Substraat Generatie voor endonucleasen van CRISPR / Cas Systems

Het algemene doel van de volgende experimenten is het genereren van RNA-substraten voor de studie van Cas-endonucleasen, die een cruciale rol spelen in de crispr-Cas-immuunsystemen in bacteriën en archaea, om RNA-substraten voor Cas-endonuclease te verkrijgen. PCR-amplificatie van een specifieke CRISPR-regio kan worden ingezet om een lang DNA-template te verkrijgen voor in vitro RNA-productie, indien gewenst.

Twee oligonucleotiden kunnen worden geanneald om kortere templates te genereren voor de productie van substraat-RNA. Alternatief kunnen korte, op maat gesynthetiseerde herhalingssequenties vervolgens worden getest in CAS-endonucleasenays. Uiteindelijk kunnen de productie van RNA-transcripten en de daaropvolgende splitsing door CAS6-endonuclease worden gevisualiseerd via autoradiografie.

Het hoofddoel van de gepresenteerde technieken is om onderzoekers in staat te stellen de CRISPR-RNA-verwerking te bestuderen met RNA-substraten van variërende lengte. Daarom worden verschillende methoden gebruikt om kleine RNA's te genereren, zoals enkelvoudige repeat-elementen, of grotere RNA's zoals crispr-RNA-transcripten die meerdere spacers omvatten. Hoewel deze methoden specifiek inzicht bieden in de rijping van CRISPR-RNA, kunnen soortgelijke strategieën voor template-preparatie worden toegepast op andere RNA-verwerkingssystemen. De procedure zal worden gedemonstreerd door een promovendus en een postdoc, beiden afkomstig van een laboratorium gespecialiseerd in bacteriële en archeïsche CRISPR-immuunsystemen.

Een virale DNA-sequentie, genaamd een proto-spacer, kan worden ingevoegd tussen twee herhalingselementen in een groeiende CRISPR-cluster via een proces dat adaptatie wordt genoemd. Vervolgens wordt de gehele CRISPR-cluster getranscribeerd en daarna door een Cas-endonuclease, bijvoorbeeld Cas6, verwerkt tot kleine CRISPR-RNA's. Deze kleine CRISPR-RNA's worden vervolgens geïncorporeerd in het Cas-proteïnecomplex Cascade en bemiddelen de afweer van de gastheer tegen een herhaalde virale aanval, waarbij de basecomplementariteit tussen het CRISPR-RNA en de proto-spacer wordt gebruikt als signaal voor virale DNA-degradatie om lange pre-CRISPR-RNA-substraten te genereren.

Begin met het ontwerpen van PCR-primers, gericht op de spacerregio's van een CRISPR-cluster, door de T7 RNA-polymerasepromotersequentie aan de forward primer toe te voegen. Voeg vervolgens restrictieplaatsen toe aan beide primers voor het kloneren van het PCR-product in een vector. Let erop dat de T7 RNA-polymerase een guanine-residue vereist voor een correcte initiatie van de transcriptie na het amplificeren van de pre-CRISPR RNA-sequentie van belang uit het genomisch DNA via PCR.

Scheid de PCR-producten via gelelektroforese en extraheer de gewenste band uit de gel, en verteer vervolgens het PCR-product met restrictie-enzymen om kleverige uiteinden te creëren. Nadat u uw PCR-product heeft gezuiverd met een PCR-zuiveringskit om eventuele splitsingsbijproducten te elimineren, voegt u T4 DNA Ligase, T4 DNA Ligase-buffer en een molaire ratio van drie op één van het gesplitste PCR-product ten opzichte van de pUC-vector met de overeenkomstige kleverige uiteinden toe. Incubeer de ligatiereactie vervolgens gedurende de nacht bij 16 °C en transformeer het mengsel daarna in competente E. coli DH5α-cellen volgens standaardprotocollen, waarbij blauw-wit screening wordt gebruikt om succesvolle ligatie te identificeren.

Isoleer tot slot de plasmiden uit de witte kolonies met behulp van een plasmidepreparatiekit en identificeer positieve klonen via plasmidsequencing om pre-CRISPR RNA-substraten van gemiddelde grootte te genereren. Begin met het ontwerpen van forward- en reverse-oligonucleotiden met de gewenste CRISPR-repeat spacer-sequentie, vergelijkbaar met de hier getoonde sequenties. Let op dat de oligonucleotiden de sequentie van een T7 RNA-polymerasepromotor bevatten, evenals terminale restrictieplaatsen aan het einde van de oligonucleotiden om te waarborgen dat er sticky ends worden gevormd.

Incubeer de monsters na het knielen één uur lang bij 37 °C met T4-polynucleotidekinase en T4-polynucleotidekinasebuffer om 1 $\mu$M van elk van de oligonucleotiden 5'-fosforyleer. Incubeer vervolgens de gefosforyleerde forward- en reverse-oligonucleotiden vijf minuten lang bij 95 °C op een warmteblok met T4-DNA-ligasebuffer. Zodra de monsters zijn gehybridiseerd, schakelt u de warmtebron uit en laat u het mengsel ongeveer twee tot drie uur afkoelen tot kamertemperatuur.

Ligeer nu de bestelde oligonucleotiden met een hybridisatiemix van een verteerd en gedefosforyleerd P vector T, vier DNA-ligasebuffer en T4 DNA-ligase bij 16 °C gedurende de nacht. Transformeer vervolgens de geligeerde plasmiden in competente E. coli DH5α-cellen via standaardprotocollen, waarbij blue-white screening wordt gebruikt om succesvolle ligatie te identificeren. Isoleer tot slot de plasmiden en identificeer de positieve klonen door middel van digestie en daaropvolgende plasmidsequencing.

Korte cas RNA-substraatsequenties met een enkele herhaling kunnen worden ontworpen op een vergelijkbare manier als die hier worden getoond. Zorg ervoor dat er een deoxyribonucleotide wordt opgenomen. Indien de plaats van de RNA-splitsing moet worden bepaald, kan een gespecialiseerde synthesefaciliteit worden ingeschakeld voor de productie van het RNA-oligonucleotide.

Nadat de plasmiden met het gewenste aangepaste substraat zijn geïsoleerd, worden de plasmiden gelineariseerd met behulp van een maxi-prep plasmidpurificatiekit en het restrictie-enzym dat stroomafwaarts van de gekloonde fragmenten knipt. Na controle van de volledige digestie wordt het gelineariseerde plasmide gezuiverd middels fenol-chloroformextractie en ethanolprecipitatie. De nucleïnezuren worden teruggewonnen door het pellet op te lossen in DEPC-behandeld steriel water.

Incubeer nu de digestieve plasmiden gedurende drie uur bij 37 °C in een vers bereid in vitro T7 RNA-polymerase runoff-transcriptiemengsel met ATP, CTP, GTP en UTP. Analyseer ten slotte de verkregen RNA-transcripten op een denaturerende 8 M ureum, 12% polyacrylamidegel. Het is ook mogelijk om de transcripten te zuiveren via Mono Q anionuitwisselingschromatografie en vervolgens de transcripten terug te winnen door ethanolprecipitatie van de RNA-fracties en resuspensie van de pellets in DEPC-behandeld steriel water. Analyseer de ontworpen substraten door endonuclease-assays; begin met het visualiseren van de substraatbanden via autoradiografie en het zuiveren van de reactieproducten door gelextractie uit een denaturerend 8 M ureum.

Maak een 12% polyacrylamidegel en produceer en zuiver vervolgens de gewenste recombinante Cas-eiwitten via hitteprecipitatie en nikkel-NTA-chromatografie, zoals aangetoond voor dit Cas6-eiwit uit Clostridium thermocellum. Combineer vervolgens het Cas-eiwit gedurende 30 minuten bij 37 °C met een vers bereid endonuclease-reactiemengsel om de endonuclease-assayreactie te laten plaatsvinden. Laad tot slot vijf µL van het reactiemengsel op een 8 M ureumgel.

12% polyacrylamidegel en visualiseer de splitsingsproducten na elektroforese via autoradiografie. Hier wordt een met Coomassie-blauw gekleurde polyacrylamidegel getoond van een op maat ontworpen RNA-oligonucleotide en twee in vitro RNA-transcripten. Let op dat de efficiëntie van de RNA-productie varieert tussen de korte, lange en constructen van gemiddelde lengte.

Het onderzoek naar RNA-endonucleasenactiviteit vereist positieve en negatieve controles, evenals zeer gezuiverde recombinante Cas-eiwitten. In deze figuur: een SDS-PAGE-gel van een Cas6-monsterpreparaat van Clostridium thermocellum.

Een NTA-chromatogram na hitteprecipitatie en nikkelzuivering, uitgevoerd naast een standaard eiwitmarker, wordt getoond. Een geschikte negatieve controlemonster zou een cellysaat moeten bevatten zonder CAS six-expressie, maar na het volgen van dezelfde CAS six-zuiveringsprocedure werd vastgesteld dat de CAS six-preparatie beschikte over de vereiste hoge zuiverheidsgraad. Hier kan de splitsing van een substraat met een 5'-terminaal gelabelde herhalingssequentie door het co Clostridium thermo cell CAS six-eiwit worden gevisualiseerd via autoradiografie.

Elke baan bevat radioactief gelabeld substraat, RNA na incubatie met ca six-proteïne zoals aangegeven door de plustekens, of met een buffer als negatieve controle zoals aangegeven door de mintekens, lange substraten of korte substraten met of zonder toevoeging van het deoxyribonucleotide op positie min negen, die werden gebruikt om de endonucleasereactie te faciliteren. Let op het gebrek aan splitsing van de korte substraten wanneer het deoxyribonucleotide in het RNA-molecuul was opgenomen na deze procedure.

CAS zes nucleasen kunnen ook worden gebruikt als instrument om rijpe, precieze RNA's te genereren. Deze RNA's kunnen worden ingebouwd in cascade-complexen om inzicht te verkrijgen in de betrokkenheid bij de interferentie van virale aanvallen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u CRISPR-es-substraten voor Cas- en nucleasen ontwerpt en produceert.

Deze verschillende substraten zijn nuttig voor het beantwoorden van vragen over de rijping en het gebruik van crispr Es.