Name: Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Leer een chirurgische techniek voor subretinale injectie van gentherapievectoren en stamcellen in het muizenoog. Deze methode maakt gecontroleerde levering van therapeutische agentia mogelijk voor toekomstige behandelingen van netvliesziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek naar blindheid te voorkomen; Experimentele hulp van Takayuki Nagasaki; Dit onderzoek voldoet aan de Arvo verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Visual Research. KJW wordt ondersteund door NIH subsidie ​​5T32EY013933 en 5T32DK007647-20. VBM wordt ondersteund door NIH subsidie ​​K08EY020530.

1. Monteer Inrichtingen voor de subretinale Injectie <ol><li> Koop of maak een 100 um diameter naald uit een glazen capillaire buis. Dit kan handmatig worden gedaan met behulp van een Sutter P-97 pipet trekker of ander soortgelijk materieel. Het einde van de capillaire buis wordt verwarmd en getrokken tot aan de gewenste diameter (100 pm). Een kleinere diameter naald kan worden gebruikt voor gentherapie vectoren, maar dit is de aanbevolen diameter celinjectie zonder schade aan de cellen of het oog. Vergeleken met stalen naalden, de glazen capillaire naald een zeer fijn maar stomp uiteinde, om voor visualisatie van de injectievloeistof en toegang tot de subretinale ruimte mogelijk zonder dat retinale breuk. Reinig deze getrokken naalden als dat nodig is met behulp van 70% ethanol, en op te slaan in een steriele container. Een 15 cm steriele weefselkweekplaat met tape om de naalden zijn plaats te houden is een manier waarop om de injectienaalden afgedekt en in een steriele omgeving. Op dit punt, complete de set-up in de chirurgische ruimte waar de procedure plaatsvindt. Het eenvoudigste is om alle apparatuur te houden in de operatiekamer te allen tijde in zodat het steriel blijven, vooral als deze procedure wordt gedaan binnen een barrière faciliteit. </li><li> Zuig silicone in de injectienaald en verwijder de silicone een coating verlaten langs de binnenwanden van de naald. De siliconencoating maximaliseert de passage van cellen en virussen door de naald boring, die anders zich aan de binnenste glazen capillaire wanden. </li><li> Zorg voor een ongeveer 8 cm lengte van steriele plastic buis door te snijden een 25 ¾-gauge bloedafname set met luer-lock op het punt direct na de naald (het verwijderen van de naald uit de slang). </li><li> Vul een 1 ml Sub-Q 26 5/8-gauge slip-tip spuit met een steriele zoutoplossing en verwijder de naald van de spuit. </li><li> Bevestig de injectienaald aan het afgesneden uiteinde van de plastic buis en bevestig de spuit met de luer-lock aan de andereend. </li><li> Zuig steriele zoutoplossing om de dode ruimte in de buis en capillaire naald, het uitwerpen van een aantal fysiologische zoutoplossing door de naald om ervoor te zorgen dat het correct is aangesloten, zonder enige lekkage te vullen. Vervolgens zuigen kleine, ongeveer 1 ui hoeveelheid lucht in de punt van de injectienaald. Deze scheidt de zoutoplossing uit de injectievloeistof en een visueel signaal dat het einde van de injectievloeistof gedurende de chirurgische procedure. De injectie apparatuur moet worden bewaard op een schone ondergrond afgeveegd met 70% ethanol gedurende de chirurgische ingreep. Bovendien moeten alle apparatuur die bij de chirurgische procedure voor en na met 70% ethanol worden gereinigd, behalve de injectienaalden reeds moet blijven steriel en klaar voor gebruik. Deze naalden worden verwijderd na de operatie en niet hergebruikt. </li><li> Tenslotte zuigen injectievloeistof die het gewenste verpakte gentherapie virale vector of stamcellen. Dit kan doortoegang tot de injectievloeistof in een steriele pipet, dan pipetteren de oplossing op het oppervlak van een steriele celkweekschaal. De oplossing kan nu gemakkelijk worden opgezogen in de injectienaald met de spuit. De benodigde hoeveelheid zal variëren afhankelijk van de leeftijd van de muis. Voor onze doeleinden gebruiken we postnatale dag 5 muizen, die worden geïnjecteerd met 0,5-0,8 pl injectievloeistof. Kleinere hoeveelheden, 0,5 pl of minder kunnen worden gebruikt voor jonge muizen en grotere hoeveelheden zoals 1 pl, kan worden gebruikt bij volwassen muizen. De virale titer of aantal cellen moet worden bepaald op basis van de virus / cellen worden geïnjecteerd en hun gewenste doelweefsel, kan als te veel virale deeltjes of cellen in een klein volume leidt tot toxiciteit voor de retinacellen. In de video voor visualisatie doeleinden hebben we 1,5 ul, een grotere hoeveelheid kleurstof dan nodig te injecteren in het oog. </li></ol> 2. Toegang tot de subretinale ruimte <ol><li> Binnen de steriele operatiekamer,stabiliseren of de muis verdoven volgens de lokaal goedgekeurde dier hanteren protocol, dat is afhankelijk van de leeftijd van de muis. Gemeenschappelijke anesthesie voor volwassen muizen omvat het gebruik van isofluraan gas of een intraperitoneale injectie van 0,1 ml/10g lichaamsgewicht van ketamine (100 mg / ml) en xylazine (20 mg / ml) in steriele zoutoplossing. Voor perinatale muizen, gemeenschappelijke anesthesie technieken omvatten het gebruik van isofluraan gas of cryoanesthesia (hypothermie). Alle anesthesie technieken moeten worden goedgekeurd door uw lokale IACUC commissie voor gebruik. We gebruiken meestal postnatale dag (P) 5 muizen, hoewel soortgelijke technieken kunnen worden toegepast op muizen zo jong als P0 of volwassen muizen. De chirurgische procedure kan pas beginnen wanneer de muis niet meer bewegen van de ledematen en niet meer reageert op teen knijpt. Voor perinatale muizen, zullen ze merkbaar lichter van kleur, omdat de bloedstroom zal vertragen, een andere sleutel om te weten dat ze volledig onder narcose. </li><li> In perinatale muizen, gebruik Vannas rechte schaar om make een geschatte 1,5 mm incisie langs de gesloten deksel spleet. Voorzichtig te snijden bij de inkeping waar het oog zal uiteraard later weer openen. Dit zorgt ervoor dat de deksels genezen en goed open tijdens de ontwikkeling van de muis. Een chirurgisch mes kan worden gebruikt voor dit doel, hoewel wij er de voorkeur Vannas schaar aangezien zij het risico van doorprikken het oog tijdens de procedure te verminderen. In de video werden de schaar gebruikt om direct doorboren en snede langs de ooglidrand. Bij het leren deze techniek moet forceps worden gebruikt om het ooglid heffen voor het snijden en het risico op beschadiging van het oog te verlagen. </li><li> Uit elkaar trekken van de oogleden met gebogen dressing pincet voor het oog proptose en de oogleden knijp lichtjes onder het oog te houden proptosed voor injectie. Of het deksel incisie die in stap twee te groot is, wordt het oog terug glijden onder de deksels en voorkomt adequate blootstelling tijdens de injectieprocedure. Voor volwassen muizen onder lichte druk rond de ogen met dressing tang kan houden in het oog proptosed voor injectie. </li><li> Maak een kleine sclerale incisie op of posterieur aan de evenaar van de bol door krassen op het oppervlak met een 15-graden microchirurgie mes. Deze incisie moet alleen groot genoeg zijn om de punt van de injectienaald passeren, maar niet groter dan dat. Indien gewenst kan een kleine scherpe naald zoals een acupunctuurnaald worden gebruikt om deze incisie in de subretinale ruimte plaats van de microchirurgie blad. In donker gepigmenteerde dieren een donkerbruine gepigmenteerde weefsel (choroid-retinal pigment epithelium) zichtbaar op de plaats van incisie. In lichtere gepigmenteerde of albino muizen, kan een chirurgische markeerstift worden toegepast op de punt van het mes microchirurgie een inktvlek waarin de incisieplaats verlaten. Als duidelijk (glasvocht) vloeistof refluxes uit de incisie site, werd het blad geplaatst te diep en ging de glasvochtruimte en de therapeutische virus of cellen kan de intravitreale spatie in te voeren tijdens de injectie. Voor visualizatiaan doelen hebben we de incisie op dit punt in de video. Het is nog steeds mogelijk om te voltooien een subretinale injectie in dit geval echter het netvlies veroorzaakt door de aanwezigheid van de injectievloeistof niet volledig genezen in deze muis. Daarom moet erop worden gelet dat alleen het buitenoppervlak van het oog en niet door de retina snijden voor injectie. </li><li> Steek de injectienaald in de incisie site en vooruit het evenwijdig aan de buitenste oog muur om de subretinale spatie in te voeren. Vooruit te dicht bij de buitenwand of te diep in het oog zal direct de injectie in de verkeerde richting. De beste methode om te begrijpen of de naald op de juiste plaats is om te oefenen de techniek. Oefenen op licht gepigmenteerde of albino muizen kan helpen om nauwkeurig en accuraat injecties te maken in de subretinale ruimte. Dit komt omdat de naald en injectievloeistof is zichtbaar in deze ogen. </li><li> Druk zachtjes op de zuiger en zijngin injectie van het gewenste fluïdum. Als de naald goed geplaatst binnen de subretinale ruimte, zal een matige tegendruk gevoeld worden. Als de naald in het glasvocht, zal er aanzienlijk minder tegendruk en mogelijk wat vocht reflux tijdens de injectie. Als er significante tegendruk, houdt de naald op zijn plaats gedurende ten minste nog eens 15 seconden voordat de naald langzaam. Hierdoor kan de hoge intraoculaire druk in plaats van gelijk refluxen de geïnjecteerde virus of cellen weer uit de incisieplaats. Sommige van de lucht en zoutoplossing worden geïnjecteerd in de subretinale ruimte door de verhoogde druk vereist tijdens de injectieprocedure. Erop moet worden gelet dat over-spuiten lucht of saline, aangezien het spoelen van de geïnjecteerde virus of cellen van het oog. Het is ook mogelijk om permanent netvliesloslating veroorzaken door de aanwezigheid van te veel vloeistof in de subretinale ruimte. Voor visualisatie doeleinden, werd overmaat kleurstof en lucht ingespoten into de subretinale ruimte in de video. Het is duidelijk te zien hoe een deel van de kleurstof terug worden gespoeld uit de subretinale ruimte als er teveel wordt geïnjecteerd, maar ook hoe de luchtbel blijft in de subretinale ruimte en niet verdwijnt in het glasachtig lichaam. Dit werd gebruikt om te benadrukken dat deze injecties waren allemaal op de juiste locatie van het oog, zodat men kan visualiseren hoe de naald moet de incisie site binnen te gaan. Alle injecties in de subretinale ruimte leiden tot een tijdelijke netvliesloslating door de aanwezigheid van de injectievloeistof. Als de injectie procedure correct voltooid, zal deze tijdelijke netvliesloslating genezen binnen 24 uur en muizen kunnen worden gebruikt voor verdere experimenten. Het oog kan zacht blijven gedurende ongeveer een week aan de chirurgische procedure, waardoor een tweede injectie vermeden worden gedurende deze periode. </li><li> Voor neonatale muizen, gebruik maken van de gebogen dressing een tang om duw het oog achter de deksels en in de baan. Het kan nuttigwachten een minuut, zodat het virus te regelen in het subretinale ruimte en niet veroorzaken worden gespoeld de incisieplaats duwen wanneer het oog terug in zijn baan. Na de operatie, een druppel van 0,5% bupivacaïne (Marcaine) verdund tot 0,25% in steriele zoutoplossing van een 25-gauge naald kan worden geplaatst op de injectieplaats. Muizen vertonen geen duidelijke tekenen van nood na subretinale chirurgie en het gebruik van bupivacaïne als een langwerkende actuele pijnstillende is al ruim voldoende voor de drie voorgaande jaren. Muizen altijd worden gecontroleerd na de operatie om te zoeken naar tekenen van nood, zoals infectie, zwelling of een afname van de dagelijkse activiteiten van de muis. In deze gevallen moet de dierenarts worden meegedeeld en verder pijnstillers zoals buprenorfine (0,05 mg / kg) worden toegediend als intraperitoneale injectie. </li><li> Wake de muis van anesthesie op basis van lokaal goedgekeurde dieren hanteren protocol. De muis moet worden bewaard op een verwarmings-padvertentie naar een normale lichaamstemperatuur te handhaven als het ontwaakt uit de narcose. De chirurgische procedure duurt minder dan vijf minuten in beslag, nog afgezien van de tijd voor de muis om anesthesie ondergaan. Daarom is een verwarmingselement is niet nodig tijdens de eigenlijke procedure, maar mogelijk nodig terwijl men leren van de techniek als de procedure zou een langere tijd. De muis niet worden teruggeplaatst in een schone kooi totdat het begonnen te bewegen op zichzelf. Voor pasgeborenen, zal zachte teen knijpt helpen voor hen om volledig te herstellen van de narcose, en ze moeten hun roze kleur en beweging te herwinnen voordat ze teruggeplaatst bij de moeder. Muizen moeten worden gecontroleerd na verloop van tijd op tekenen van nood, zoals eerder vermeld. </li></ol>

<ol><li>Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: 
		
 <a target="_blank" href="http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp">http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp</a> (2011).</li>
<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Ganka+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li>
<li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations%3A+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li>
<li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li>
<li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li>
<li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li>
<li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosi%2C+J+%22Exp.+Biol.+Med%22">Exp. Biol. Med</a>. 236, 1211-1217 (2011).</li>
<li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992(2011).</li>
<li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahajan%2C+VB+%22A+high-throughput+Mouse+Eye+Phenomics+System%22">A high-throughput Mouse Eye Phenomics System</a>. , Cold Spring Harbor Laboratories. (2010).</li>
<li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li>
<li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fundus+photography+and+angiography%3A+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22(1999).</li>
<li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+resources+for+vision+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384(2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Deze video techniek bevat instructies voor het voltooien van de injectie subretinale chirurgische procedure succesvol, en ervoor zorgen dat de vector voor gentherapie of stamcellen worden in de locatie noodzakelijk zijn om doelmatig behandelen oogziektes. Deze techniek maakt de targeting van retinale cellen zoals RPE of de fotoreceptoren, omdat hierdoor de gentherapievectoren of stamcellen afgeleide weefsels in de nabijheid van deze cellen. Vorige methoden te intravitreale injecties, waar de vloeistof wordt geplaatst in...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 0,8-1,10 x 100 mm Capillaire buis (glas) </td><td> Kimble Glass, Inc </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipet Puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge kan in plaats daarvan worden gebruikt. Catalogus # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td> Silicone </td></tr><tr><td> Dubecco&#39;s fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing met calciumchloride en magnesiumchloride </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Lok 25 3/4G x 12 &quot;; bloedafname Set </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Sub-Q 265/8G Slip-Tip spuit </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5-10 ul Finnpipette II Verstelbare-Volume Pipetten </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1 tot 200 ul Natuurlijke Schuine Tips </td><td> USA Scientific, Inc </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 Stereo Microscope </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Style Behandeld Polystyreen celkweekschaal </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Rechte Schaar </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> Gebogen Dressing Pincet met vertanding Delicate </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 graden Microchirurgie Knife </td><td> Wilsop Oogheelkundige Corp </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamine </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45 tot 290 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> NADA # 139 tot 236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacaïne (Marcaine) </td><td> AstraZeneca </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinale injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de mouse eye

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Het verlies van het gezichtsvermogen treft ongeveer 3,4 miljoen mensen in de Verenigde Staten en zal naar verwachting toenemen in de komende jaren. 1 Onlangs, gentherapie en stamceltransplantaties zijn geworden belangrijke therapeutische instrumenten voor de behandeling van blindheid als gevolg van retinale degeneratieve ziekten. Verschillende vormen van autologe transplantatie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), zoals iris pigment epitheelcellen transplantatie hebben bemoedigende resultaten gegenereerd en klinische proeven begonnen voor andere vormen van gen en stamceltherapieën. Twee waaronder RPE65 genvervanging bij patiënten met congenitale amaurosis Leber en een RPE celtransplantatie met humane embryonale stamcellen (ES) cellen bij de ziekte van Stargardt. 3-4 Nu er gentherapievectoren en stamcellen voor behandeling van patiënten met retinale ziekten is het belangrijk te verifiëren deze potentiële therapieën in diermodellen voor toepassingden om in menselijke studies. De muis is een belangrijke wetenschappelijke model voor het testen van de therapeutische werkzaamheid van gentherapievectoren en stamceltransplantatie in het oog. 5-8 in dit video artikel zullen we een techniek om gentherapievectoren of stamcellen injecteren in de subretinale ruimte van de muis oog terwijl het minimaliseren van schade aan het omringende weefsel.

Een tekening van de muis oog wordt met grote structuren gemerkte referentie met pijlen tonen de locaties voor zowel intravitreale injectie en subretinale chirurgische procedures (pijlen, Figuur 1). Gentherapievectoren, zoals lacZ lentivirale vector (Figuur 2), worden geïnjecteerd met deze locaties. Bovendien kunnen stamcellen, zoals muis embryonale stamcellen (figuur 3), worden getransplanteerd in situ in de muis oog. 1 ui van een l...

Deze chirurgische techniek illustreert de injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de subretinale ruimte van de muis oog.

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

Blindheid treft ongeveer 3,4 miljoen mensen in de Verenigde Staten en de verwachting is dat dit aantal in de komende jaren zal toenemen.1 Onlangs is gentherapie ...

De eerste stap is het assembleren van het apparaat vanuit een set voor bloedafname. Snijd een naald van 25 3/4 gauge af van dit acht centimeter lange stuk steriele slang. Met een lure-lock kunt u een glazen capillairnaald met een diameter van honderd micron aanschaffen, of er zelf één maken met een Sutter P 97 pipette Puller; aspireer vervolgens steriele zoutoplossing om de dode ruimte in de slang te vullen.Bevestig een glazen capillairbuis aan het uiteinde van de steriele plastic slang en spuit wat zoutoplossing door de naald om te controleren of deze correct is bevestigd zonder lekkage. Wanneer u onder een microscoop kijkt, kunt u zien hoeveel druk er wordt uitgeoefend en wat de snelheid van de vloeistofuitstoot door de fijne tip is; we gebruiken een gekleurde oplossing om de virale vector of stamcellen weer te geven. Plaats dit in een steriele Petrischaal, aspireer wat lucht en vervolgens de injectie-oplossing.Voor onze doeleinden gebruiken we P vijf muizen. Op deze afbeelding is de snuit te zien. De positie van het oog wordt bedekt door een ooglid.De stippellijnen tonen de lidrand en de lidplooi waar de incisie zal worden gemaakt. Met een rechte Vanis-schaar wordt een incisie van anderhalf millimeter langs het gesloten ooglid gemaakt. Met fissuurklemmen worden de oogleden uit elkaar getrokken en het oog wordt geopend, waarbij de lidrand zich iets achter de oogbol bevindt.Om de sclerotomie uit te voeren, is het belangrijk om een aantal oriëntatiepunten te kunnen identificeren. De overgang van het heldere hoornvlies naar de sclera wordt gemarkeerd door de limbus. Net binnen de sclera bevindt zich het retinaal pigmentepitheel, gevolgd door het netvlies en vervolgens het glasachtig lichaam. De incisie wordt geplaatst halverwege naar achteren of bij de equator van de oogbol door het oppervlak open te krassen met een microschirgisch mesje van 15 graden bij donker gepigmenteerde dieren.Op het punt van de incisie wordt donkerbruin gepigmenteerd weefsel zichtbaar. Als de incisie te diep wordt gemaakt, zal er vloeistof naar buiten komen. Dit is het glasachtig lichaam en betekent dat u te ver bent doorgegaan.Het passeren van het RPE-netvlies. Deze incisie kan worden gebruikt voor een intravitreale injectie. Nu, het dier zelf meebrengen.De incisie is op dit punt voltooid. Aanvullende incisies en krassen zullen glasvocht vrijmaken voor een subretinale injectie; het doel is om de microcapillaire glazen buis in de subretinale ruimte te plaatsen, precies tussen het netvlies en het RPE. Als de incisie te diep was, kan de naald door het netvlies heen in het glasvocht worden geplaatst. Voer de naald parallel aan de buitenwand van het oog in.Om de subretinale ruimte te betreden: oefen lichte druk uit op de zuiger en begin met het injecteren van de vloeistof. Als de naald correct is geplaatst, zal er een matige tegendruk voelbaar zijn en wordt er een BLE in de subretinale ruimte gecreëerd.Als de naald zich in het glasachtig lichaam bevindt, is de tegendruk aanzienlijk lager. Houd de zuiger 15 seconden extra op zijn plaats voordat u de naald verwijdert om aanzienlijke reflux te voorkomen. Dit stelt de intraoculaire druk in staat om te stabiliseren.Duw het oog voorzichtig met gebogen wondpincetten terug achter de oogleden in de oogkas. Hier is een ander voorbeeld van een subretinale injectie waarbij de kleurstof de subretinale ruimte vult en duidelijk zichtbaar is in een albino dier. De luchtmeniscus stelt u in staat om te zien wanneer u het einde van uw injectie bereikt.Vloeistofinjecties in een donker gepigmenteerd oog zijn iets uitdagender. Door de naald zorgvuldig in te brengen, kunnen uitstekende resultaten worden behaald.

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier presenteren wij twee technieken voor het manipuleren van genexpressie in muriene retinale ganglioncellen (RGC)...

In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

Een methode voor de integratie van plasmide DNA in het netvlies van muizen cellen voor het verrichten van een winst-of verlies van functie...

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

Source: Park, S. W., et al. Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (2015)The video describes the method for subretinal injection of viral vectors into the retinal pigment epithelium (RPE) in a mouse model. It details the procedure from anesthesia and eye preparation to precise lentiviral vector delivery, ensuring gene integration and expression in the RPE.

Subretinal Injection of Viral Vectors into the Retinal Pigment Epithelium in a Mouse Model

Hier presenteren we een door de gemeenschap geaccepteerd protocol in multimedia-formaat voor het subretinaal injecteren van een bolus RPE-cellen bij ratten en muizen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor het bepalen van reddingspotentieel, veiligheidsprofielen en overlevingscapaciteiten van getransplanteerde RPE-cellen bij implantatie in diermodellen van retinale degeneratie.

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Subretinale injectie is een chirurgische techniek voor effectieve genoverdracht naar het retinale pigmentepitheel in het oog van de muis. Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor subretinale injectie van virale vectoren naar het retinale pigmentepitheel bij experimentele muizen.

Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel

Subretinale injecties zijn de meest gebruikte techniek voor het afleveren van grote therapeutische middelen zoals eiwitten en virale vectoren aan fotoreceptoren en het retinale pigmentepitheel. Hier wordt een alternatieve methode bij muizen beschreven die met succes de subretinale ruimte target met minimale nevenschade en snelle hersteltijden.

Een alternatief en gevalideerd injectiemethode voor toegang tot de Subretinal Space<i&gt; via</i&gt; Een Transcleral Posterior Approach

Hier tonen we een nieuwe benadering voor het gebruik van hoge resolutie spectrale domein optische coherentie tomografie (HR-SD-OCT) helpen levering van gen-therapie-agenten in de subretinal ruimte, beoordelen van haar areal dekking en karakteriseren fotoreceptor vitaliteit.

Met resolutie muis optische coherentie tomografie steun intraoculaire injectie in het netvlies gentherapie onderzoek

Dit protocol presenteert een transpupillaire zichtgeleide transsclerale benadering om veilig en nauwkeurig subretinale cellulaire transplantaten af te leveren, met een laag aantal chirurgische complicaties, bij muizenontvangers met of zonder retinale degeneratie.

Transpupilgeleide transsclerale transplantatie van subretinale transplantaten in een muismodel voor retinale degeneratie

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de bereiding van post-gecryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen en de subretinale afgifte van deze cellen in rd10-muizen .

Subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij RD10-muizen

Dit artikel biedt een protocol en een begeleidende video voor de retrobulbaire sinusinjectie tot een totaal volume van 150 μL voor postnatale, juveniele en uitgelopen volwassen muizen. Deze procedure is bijzonder geschikt voor de injectie van kleine muizen (15 g) wanneer injectie van de staartader niet haalbaar is.

Systemische behandeling voor postnatale, juveniele en gerunde volwassen muizen door retrobulbaire sinusinjectie

Subretinale injecties zijn een onmisbare techniek voor de preklinische ontwikkeling van therapieën voor fotoreceptor- en RPE-ziekten. We beschrijven een geoptimaliseerde transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen die de intraoperatieve slagingspercentages verbetert en schade aan het netvlies minimaliseert.

Geoptimaliseerde minimaal invasieve transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen

Leer een chirurgische techniek voor subretinale injectie van gentherapievectoren en stamcellen in het muizenoog. Deze methode maakt gecontroleerde levering van therapeutische agentia mogelijk voor toekomstige behandelingen van netvliesziekten.

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

Meer video's verkennen