Name: Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Leer een enzymatische celfusie-assay voor SNARE-gemedieerde membraanfusie met β-galactosidase als reporter. Deze methode kwantificeert fusiegebeurtenissen en analyseert meerdere SNARE-combinaties in COS-7-cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door het opstarten fondsen van de Universiteit van Louisville en CA135123 van de National Institutes of Health (tot CH).

1. Celkweek en transfectie <ol><li> COS-7 cellen worden gekweekt in Dulbecco Modified Eagle&#39;s medium (DMEM) aangevuld met 4,5 g / l glucose en 10% foetaal bovine serum (FBS). </li><li> Plasmide transfectie wordt uitgevoerd met Lipofectamine volgens de fabrikant (Invitrogen). </li></ol> 2. Fluorescentie microscopische analyse van het celoppervlak SNARE Expression <ol><li> De dag voor transfectie, 3 x 10 4 COS-7 cellen worden gezaaid op steriele 12 mm dekglaasjes (Fisher Scientific) in 24-well platen. </li><li> Voor v-cellen in elk putje, 0,25 ug van het plasmide dat codeert tTA (ptet-Off, CLONTECH) wordt gecotransfecteerd met 0,25 ug van de plasmiden die uitdrukking omgedraaid vamps. </li><li> Voor T-cellen in elk putje wordt 0,25 ug van het plasmide dat codeert TRE-LacZ (pBI-G, CLONTECH) gecotransfecteerd met 0,25 ug elk van de plasmiden die uitdrukking omgedraaid SNAP-25 en syntaxins 1 of 4. </li><li> 24 uur na transfection de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde in PBS + + (PBS aangevuld met 0,1 g / l CaCl2 en 0,1 g / l MgCl2) gedurende 10 min, en vervolgens geblokkeerd in 10% FBS in PBS + + gedurende 30 minuten. </li><li> De cellen worden geïncubeerd gedurende 1,5 uur met anti-myc monoklonaal antilichaam 9E10 (neat hybridoma supernatant). </li><li> Na vier wasbehandelingen met PBS + + worden de cellen geïncubeerd gedurende 1 uur met FITC-geconjugeerde secundaire antilichamen (Jackson Immunoresearch Laboratories) bij een verdunning van 1:500. </li><li> Na vier wasbehandelingen met PBS + +, de gelabelde cellen worden gemonteerd verlengen Gold antifade reagens (Invitrogen). </li><li> Confocale beelden worden verzameld op een Olympus laser scanning confocale microscoop. De beelden worden verwerkt met de Adobe Photoshop-software. </li></ol> 3. FACS-analyse van het celoppervlak SNARE Expression <ol><li> De dag voor transfectie, 2 x 10 5 COS-7 cellen worden uitgezaaid in elk putje van 6-well platen. </li><li> 24 uur na transfection met de gespiegelde SNARE, ptet-Off en pBI-G plasmiden worden cellen gefixeerd met 1% paraformaldehyde in PBS + + gedurende 15 min, en vervolgens geblokkeerd in 10% FBS in PBS + + gedurende 15 minuten. </li><li> De cellen worden geïncubeerd met het anti-myc monoklonaal antilichaam 9E10 gedurende 60 minuten. </li><li> Na drie wassingen met PBS + + de cellen gelabeld met FITC-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:200 verdunning) gedurende 45 minuten. </li><li> Na drie wassingen met PBS + +, worden de cellen van de platen geschraapt met een celschraper. </li><li> 15.000 cellen worden geanalyseerd met een FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences). De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elk monster wordt verkregen met de CellQuest Pro software. </li></ol> 4. Enzymatische celfusie Assay <ol><li> De dag voor transfectie, 1,2 x 10 6 COS-7 cellen worden uitgezaaid in elke 100 mm weefselkweekplaat en 2 x 10 5 COS-7 cellen worden uitgezaaid in elk putje van 6-well platen. </li><li> Voor v-cellen, 0,5 - 5 ug elk Flipped VAMP plasmide wordt gecotransfecteerd met 5 ug ptet-Off in de cellen in elke 100 mm kweekschaal. Controle cellen gecotransfecteerd met de lege vector pcDNA3.1 (+) en ptet-Off. De N-glycosylering van vamps 1, 4, 5, 7 en 8, tunicamycine voorkomen (10 ug / ml) opgenomen in celkweekmedium gedurende transfectie. </li><li> Voor T-cellen in elk putje van de 6-well platen, 1 ug omgedraaid SNAP-25 plasmide en pBI-G worden gecotransfecteerd met 0,5 ug omgedraaid syntaxin1 plasmide of 0,05 ug plasmide syntaxin4 omgedraaid. </li><li> 24 uur na transfectie worden de v-cellen losgemaakt van de kweekschalen enzymvrije Cell Dissociation Buffer (Invitrogen). Losgemaakte cellen worden geteld met een hemacytometer en geresuspendeerd in HEPES gebufferde DMEM aangevuld met 10% FBS, 6,7 ug / ml tunicamycine en 0,67 mM DTT. </li><li> 4,8 x 10 5 geresuspendeerd v-cellen toegevoegd aan elk putje reeds de T-cellen. </li><li> Na 6, 12 of 24 uur rat 37 ° C in 5% CO2 </sub&gt;, de expressie van β-galactosidase wordt gemeten met de β-galactosidase enzym Assay System met Reporter Lysis Buffer volgens de fabrikant (Promega). In het kort worden de cellen tweemaal gewassen met PBS en gelyseerd in de Reporter Lysis Buffer. Cellysaten worden gemengd met een gelijk volume 2 x Assay Buffer. Als blanco controle wordt het Reporter Lysis Buffer gemengd met de Assay Buffer 2 ×. </li><li> Na 90 min wordt de colorimetrische reactie gestopt door toevoeging van 1 M natriumcarbonaat. </li><li> Absorptie bij 420 nm gemeten met een HITACHI 100-40 spectrofotometer. </li></ol>

<ol><li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+intracellular+protein+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li>
<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs--engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li>
<li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREpins%3A+minimal+machinery+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li>
<li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li>
<li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li>
<li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+%28VAMPs%29+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238(2010).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li>
<li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+%5Bsee+comments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li>
<li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li>
<li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+synaptobrevin%2FVAMP+homologous+protein+%28VAMP5%29+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li>
<li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li>
<li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobrevin%2C+a+novel+synaptobrevin%2FVAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De oorspronkelijke celfusie assay 6 bepaalt SNARE gemedieerde fusie events met fluorescentiemicroscopie. Hier beschrijven we een innovatieve assay die SNARE gemedieerde fusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase en spectrometrische metingen. Met deze assay, we routinematig analyseren 15-20 v-en t-SNARE combinaties in een experiment. Met behulp van flowcytometrie om SNARE expressie te meten op het celoppervlak, we titreren de expressie niveaus van vamps en vergelijken hun membra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van reagens en uitrusting </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> COS-7 cellen </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> tunicamycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T7765-5MG </td></tr><tr><td> ptet-Off </td><td> Clontech </td><td> K1620-A </td></tr><tr><td> pBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6,150-1 </td></tr><tr><td> lipofectamine </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> Enzym-vrije cel dissociatie oplossing </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> Konijn anti-Tet-repressor polyklonaal antilichaam </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> FITC-geconjugeerd ezel anti-muis IgG (H + L) </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> Laser scanning confocale microscoop </td><td> Olympus </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> FACSCalibur flowcytometer </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> β-galactosidase enzym Assay System met Reporter Lysis Buffer </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> Model 100-40 UV-VIS spectrofotometer </td><td> Hitachi </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

analyse van snare gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie assay

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

De interacties van SNARE (s oluble N-ethylmaleimide-gevoelige factor een ttachment eiwit re Ceptor) eiwitten op blaasjes (v-snaren) en op doel membranen (t-snaren) katalyseren intracellulaire vesikels fusie 1-4. Reconstitutie testen zijn essentieel voor het ontleden van het mechanisme en de regeling van SNARE-gemedieerde membraanfusie 5. In een celfusie assay 6,7 worden SNARE eiwitten ectopisch tot expressie op het celoppervlak. Deze &quot;omgedraaid&quot; SNARE eiwitten schijf cel-cel fusie waaruit blijkt dat SNAREs volstaan ​​om celmembranen fuseren. Omdat de celfusie test is gebaseerd op microscopische analyse is minder efficiënt bij gebruik van meerdere v-en t-SNARE interacties kwantitatief te analyseren. Hier beschrijven we een nieuwe assay 8 dat SNARE gemedieerde fusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase. Tweecomponenten van het Tet-Off genexpressiesysteem 9 gebruikt als uitleessysteem: de tetracycline-gecontroleerde transactivator (tTA) en een reporter plasmide dat het LacZ gen onder controle van de tetracycline-response element (TRE-LacZ) codeert. We transfecteren tTA in COS-7 cellen die v-SNARE eiwitten op het celoppervlak (v-cellen) en transfecteren TRE-LacZ gedraaid in COS-7 cellen die t-SNARE eiwitten omgedraaid op het celoppervlak (T-cellen) . SNARE-afhankelijke fusie van het v-en T-cellen resulteert in de binding van tTA met TRE de transcriptie-activering van LacZ en expressie van β-galactosidase. De activiteit van β-galactosidase wordt gekwantificeerd met een colorimetrische methode absorptie bij 420 nm. De blaasjes-geassocieerde membraaneiwitten (vamps) zijn v-SNAREs die zich in verschillende post-Golgi vesiculaire compartimenten 10-15. Uitspreken vamps 1, 3, 4, 5, 7 en 8 op hetzelfde niveau vergelijken we de membraanfusieactiviteiten met de enzymatische assay celfusie. Op basis van spectrometrische meting, deze test biedt een kwantitatieve benadering voor het analyseren van SNARE-gemedieerde membraanfusie en voor high-throughput studies.

Om een ​​kwantitatieve celfusie test te ontwikkelen, wij profiteren van de sterke transcriptionele activering door de binding van tTA aan TRE. In afwezigheid van tTA, transcriptie van het lacZ gen in TRE-LacZ zwijgt. Wanneer tTA aanwezig is, bindt aan het TRE en activeert de transcriptie van LacZ. Figuur 1 toont een stroomdiagram van de enzymatische assay celfusie. tTA getransfecteerd in v-cellen die v-SNARE eiwitten op het celoppervlak en TRE-LacZ getransfecteerd in ...

We hebben een celfusie test die SNARE-gemedieerde membraanfusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase.

Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

De interacties van SNARE-eiwitten (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) op blaasjes (v-SNARE's) en op doelmembranen ...

Het algemene doel van deze procedure is om snare-gemedieerde celfusie-gebeurtenissen te kwantificeren via de geactiveerde expressie van bèta-galactoside. Dit wordt bereikt door eerst v- en t-snare-eiwitten ectopisch tot expressie te brengen op het oppervlak van cost-zeven-cellen. De volgende stap van de procedure is het combineren van de cellen die v-snare-eiwitten tot expressie brengen met cellen die t-snare-eiwitten tot expressie brengen.Dit resulteert in snare-gemedieerde celgefuseerde versmelting en de geactiveerde expressie van bèta-galactoside. Uiteindelijk wordt de door celversmelting geïnduceerde bèta-galactoside-activiteit gemeten met behulp van een spectrofotometer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de microscopische SAL-regio-assay, is dat er meerdere snare-combinaties geanalyseerd kunnen worden.Kwantitatief gezien kan deze methode worden toegepast om het mechanisme en de regulatie van SNARE-gemedieerde membraanfusie te begrijpen. Het kan daarnaast worden ingezet voor high-throughput studies. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Na Hassan, postdoc, en David Humphrey, technicus uit mijn laboratorium, de dag vóór de transfectielading.Bereid 24-wells platen voor met glazen dekglasjes van 12 millimeter; bereid twee wells voor voor elke combinatie van cellen die unieke plasmiden tot expressie brengen in het experiment op deze dekglasjes. Zaai 30.000 cost seven-cellen, gekweekt in DMEM aangevuld met 4,5 g/L glucose en 10% FBS, uit voor transfectie. Voeg aan elke well een kwart microgram van het TTA-plasmide en één set expressieplasmiden toe aan de V-cellen.Om de T-cellen te transfecteren met de vamps als eiwitten van belang, voegt u een kwart microgram van het plasmide toe dat TRE lacks Z codeert, samen met de complementaire set plasmiden die de betreffende eiwitten coderen; in dit geval snap 25, syntaxine 1 en syntaxine 4. Transfect nu de cost 7 met lipfectamine volgens de instructies van de fabrikant en kweek de cellen gedurende 24 uur. Fixeer de cellen 24 uur na de transfectie gedurende 10 minuten in gesupplementeerd paraformaldehyde. Spoel de cellen na de fixatie drie keer af met PBS++, en blokkeer de cellen vervolgens gedurende 30 minuten met gesupplementeerd FBS.Na het blokkeren worden de cellen geïncubeerd met het anti-mic monoklonale antilichaam Nine E 10 gedurende 30 minuten. Na vier wasbeurten met PBS++ worden de cellen gedurende één uur geïncubeerd met FITC-geconjugeerde secundaire antilichamen in een verdunning van 1:500. Na nog eens vier wasbeurten met PBS++ worden de gelabelde cellen ingebed in een commercieel verkrijgbaar anti-fade reagens.De cellen zijn nu klaar voor confocale microscopie. Zaai de dag vóór transfectie 1,2 miljoen Cos-7 cellen in elke 100 millimeter weefselkweekschaal en 200.000 Cos-7 cellen in elke put van zes-putsplaten voor elke plasmidcombinatie die geanalyseerd moet worden. Bereid één put voor en kweek de cellen gedurende 24 uur. Voeg de volgende dag de plasmiden voor de transfectie toe. Transfectteer voor V-cellen een plasmid dat het gefuseerde eiwit van belang tot expressie brengt en vijf microgram pTet-Off aan de cellen in elke 100 millimeter cultuur.Co-transfect controlecellen in een 100 millimeter kweekschaal met een lege vector en P te off in dezelfde relatieve concentraties als de V-cellen. Nadat alle plasmiden aan de V-cellen en controlecellen zijn toegevoegd, voeg tcom mycin toe aan deze wells om de N-glycosylering van vamps te voorkomen. Co-transfect in elke well van de zes-wells platen de T-cellen met één microgram PBIG met de complementaire plasmiden die de eiwitten van belang tot expressie brengen.Transfect nu de cost seven-cellen met lip volgens de instructies van de fabrikant. Kweek de cellen vervolgens gedurende 24 uur; detach de V-cellen 24 uur na de transfectie van hun kweekschaaltjes met enzymvrije cel-dissociatiebuffer. Begin hiermee door de cellen één keer te wassen met 20 milliliters PBS.Voeg vervolgens vijf milliliter enzymvrije dissociatiebuffer toe. Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur zullen de cellen loslaten door kort en krachtig op de plaat te tikken; controleer onder de microscoop of ze zijn losgekomen. Als minder dan de helft van de cellen is losgekomen, wacht dan nog vijf minuten en tik opnieuw op de plaat.Zet de incubatie in de detachementbuffer voort totdat meer dan de helft van de cellen is losgekomen. Tel vervolgens de V-cellen met een hemocytometer. Resuspendeer de V-cellen daarna op een concentratie van ongeveer 480.000 cellen per milliliter in aangevulde heis-buffer DMEM.Voeg nu één milliliter resuspenderde V-cellen toe aan elke put die T-cellen bevat en plaats de platen terug in de incubator. Na zes, 12 of 24 uur co-cultivatie van de cellen, was deze met PBS en voeg lysisbuffer toe. Schraap vervolgens de cellen uit de putten en breng ze over in buisjes voor centrifugatie.Breng na centrifugatie het supernatant over naar een nieuwe buis en meet de expressie van bèta-galactoside met behulp van een commercieel beschikbare assay volgens de instructies van de fabrikant; zorg er tijdens dat protocol voor dat de cholera-metrische reactie na 90 minuten wordt gestopt door het toevoegen van één molar natriumcarbonaat om de resultaten te scoren. Meet de absorbentie bij 420 nanometer op een spectrofotometer. Wanneer CO7-cellen werden getransfecteerd met flipped snare-plasmiden, werden flipped snare-eiwitten tot expressie gebracht aan het celoppervlak.Flowcytometrie werd gebruikt om de expressieniveaus van snare-eiwitten aan het celoppervlak te meten. Om hun membraanfusiecapaciteiten te kunnen vergelijken, moesten de vamps op hetzelfde niveau tot expressie worden gebracht. Daarom werd de concentratie van elk geflipt snare-plasmide dat bij de transfectie werd gebruikt, getitreerd en geoptimaliseerd voor transfectie.Onder deze omstandigheden werden vamp 1, 3, 4, 5, 7 en 8 en syntaxine 1 en 4 respectievelijk op hetzelfde niveau aan het celoppervlak tot expressie gebracht; de neuronale SNARE's die synaptische exocytose mediëren werden gebruikt om de haalbaarheid van de assay te testen. Inderdaad, wanneer V-cellen die vamp 2 tot expressie brachten en T-cellen die SYNTAXIN 1 en SNAP 25 tot expressie brachten werden gecombineerd, werd een robuuste bèta-galactosidase-expressie gedetecteerd. Echter, wanneer vamp 2 of SNAP 25 niet tot expressie werden gebracht, werd alleen de basisactiviteit van bèta-galactosidase gedetecteerd, wat aangeeft dat celfusie en de expressie van bèta-galactosidase afhankelijk zijn van interacties tussen v- en t-SNARE's. Over het algemeen vertoonden SYNTAXIN 1, SNAP 25, vamp 1, vamp 3 en vamp 8 vergelijkbare en de hoogste fusieactiviteiten.In tegenstelling hiermee suggereert de basale bèta-GAL-activiteit dat de proteïnecombinatie geen membraanfusie stimuleert, zoals wel het geval is tussen vamp vijf en SYNTAXIN een. Snap 25. Bij het uitvoeren van de enzymatische fusie-assay is het belangrijk om te onthouden tunicamycine toe te voegen om N-glycosylering van esna-proteïnen te voorkomen en DTT toe te voegen om de vorming van disulfidebruggen tussen esna-proteïnen te voorkomen.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van de cel-fusie-assay.

analysis-snare-mediated-membrane-fusion-using-an-enzymatic-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Methode voor het meten van virale Fusion Kinetics bij de Single Particle Level

In deze video laten we zien efficiënte electrofusie van...

Cel Electrofusion gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie

Mitochondriale fusie werd gemeten door het bijhouden van de gelijkschakeling van de photoconverted matrix-gerichte GFP over het mitochondriale netwerk in de tijd. Tot dusver kon slechts een cel worden onderworpen aan een uur lang kinetische analyse tegelijk. Wij presenteren een methode die meet gelijktijdig meerdere cellen, waardoor versnelling van het proces van gegevensverzameling.

Een snellere, met hoge resolutie, MTPA-GFP-gebaseerde Mitochondriale Fusion Assay verwerven Kinetische gegevens van meerdere cellen parallel geschakeld Met behulp van confocale microscopie

Lichtmicroscooptechnieken gekoppeld aan biochemische analyses verduidelijken de betrokkenheid van SNARE-gemedieerde exocytose bij netrine-afhankelijke axonvertakking. Deze combinatie van technieken maakt identificatie mogelijk van moleculaire mechanismen die axonvertakking en celvormverandering controleren.

Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

Hier presenteren we een protocol om enkele, SNARE-bemiddelde fusie gebeurtenissen tussen liposomen en ondersteund dubbellagen in microfluïdische kanalen met gepolariseerde TIRFM, met 'single molecule gevoeligheid en ~ 15 msec tijdsresolutie te detecteren. Lipide en oplosbare lading afgifte kan gelijktijdig worden gedetecteerd. Liposoom grootte, lipide diffusie, en fusie porie eigenschappen worden gemeten.

SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie

Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.

Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Hier presenteren we de gedetailleerde procedure van een onlangs ontwikkelde protease assay platform met behulp van N-terminal hexahistidine/maltose-bindend-proteïne en fluorescente proteïne-gesmolten recombinante substraten gekoppeld aan het oppervlak van nikkel-nitrilotriacetic zure magnetische agarose kralen. Een latere in-gel-analyse van de monsters van de assay gescheiden door elektroforese van het gel van natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide is ook gepresenteerd.

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

De biologische membraan fusie wordt gekatalyseert door gespecialiseerde fusie proteïnen. Het meten van de fusogenic eigenschappen van eiwitten kan worden bereikt door lipide mengen assays. We presenteren een methode voor het zuiveren van recombinant fruitvliegje atlastin, een eiwit dat bemiddelt homotypic fusie van de ER, reconstitutie aan voorgevormde liposomen, en testen voor fusie capaciteit.

Reinigingsmiddel-bijgestaan reconstitutie van recombinant fruit vliegje Atlastin in liposomen voor lipide-mengt analyses

Dit protocol beschrijft een confocale beeldvormingstechniek om drie fusiemodi in boviene bijnierchromaffinecellen te detecteren. Deze fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporiën worden geopend en gesloten, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij gesmolten blaasjeskrimp betrokken zijn.

Confocale microscopie om drie modi van fusieporiëndynamiek in bijnierchromaffinecellen te meten

Leer een enzymatische celfusie-assay voor SNARE-gemedieerde membraanfusie met β-galactosidase als reporter. Deze methode kwantificeert fusiegebeurtenissen en analyseert meerdere SNARE-combinaties in COS-7-cellen.

Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

Meer video's verkennen