Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

Het algemene doel van deze procedure is om snare-gemedieerde celfusiegebeurtenissen te kwantificeren via de geactiveerde expressie van bèta-galacto. Dit wordt bereikt door eerst v- en t-snare-eiwitten ectopisch tot expressie te brengen aan het oppervlak van cost seven-cellen. De volgende stap van de procedure is het combineren van de cellen die v-snare-eiwitten tot expressie brengen met de cellen die t-snare-eiwitten tot expressie brengen.

Dit resulteert in snare-gemedieerde celmeting en de geactiveerde expressie van bèta-galacto. Uiteindelijk wordt de door celfusie geïnduceerde bèta-galacto-activiteit gemeten met een spectrofotometer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de microscopische SAL-regio-assay, is dat er meerdere snare-combinaties geanalyseerd kunnen worden.

Kwantitatief gezien kan deze methode worden toegepast om het mechanisme en de regulatie van SNARE-gemedieerde membraanfusie te begrijpen. Het kan daarnaast worden ingezet voor high-throughput studies. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Na Hassan, een postdoc, en David Humphrey, een technicus uit mijn laboratorium, de dag voor de transfectielading.

Bereid 24-wells platen voor met glazen dekglasjes van 12 millimeter; bereid twee wells voor voor elke combinatie van cellen die unieke plasmiden tot expressie brengen in het experiment op deze dekglasjes. Zaai 30.000 cos-7 cellen, gekweekt in DMEM aangevuld met 4,5 gram per liter glucose en 10% FBS, om de V-cellen te transfecteren. Voeg aan elke well een kwart microgram van het TTA-plasmide en één set expressieplasmiden toe.

Transfecteer de T-cellen met een kwart microgram van het plasmide dat TRE lacks Z codeert, samen met de complementaire set plasmiden die de eiwitten van belang coderen; in dit geval de geflippede VAMPs, SNAP-25, syntaxine 1 en syntaxine 4. Transfecteer nu de COS-7 cellen met Lipofectamine volgens de instructies van de fabrikant en kweek de cellen gedurende 24 uur. Fixeer de cellen 24 uur na de transfectie gedurende 10 minuten in aangevulde paraformaldehyde. Spoel de cellen na de fixatie drie keer met PBS++, blokkeer de cellen vervolgens gedurende 30 minuten met aangevulde FBS.

Na het blokkeren worden de cellen gedurende 30 minuten geïncubeerd met de anti-mic monoklonale antilichaam Nine E 10. Na vier wasbeurten met PBS++ worden de cellen gedurende een uur geïncubeerd met FITC-geconjugeerde secundaire antilichamen in een verdunning van 1:500. Na nog vier wasbeurten met PBS++ worden de gelabelde cellen gemonteerd in een commercieel verkrijgbaar anti-fade reagens.

De cellen zijn nu klaar voor confocale microscopie. Zaai de dag voor de transfectie 1,2 miljoen Cos-7-cellen in elke 100 millimeter weefselkweekschaal en 200.000 Cos-7-cellen in elke put van zes-puts-platen voor elke plasmidcombinatie die geanalyseerd zal worden. Bereid één put voor en kweek de cellen gedurende 24 uur. Voeg de volgende dag de plasmiden toe voor de transfectie. Transfect voor de V-cellen een plasmid dat het Flip-eiwit van belang tot expressie brengt en vijf microgram pTet-Off aan de cellen in elke 100 millimeter kweek toe.

Co-transfect controlecellen in een 100 millimeter kweekschaal met een lege vector en P te off in dezelfde relatieve concentraties als de V-cellen. Nadat alle plasmiden aan de V-cellen en controlecellen zijn toegevoegd, voegt u tcom mycin toe aan deze wells om de N-glycosylering van vamps te voorkomen. Co-transfect in elke well van de zes-wells platen de T-cellen met één microgram PBIG met de complementaire plasmiden die de eiwitten van belang tot expressie brengen.

Transfect nu de COST7-cellen met Lipofectamine volgens de instructies van de fabrikant. Kweek de cellen vervolgens gedurende 24 uur. Detacheer 24 uur na de transfectie de cellen van hun kweekschalen met een enzymvrije cel-dissociatiebuffer. Begin hiermee door de cellen eenmaal te wassen met 20 milliliters PBS.

Voeg vervolgens vijf milliliter enzymvrije dissociatiebuffer toe. Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur zullen de cellen loslaten door scherp op de plaat te tikken; controleer onder de microscoop of ze zijn losgekomen. Als minder dan de helft van de cellen is losgekomen, wacht dan nog vijf minuten en tik opnieuw op de plaat.

Zet de incubatie in detachementbuffer voort totdat meer dan de helft van de cellen is losgekomen. Tel vervolgens de V-cellen met een hemocytometer. Resuspendeer de V-cellen daarna op een concentratie van ongeveer 480 000 cellen per milliliter in aangevulde HBES-buffer DMEM.

Voeg nu één milliliter van de geresuspendeerde V-cellen toe aan elke well met de T-cellen en plaats de platen terug in de incubator. Na zes, 12 of 24 uur co-cultivatie van de cellen, worden deze gewassen met PBS en wordt lysisbuffer toegevoegd. Schraap vervolgens de cellen uit de wells en breng deze over naar buisjes voor centrifugatie.

Breng na het centrifugeren het supernatant over naar een nieuwe buis en meet de expressie van bèta-galactoside met een commercieel beschikbare assay volgens de instructies van de fabrikant tijdens dat protocol; zorg ervoor dat de cholerimetrische reactie na 90 minuten wordt gestopt door één molaire natriumcarbonaat toe te voegen om de resultaten te scoren. Meet de absorptie bij 420 nanometer op een spectrofotometer. Wanneer CO seven-cellen werden getransfecteerd met flipped snare-plasmiden, werden flipped snare-eiwitten op het celoppervlak tot expressie gebracht.

Flowcytometrie werd gebruikt om de expressieniveaus van snare-eiwitten aan het celoppervlak te meten. Om hun membraanfusiecapaciteiten te kunnen vergelijken, moesten vamps op hetzelfde niveau worden tot expressie gebracht. Daarom werd de concentratie van elk gebruikt flipped snare-plasmide in de transfectie getitreerd en geoptimaliseerd voor transfectie.

Onder deze omstandigheden werden vamp 1, 3, 4, 5, 7 en 8 en syntaxine 1 en 4 respectievelijk op hetzelfde niveau aan het celoppervlak tot expressie gebracht; de neuronale snares die synaptische exocytose mediëren, werden gebruikt om de haalbaarheid van de assay te testen. Inderdaad, wanneer de V-cellen die vamp 2 tot expressie brachten en de T-cellen die SYNTAXIN 1 en snap 25 tot expressie brachten werden gecombineerd, werd een robuuste expressie van bèta-galactoside detecteerbaar. Echter, wanneer vamp 2 of SNAP 25 niet tot expressie kwamen, werd slechts de basisactiviteit van bèta-galactosidase gedetecteerd, wat aangeeft dat celfusie en de expressie van bèta-galactosidase afhankelijk zijn van interacties tussen v- en t-snares. Over het algemeen vertoonden SYNTAXIN 1, snap 25, vamp 1, vamp 3 en vamp 8 vergelijkbare en de hoogste fusieactiviteiten.

In tegenstelling hiermee suggereert de baseline beta GAL-activiteit dat de proteïnecombinatie geen membraanfusie induceert, zoals wel het geval is bij vamp five en SYNTAXIN one. Snap 25. Bij het uitvoeren van de enzymatische fusie-assay is het belangrijk om te onthouden dat tunicamycine moet worden toegevoegd om N-glycosylering van SNARE-proteïnen te voorkomen en DTT moet worden toegevoegd om de vorming van disulfidebruggen tussen SNARE-proteïnen te voorkomen.

Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u de cellfusie-assay uitvoert.