Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

Het algemene doel van deze procedure is om snare-gemedieerde celfusie-gebeurtenissen te kwantificeren via de geactiveerde expressie van bèta-galactoside. Dit wordt bereikt door eerst v- en t-snare-eiwitten ectopisch tot expressie te brengen op het oppervlak van cost-zeven-cellen. De volgende stap van de procedure is het combineren van de cellen die v-snare-eiwitten tot expressie brengen met cellen die t-snare-eiwitten tot expressie brengen.

Dit resulteert in snare-gemedieerde celgefuseerde versmelting en de geactiveerde expressie van bèta-galactoside. Uiteindelijk wordt de door celversmelting geïnduceerde bèta-galactoside-activiteit gemeten met behulp van een spectrofotometer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de microscopische SAL-regio-assay, is dat er meerdere snare-combinaties geanalyseerd kunnen worden.

Kwantitatief gezien kan deze methode worden toegepast om het mechanisme en de regulatie van SNARE-gemedieerde membraanfusie te begrijpen. Het kan daarnaast worden ingezet voor high-throughput studies. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Na Hassan, postdoc, en David Humphrey, technicus uit mijn laboratorium, de dag vóór de transfectielading.

Bereid 24-wells platen voor met glazen dekglasjes van 12 millimeter; bereid twee wells voor voor elke combinatie van cellen die unieke plasmiden tot expressie brengen in het experiment op deze dekglasjes. Zaai 30.000 cost seven-cellen, gekweekt in DMEM aangevuld met 4,5 g/L glucose en 10% FBS, uit voor transfectie. Voeg aan elke well een kwart microgram van het TTA-plasmide en één set expressieplasmiden toe aan de V-cellen.

Om de T-cellen te transfecteren met de vamps als eiwitten van belang, voegt u een kwart microgram van het plasmide toe dat TRE lacks Z codeert, samen met de complementaire set plasmiden die de betreffende eiwitten coderen; in dit geval snap 25, syntaxine 1 en syntaxine 4. Transfect nu de cost 7 met lipfectamine volgens de instructies van de fabrikant en kweek de cellen gedurende 24 uur. Fixeer de cellen 24 uur na de transfectie gedurende 10 minuten in gesupplementeerd paraformaldehyde. Spoel de cellen na de fixatie drie keer af met PBS++, en blokkeer de cellen vervolgens gedurende 30 minuten met gesupplementeerd FBS.

Na het blokkeren worden de cellen geïncubeerd met het anti-mic monoklonale antilichaam Nine E 10 gedurende 30 minuten. Na vier wasbeurten met PBS++ worden de cellen gedurende één uur geïncubeerd met FITC-geconjugeerde secundaire antilichamen in een verdunning van 1:500. Na nog eens vier wasbeurten met PBS++ worden de gelabelde cellen ingebed in een commercieel verkrijgbaar anti-fade reagens.

De cellen zijn nu klaar voor confocale microscopie. Zaai de dag vóór transfectie 1,2 miljoen Cos-7 cellen in elke 100 millimeter weefselkweekschaal en 200.000 Cos-7 cellen in elke put van zes-putsplaten voor elke plasmidcombinatie die geanalyseerd moet worden. Bereid één put voor en kweek de cellen gedurende 24 uur. Voeg de volgende dag de plasmiden voor de transfectie toe. Transfectteer voor V-cellen een plasmid dat het gefuseerde eiwit van belang tot expressie brengt en vijf microgram pTet-Off aan de cellen in elke 100 millimeter cultuur.

Co-transfect controlecellen in een 100 millimeter kweekschaal met een lege vector en P te off in dezelfde relatieve concentraties als de V-cellen. Nadat alle plasmiden aan de V-cellen en controlecellen zijn toegevoegd, voeg tcom mycin toe aan deze wells om de N-glycosylering van vamps te voorkomen. Co-transfect in elke well van de zes-wells platen de T-cellen met één microgram PBIG met de complementaire plasmiden die de eiwitten van belang tot expressie brengen.

Transfect nu de cost seven-cellen met lip volgens de instructies van de fabrikant. Kweek de cellen vervolgens gedurende 24 uur; detach de V-cellen 24 uur na de transfectie van hun kweekschaaltjes met enzymvrije cel-dissociatiebuffer. Begin hiermee door de cellen één keer te wassen met 20 milliliters PBS.

Voeg vervolgens vijf milliliter enzymvrije dissociatiebuffer toe. Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur zullen de cellen loslaten door kort en krachtig op de plaat te tikken; controleer onder de microscoop of ze zijn losgekomen. Als minder dan de helft van de cellen is losgekomen, wacht dan nog vijf minuten en tik opnieuw op de plaat.

Zet de incubatie in de detachementbuffer voort totdat meer dan de helft van de cellen is losgekomen. Tel vervolgens de V-cellen met een hemocytometer. Resuspendeer de V-cellen daarna op een concentratie van ongeveer 480.000 cellen per milliliter in aangevulde heis-buffer DMEM.

Voeg nu één milliliter resuspenderde V-cellen toe aan elke put die T-cellen bevat en plaats de platen terug in de incubator. Na zes, 12 of 24 uur co-cultivatie van de cellen, was deze met PBS en voeg lysisbuffer toe. Schraap vervolgens de cellen uit de putten en breng ze over in buisjes voor centrifugatie.

Breng na centrifugatie het supernatant over naar een nieuwe buis en meet de expressie van bèta-galactoside met behulp van een commercieel beschikbare assay volgens de instructies van de fabrikant; zorg er tijdens dat protocol voor dat de cholera-metrische reactie na 90 minuten wordt gestopt door het toevoegen van één molar natriumcarbonaat om de resultaten te scoren. Meet de absorbentie bij 420 nanometer op een spectrofotometer. Wanneer CO7-cellen werden getransfecteerd met flipped snare-plasmiden, werden flipped snare-eiwitten tot expressie gebracht aan het celoppervlak.

Flowcytometrie werd gebruikt om de expressieniveaus van snare-eiwitten aan het celoppervlak te meten. Om hun membraanfusiecapaciteiten te kunnen vergelijken, moesten de vamps op hetzelfde niveau tot expressie worden gebracht. Daarom werd de concentratie van elk geflipt snare-plasmide dat bij de transfectie werd gebruikt, getitreerd en geoptimaliseerd voor transfectie.

Onder deze omstandigheden werden vamp 1, 3, 4, 5, 7 en 8 en syntaxine 1 en 4 respectievelijk op hetzelfde niveau aan het celoppervlak tot expressie gebracht; de neuronale SNARE's die synaptische exocytose mediëren werden gebruikt om de haalbaarheid van de assay te testen. Inderdaad, wanneer V-cellen die vamp 2 tot expressie brachten en T-cellen die SYNTAXIN 1 en SNAP 25 tot expressie brachten werden gecombineerd, werd een robuuste bèta-galactosidase-expressie gedetecteerd. Echter, wanneer vamp 2 of SNAP 25 niet tot expressie werden gebracht, werd alleen de basisactiviteit van bèta-galactosidase gedetecteerd, wat aangeeft dat celfusie en de expressie van bèta-galactosidase afhankelijk zijn van interacties tussen v- en t-SNARE's. Over het algemeen vertoonden SYNTAXIN 1, SNAP 25, vamp 1, vamp 3 en vamp 8 vergelijkbare en de hoogste fusieactiviteiten.

In tegenstelling hiermee suggereert de basale bèta-GAL-activiteit dat de proteïnecombinatie geen membraanfusie stimuleert, zoals wel het geval is tussen vamp vijf en SYNTAXIN een. Snap 25. Bij het uitvoeren van de enzymatische fusie-assay is het belangrijk om te onthouden tunicamycine toe te voegen om N-glycosylering van esna-proteïnen te voorkomen en DTT toe te voegen om de vorming van disulfidebruggen tussen esna-proteïnen te voorkomen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van de cel-fusie-assay.