplossing-cel-plasmide mengsel aan de bodem van de cuvette nucleofectie. Wees voorzichtig en laat geen luchtbellen te introduceren. </li><li> Nucleofect de cellen met behulp program U-014 (gestimuleerde T cellen, humane, <a href="http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/" target="_blank">http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/</a> ). </li><li> Onmiddellijk voeg 500 ul van voorverwarmde media met rhIL-15 naar de cuvette. Breng de cellen aan een putje van een plaat met 24 putjes met 1,5 ml voorverwarmde media rhIL15. </li><li> Incubeer overnacht in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> Dag 2 4. Niet-specifieke stimulatie van T-cellen <ol><li> Oogst cellen en bepalen celaantallen. Vernietiging 0,5 x 10 6 cellen voor flowcytometrie om de frequentie van GFP-positieve cellen te bepalen. Gebruik de niet-getransfecteerde PBMC als controles. </li><li> Zuig het CD3/28 antilichaamoplossing uit de niet weefselkweek gecoate platen en spoel elk putje met T-cel media. </li><li> Resuspendeer de nucleofected cellen bij 0,5 x 10 6 cellen per ml in compleet media CTLaangevuld met 5 ng / ml rhIL-15. Voeg 2,0 ml van de cellen in nucleofected 4 wells van de niet weefselkweekplaat. Voeg 0,5 x 10 6 cellen niet nucleofected de 5e goed. </li><li> Incubeer gedurende 3 dagen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> Dag 5 <ol><li> Oogst de gestimuleerde T-cellen van niet-beklede weefselkweekplaat. </li><li> Tellen en de cellen replate in een 24 wells beklede weefselkweekplaat van 0,7 x 10 6 cellen / ml in T cell media met 5 ng / ml IL-15. </li></ol> Dag 7 7. Analyse van genexpressie <ol><li> Oogst cellen en vlekken met anti-humaan CD8 antilichaam (kon ook anti-CD3 en anti-CD4) en geanalyseerd met flowcytometrie voor GFP expressie%. </li></ol> Dag 8 (Optioneel) 8. Expansie van T-cellen <ol><li> Op dag 8 na transfectie, kunnen T-cellen worden opnieuw uitgeplaat in T-Celmedium met IL-15 bij een dichtheid van 0,7 x 10 6 cellen per putje voor verdere uitbreiding 16. </li></ol>

<ol><li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses%3A+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156(1989).</li>
<li>Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+movement+of+Lepidopteran+transposon+IFP2+in+insect+cells+using+a+baculovirus+genome+as+a+target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA.</a> Virology. 211 (2), 397(1995).</li>
<li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473(2005).</li>
<li>Saridey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+transposon-based+inducible+gene+expression+in+vivo+after+somatic+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.</a> Mol. Ther. 17 (12), 2115(2009).</li>
<li>Nakanishi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon-mediated+long-term+gene+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice.</a> Mol. Ther. 18 (4), 707(2010).</li>
<li>Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+Transposon-mediated+Gene+Transfer+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells.</a> Mol. Ther. 15 (1), 139(2007).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+PiggyBac+transposon+system+for+the+sustained+genetic+modification+of+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes.</a> J. Immunother. 32 (8), 826(2009).</li>
<li>Raja Manuri, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon%2Ftransposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+treatment+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21 (4), 427(2010).</li>
<li>Doherty, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+gene+transfer+in+human+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo.</a> Hum. Gene Ther. , In Press (2011).</li>
<li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531(2011).</li>
<li>Bonini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of T cells.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).</li>
<li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon+and+transposase+system+for+human+application%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18 (4), 1531(2010).</li>
<li>Galvan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+PiggyBac+transposon+integrations+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells.</a> J. Immunother. 32 (8), 837(2009).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac-Mediated+Cancer+Immunotherapy+Using+EBV-Specific+Cytotoxic+T-Cells+Expressing+HER2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2133(2011).</li>
<li>Huye, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+mTor+Inhibitors+With+Rapamycin-resistant+T+Cells%3A+A+Two-pronged+Approach+to+Tumor+Elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2239(2011).</li>
<li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J. Immunother. 33 (3), 305(2010).</li>
<li>Kahlig, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343(2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De hierin beschreven werkwijze worden stabiele transgene modificatie van primaire menselijke T-lymfocyten. We hebben eerder geteste het gebruik van het piggyBac transposon systeem T-cellen wijzigen om een reportergen (meer dan 4 weken), een niet-immunogene suïcidegen een chimeer antigen receptor voor adoptieve immunotherapie (langer dan 100 dagen) te drukken, en om de weerstand ingenieur aan immunosuppressieve geneesmiddelen 7,13-15. Niet-virale modificatie van T cellen voor adoptieve immunotherapie ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Lympholyte </td><td> Cedarlane </td><td> CL5015 </td><td></td></tr><tr><td> Geavanceerde RPMI 1640 </td><td> LifeTechnologies </td><td> 12633020 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum Hyclone </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3008803 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-I Supplement </td><td> LifeTechnologies </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> Humaan IL-15 Recombinant Protein </td><td> eBioscience </td><td> 14 tot 8159 </td><td></td></tr><tr><td> EndoFree Plasmide Maxi Kit </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001S </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Humane T-cel Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD8-APC </td><td> Zuid-Biotech </td><td> 9536-11 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human CD3 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0037-81 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human CD28 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555725 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Nou Tissue Culture Behandeld Plate </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Nou Niet Tissue Culture Behandeld Plate </td><td> BD Falcon </td><td> 351147 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Compleet T-cel media samenstelling 1x Geavanceerde RPMI 1640 5% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum 2 mM GlutamaxIM-I </td></tr></tbody></table>

piggybac transposon systeem wijziging van primaire menselijke t-cellen

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Het piggyBac transposon systeem is van nature actief, oorspronkelijk afkomstig van de kool grijper mot 1,2. Deze niet-virale systeem plasmide gebaseerd meest gebruikmakend van twee plasmiden met een expressie de piggyBac transposase enzym en een transposon plasmide het gen (s) plaats tussen inverted repeat elementen die nodig zijn voor genoverdracht activiteit. PiggyBac bemiddeld door genoverdracht een &quot;knip en plak&quot; mechanisme waardoor de transposase het transposon segment geïntegreerd in het genoom van de doelcel (s) plaats. PiggyBac aangetoond efficiënte genafgifte activiteit in diverse insecten 1,2, zoogdieren 3-5, en menselijke cells6 met inbegrip van primaire humane T-cellen 7,8. Onlangs werd een hyperactieve piggyBac transposase gegenereerd verbeteren van genoverdracht efficiëntie 9,10. Menselijke T lymfocyten van klinische interest voor adoptieve immunotherapie van kanker 11. Van de nota, heeft de eerste klinische studie met transposon modificatie van menselijke T-cellen met behulp van de Doornroosje transposon systeem is goedgekeurd 12. We hebben eerder beoordeelde de bruikbaarheid van piggyBac als niet-virale methoden voor genetische modificatie van humane T-cellen. We vonden piggyBac om efficiënt in genetische modificatie van humane T-cellen met een reportergen en een niet-immunogene induceerbare zelfmoordgentherapie 7. Analyse van genomische integratieplaatsen gebleken dat er geen voorkeur voor integratie in of nabij bekende proto-oncogenen 13. We gebruikten piggyBac gen-passen cytotoxische T-lymfocyten een chimeer antigen receptor gericht tegen het tumor antigen HER2 dragen, en dat gen-gemodificeerde T-cellen gemedieerd gericht doden van HER2-positieve tumorcellen in vitro en in vivo in een muizenmodel orthotope 14. We hebben ook piggyBacmenselijke T-cellen tegen rapamycine, die van nut zijn in kankerbehandelingen waar rapamycine wordt gebruikt 15 genereren. Hierin beschrijven we een methode om met piggyBac genetisch te modificeren primaire humane T cellen. Dit omvat isolatie van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) uit menselijk bloed gevolgd door kweek, genetische modificatie, en activering van T-cellen. Ten behoeve van dit rapport werden T cellen gemodificeerd met een reportergen (eGFP) voor analyse en kwantificering van genexpressie door flowcytometrie. PiggyBac kan worden gebruikt om menselijke T-cellen te passen met verschillende genen van interesse. Hoewel we gebruik piggyBac T-cellen voor tumorantigenen 14 sturen, hebben we ook een induceerbare piggyBac veiligheidsschakelaar toevoegen om genetisch gemanipuleerde cellen te elimineren indien nodig 7. De grote laadvermogen van piggyBac is ook mogelijk genoverdracht vaneen grote rapamycine resistent mTOR molecuul (15 kb) 15. Daarom presenteren we een niet-virale methodologie voor stabiele gen-modificatie van primaire humane T cellen voor diverse doeleinden.

Een schematische tonen de stappen genetische verandering menselijke T-lymfocyten met een reportergen (eGFP) wordt getoond in Figuur 1. Deze plasmiden zijn op verzoek verkrijgbaar bij de auteurs. Een schemtic tonen de stappen in genetisch gemodificeerde humane T-lymfocyten met een reportergen (eGFP) is showin in figuur 2. Er moet T-cellen activeren om hen te verdelen, uitbreiden en in cultuur propageren. Gemodificeerde menselijke T-cellen werden vervolgens geanalyseerd met behulp van flo...

We beschrijven een werkwijze voor genetisch primaire humane T cellen te veranderen met een transgen via de non-virale<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposon systeem. T-cellen aangepast om met de<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposon systeem vertonen een stabiele expressie van het transgen.

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

Het piggyBac-transposonsysteem is van nature actief en oorspronkelijk afgeleid van de koolmot1,2. Dit niet-virale systeem is plasmidgebaseerd, waarbij de meeste...

Het algemene doel van deze procedure is om primaire menselijke T-cellen stabiel genetisch te modificeren met een non-viraal transposon-systeem. Verzamel eerst menselijk bloed en isoleer vervolgens de mononucleaire cellen uit perifeer bloed. Voer daarna nuclefectie uit op de pbmc met het piggyback transposon-systeem en een transgen van belang, zoals EGFP. Stimuleer vervolgens de T-cellen om te prolifereren in kweek.Analyse vervolgens de T-cellen op transgeenexpressie. Uiteindelijk wordt flowcytometrie-analyse gebruikt om stabiele transgeenexpressie aan te tonen in T-cellen die zijn gemodificeerd met het piggyback transposonsysteem. In tegenstelling tot plasmatransfectie van menselijke T-cellen hebben transposonen het voordeel dat ze transgenen stabiel integreren voor langdurige expressie.De crux is het volgen van een zeer specifiek protocol bij de behandeling van de P BMC's tijdens de isolatie en na de nucleofectie; we hebben deze methode eerst geïmplementeerd om stabiele humane cellijnen te kweken voor de expressie van verschillende genen. Deze aanpak helpt bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie, zoals de vraag hoe T-cellen kunnen worden gemodificeerd om hun functioneren te verbeteren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Sunon en Saha, een promovendus uit mijn laboratorium, gebruikmakend van venepunctie.Verzamel 20 milliliters verse menselijke bloed in sodiumheparine vacutainerbuizen. Meng het bloed met advanced RPMI 1640 medium in een verhouding van één-op-één. Voeg vervolgens 20 milliliters lympho prep medium toe aan een centrifugebuis van 50 milliliter.Laag voorzichtig 25 tot 30 milliliters van het verdunde bloed bovenop de lympho prep en centrifugeer 40 minuten lang bij 400 times G zonder rem. Breng zowel de duidelijke als de wazige lagen over in 10 milliliters kamertemperatuur PBS. Vul het totale volume aan tot 50 milliliters met PPBS.Oogst vervolgens de cellen door centrifugatie bij 450 ×g gedurende 10 minuten, aspireer het supernatant volledig en was de cellen na centrifugatie eenmaal met 20 milliliter advanced RPMI. Resuspendeer de celpellet in 10 milliliter compleet T-celmedium, aangevuld met vijf nanogram per milliliter recombinant humaan IL 15. Tel de cellen nu en zaai 2 × 10⁶ cellen per put in een gecoate 24-well weefselkweekplaat.Voeg vervolgens steriel water toe aan alle omliggende wells. Incubeer de P BMCs gedurende de nacht in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2. Verdun de anti-CD28- en anti-CD3-antilichamen in steriel water tot een concentratie van 1 µg/mL.Voeg van elke antilichaamoplossing 500 µL toe aan vijf gemarkeerde putjes van een niet-gecoate 24-well tissue culture plate. Voeg vervolgens steriel water toe aan de overige putjes. Wikkel de plaat in en bewaar deze bij 4 °C.Verwarm het T-celmedium voor op 37 °C en vul dit aan met vijf ng/mL recombinant menselijk IL 15. Bereid daarnaast verse complete nucleo-effectoroplossing. Verdeel nu telkens vijf µg transposon en transpose A in een 1,5 ml centrifugebuis.Het kan nodig zijn om de transpose A en de hoeveelheid transposon-DNA te optimaliseren voor een optimale genoverdracht. Om cellulaire toxiciteit te minimaliseren, oogst u de PBM CS uit de 24-wells tissue culture plaat in een 50 milliliter buis. Bewaar na het tellen van de cellen 2 × 10⁶ P BMCs om als controle te gebruiken tijdens de flowcytometrie.Voeg vervolgens tussen zeven en 10 miljoen cellen toe aan een buis van 15 milliliter en centrifugeer bij 400 ×g gedurende vijf minuten. Aspireer het supernatant en tik met de vinger tegen de pellet. Voeg 100 µL T-cel complete nucle affection-oplossing toe aan de losgemaakte celpellet.Voeg nu het mengsel van de celoplossing toe aan de plasmiden. Voeg vervolgens het mengsel van de celoplossing en plasmiden toe aan de bodem van de nucleofectie-cuvette. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd. Nuclefect de cellen met behulp van programma U-014.Breng voor niet-gestimuleerde menselijke T-cellen de cellen over naar een put met 1,5 milliliters voorverwarmd medium plus R-H-I-I-L 15 en incubeer de niet-getransfecteerde, niet-gestimuleerde T-cellen gedurende één nacht in een celkweekincubator. Bepaal na het oogsten van de cellen het celaantal en zet 0,5 × 10⁶ van de niet-getransfecteerde pbmc apart als controles voor de flowcytometrie-bepaling van de frequentie van GFP-positieve cellen. Aspireer vervolgens de CD 3 28-antilichaamoplossing uit de plaat die niet is gecoat voor celkweek en spoel elke put met T-celmedium en resuspendeer.De nucle-behandelde cellen werden aangemaakt op 0,5 × 10⁶ cellen per milliliter. Voeg in compleet CTL-medium, aangevuld met 5 ng/mL RH IL-15, telkens 2,0 mL van de nucle-behandelde cellen toe aan vier putjes van een non-tissue culture plaat.Voeg 0,5 × 10⁶ niet-nucleaire aangetaste cellen per well toe. Incubeer de plaat gedurende drie dagen in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO₂.Oogst op dag vijf de gestimuleerde T-cellen uit de niet-gecoate kweekplaat. Zaai deze vervolgens uit in een gecoate 24-well kweekplaat met een concentratie van 0,7 × 10⁶ cellen per milliliter in T-celmedium met vijf nanogram per milliliter IL 15. Voer na het oogsten van de cellen een immunokleuring uit voor CD8, CD3 of CD4 om het percentage GFP-expressie te bepalen; analyseer de celpreparaten met flowcytometrie indien expansie van de T-cellen vereist is.Plat vervolgens op dag acht, na transfectie, de cellen uit met een dichtheid van 0,7 × 10⁶ cellen per well in T-celmedium bevattende IL 15 voor piggyback-gemedieerde genmodificatie van humane T-cellen. Primaire humane cellen worden getransfecteerd met twee plasmiden. Het transposase-plasmide stuurt de constitutieve expressie van het piggyback-eiwit aan onder een CMV-promotor.Het transpo-plasmid bevat de GFP-reporter en de piggyback-omgekeerde herhalingen die nodig zijn voor genoverdracht. Stabiele GFP-transgeenexpressie in T-cellen die zijn gemodificeerd met het piggyback-transposonsysteem kan worden bestudeerd via FACS-analyse. Hier werden de cellen op dag één gekleurd met een PC-geconjugeerd anti-CD8-antilichaam en geanalyseerd op EGFP- en APC-fluorescentie.EGFP-expressie wordt aangetroffen in 76,4% van de CD8-positieve cellen. De afname in EGFP-expressie tussen dag één en dag zeven is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat niet alle getransfecteerde cellen een stabiele integratie van het transposon-DNA ondergaan. U heeft nu een goed inzicht in hoe u PBMC's kunt isoleren en genen stabiel kunt introduceren.Modificeer deze met het piggyback-transpose-systeem. Vergeet niet om steriele technieken toe te passen bij het uitvoeren van de flebotomie. Werk snel om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals een T-cel cytotoxiciteitstest, worden uitgevoerd om de antigeenspecificiteit van de T-cellen te bepalen. Toekomstige experimenten zullen het gebruik van transposonen onderzoeken voor T-celgebaseerde immunotherapie bij kanker en muizen.

piggybac-transposon-system-modification-of-primary-human-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

This video demonstrates the procedure to generate motor neurons by transfection of human iPSCs with PiggyBac transposon system by the ectopic expression of lineage-specific transcription factors.

PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System

T cellen die een CD19-antigen specifieke chimere receptor (CAR) worden toegediend als onderzoek behandeling van B-cel maligniteiten in de eerste-in-humane gentherapie trials. We beschrijven genetische modificatie van T cellen met behulp van...

Klinische toepassing van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; En Kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen T-cellen uit perifeer en navelstrengbloed

In deze studie genereren we geïnduceerde pluripotente stamcellen uit muis-vruchtwatercellen, met behulp van een niet-viraal transposonsysteem.

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Dit protocol beschrijft een methode om stabiele integratie van een gen van belang in het menselijk genoom door het transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty -systeem. Voorbereiding van de integratie van defecte lentivirale vectoren, de in vitro -transductie van menselijke cellen en de moleculaire test op getransduceerde cellen worden gemeld.

Een efficiënte In Vitro omzetting methode door een Transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty systeem verpakt in een defecte lentivirale Vector integratie

We schetsen een 9-daags protocol voor de transductie en uitbreiding van rhesus macaque perifere bloedmononucleaire cellen die cellen oplevert met een uitstekende co-expressie van de genen van belang in voldoende aantal voor infusie studies van celwerkzaamheid.

Transductie en uitbreiding van primaire T-cellen in negen dagen met onderhoud van centraal geheugen Fenotype

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

We hebben een protocol ontwikkeld om primaire menselijke pigmentepitheelcellen te transfecteren door elektroporatie met het gen dat codeert voor pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) met behulp van het Transposon-systeem van Doornroosje (SB). Succesvolle transfectie werd aangetoond door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), immunoblotting en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon-systeem

Hier wordt een protocol gepresenteerd om primaire iris- en retinale pigmentepitheelcellen van verschillende zoogdieren (muizen, ratten, konijnen, varkens en runderen) te isoleren en te transfecteren. De methode is bij uitstek geschikt om oculaire gentherapiebenaderingen te bestuderen in verschillende opstellingen voor ex vivo analyses en in vivo studies die overdraagbaar zijn op mensen.

Isolatie, kweek en genetische manipulatie van primaire pigmentepitheelcellen van zoogdieren voor niet-virale gentherapie

Succesvolle kiembaantransformatie in de herfstlegerworm, Spodoptera frugiperda, werd bereikt met behulp van mRNA van hyperactief piggyBac transposase.

Hyperactief biggeBac Transposase-gemedieerde kiembaantransformatie in de herfst Legerworm, Spodoptera frugiperda

Er is een gedetailleerd protocol voorzien voor het gebruik van CRISPR/Cas9-technologie om zeer efficiënte, gerichte knock-in van grote, multicistronische constructies in primaire menselijke T-cellen te bereiken via de homologie-gemedieerde eindjoining (HMEJ) DNA-reparatieroute. T-cellen die met dit cGMP-aanpasbare protocol zijn ontwikkeld, behouden een uitstekende celexpansie, cytotoxiciteit en cytokineproductie.

Niet-virale engineering van primaire menselijke T-cellen via homologie-gemedieerde end-joining gerichte integratie van grote DNA-sjablonen

Leer hoe je primaire humane T-cellen stabiel genetisch wijzigt met het niet-virale piggyBac-transposonsysteem. Deze methode zorgt voor langdurige transgenexpressie en biedt een robuust platform voor T-celtherapie.

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

Meer video's verkennen