Name: In vivo Imaging Systems (IVIS) Detectie van een neuro-invasieve encefalitisch Virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Leer een methode voor het detecteren van centrale zenuwstelselinfecties door een alfavirus met behulp van bioluminescente technologie en IVIS-beeldvorming. Dit vermindert het aantal dieren en versnelt vaccinonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Instituut voor Translational Sciences UTMB-NIH subsidie ​​1UL1RR029876-01 en Alisha Prather voor haar hulp bij videobewerking voor dit manuscript.

1. Animal Voorbereiding <ol><li> Animal aankomst: Bij aankomst in het dier bioveiligheid niveau 2 (ABSL2) faciliteiten, zodat de dieren een minimum van 2 dagen om te acclimatiseren aan hun nieuwe omgeving. Na deze rusttijd controleert de dieren voor hun gezondheid en algehele fysieke verschijning te evalueren. <ol><li> Bij het gebruik fluorescent reporters is het belangrijk om alle proefdieren op alfalfa dieet plaatsen om de hoeveelheid GI autofluorescentie en achtergrond signaal. </li></ol></li><li> Shave dieren: Om de bioluminescente signaal gedetecteerd van de schedel tijdens beeldvorming te verbeteren; scheren de hoofden van alle dieren. Verdoven dieren met een mengsel van zuurstof en isofluraan verdampt. Als de dieren zijn volledig verdoofd, gebruik maken van elektrische tondeuse om hun hoofd te scheren. Eenmaal klaar met scheren, de terugkeer van de dieren naar hun kooien en observeren volledig herstel van de gevolgen van de anesthesie. </li><li> Bio Medic gegevensSystems (BMDS) transponder inbrengen (plaatsvinden na scheren van de muizen terwijl de dieren volledig verdoofd): Voor een minder invasieve middelen om de temperatuur implantaat subcutaan volgen een voorgeprogrammeerde BMDS draadloze transponder in de dorsale regio van elke muis. Deze transponders kunnen voor draadloze identificatie en temperatuurregistratie. Na implantatie van de transponder, toepassen veterinaire-grade weefselhechtmiddel op de wond. </li><li> Baseline collection: voor infectie opnemen basislijn temperatuur en het gewicht voor alle dieren. Verzamel bloed voor plaquereductieneutralisatietest (PRNT) analyse door middel van retro-orbitale (RO) bloeden, terwijl de muizen onder narcose. Na bloedafname, van toepassing veterinaire antibiotica oogzalf om potentiële secundaire bacteriële infectie te verminderen. Dit basislijn collection moet worden aangevuld met aandacht voor het aantal keren dat de dieren onder narcose gebracht door stress op de muizen. Toekomst RO collecties should worden afgerond na de belichting, terwijl de muis is nog steeds onder narcose. De maximum bloed vanuit een RO moet ongeveer 200 pl. </li><li> Infectie: Place muizen verdoofd zoals eerder beschreven. Inoculeer via intranasale route met een dosis van 5x10 tot 5x10 6 7 pfu TC83-Luciferase in een totaal volume van 40 pl verdund fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door intranasale infectie. Na infectie, plaatst u de muizen in hun huisvesting kooi en observeer herstel. </li></ol> 2. Animal Imaging Disclaimer: Houd muizen binnen hun wooneenheid, de bioveiligheid kast (BSC), of de XIC insluiting doos te allen tijde. De goedgekeurde BSC&#39;s voor dit protocol zijn een klasse II Type B1 of B2. <ol><li> Injecteer alle dieren met 10 ui per gram lichaamsgewicht van intraperitoneale (IP) luciferin in een concentratie van 15 mg / ml. <ol><li> Ampligen muizen die moeten worden injected IP in een dosis van 12,5 mg / kg lichaamsgewicht bij -4 uur na infectie of +48 uur na infectie op basis van hun groep. </li></ol></li><li> Vóór injectie met luciferine, scheiden de muizen in groepen van drie om een ​​juiste maat in de XIC-3 containment box waarborgen. <ol><li> Voor imaging gebruik maken van oculaire zalf / smeermiddel om het drogen van de cornea te voorkomen gedurende de procedure. </li></ol></li><li> Open de LivingImage software en druk op Initialiseren van het grafisch venster te bereiden; set automatische besparing, belichtingstijd op auto (belichtingstijd op auto is een nieuwe functie van de LivingImage software 3.2 en nieuwer), veld te bekijken naar C, en het filter te openen; veld gezien is gebaseerd op het aantal muizen u imaging en filter kan worden geoptimaliseerd desgewenst voor andere beeldbewerkingsprojecten. </li><li> Controleer of de lucht koolstoffilters niet zijn verstreken, de zuurstof tank vol is, en de isofluraan reservoir gevuld is. Plaats smalle stroken van elektrische tape in de XIC-3 isolation box die helpt bij het verminderen van de verplaatsing van dieren tijdens het belichten. </li><li> Injecteer de muizen met luciferine IP zoals beschreven in paragraaf 2.1 en plaats binnen de Isofluraan inductie kamer (met deksel open) gedurende 3-5 minuten. </li><li> Na 5 min, het deksel van de inductiekamer en start de stroom van isofluraan. De verdoving werkt bij ongeveer 3-5% van de zuurstoftoevoer ingesteld op ongeveer 2,0 L / min. Eenmaal volledig onbewust wacht dan nog 30 sec en breng de muizen om de XIC-3 isolatie box. Zorg ervoor dat de bioveiligheid kast wordt benut zorgt voor het veilig opruimen van isofluraan als deze procedure zal omvatten het verlies van isofluraan van de inductie kamer (de IVIS apparaat bevat zijn eigen Passief Fair canisters en de XIC-3 containment box direct aangesloten op de in / uit-aansluitingen tot ingeperkt verdoving stroom te verzekeren). <ol><li> Breng de muizen op basis van chip / groepsnummer in de XIC-3 isolatie box met de isofluraan connector een aangeslotend te openen. Plaats de muizen, zodat ze zijn neergelegd in sternale decubitus met kop zachtjes rusten op de tape strips. </li></ol></li><li> Veeg de XIC insluiting doos met ethanol, spray handen en onderkant van de XIC-3 met CaviCide, en over te dragen aan de IVIS beeldvorming kamer. Sluit de anesthesie op de insluiting box eenmaal in de beeldeenheid. </li><li> Na 10 min na de injectie van luciferine, het imago van de muizen door het levende beeld software. </li><li> Na de eerste beeldvorming met een open filter, start een DLIT 3-dimensionale beeldvorming met behulp van de sequentie-analyse en Image Wizard setup voor bioluminescente vuurvlieg luciferase. Dit proces zal imaging 4-5 min en moet ten een gezichtsveld relevant voor het aantal gewenste muizen. <ol><li> Ex-vivo analyse mogelijk na autopsie en verzameling van de hersenen. Plaats de hersenen op een steriele petrischaal, druppelen 50 tot 100 ul van voorraad luciferine op de top, en de plaats binnen het imaGing doos. </li></ol></li><li> Finalize een tweede open filter beeld op 15 tot 17 minuten na infectie na voltooiing van DLIT beeldvorming. Zorg ervoor dat sequentie-analyse is uitgeschakeld en het gezichtsveld en filter instellingen worden teruggezet naar de vorige instellingen. </li></ol> 3. Terug Muizen en data-analyse <ol><li> Schakel de isofluraan vaporizer en terug over te dragen van de XIC insluiting in om de bioveiligheid kast. </li><li> Plaats de muizen in hun wooneenheid, sluit de top, spuit de buitenkant met geschikt desinfectiemiddel, en plaats terug op de behuizing rek. <ol><li> Zorg ervoor dat muizen zijn volledig hersteld van anesthesie. </li></ol></li><li> Herhaal de bovenstaande procedure als het experiment vereist tot beeldvorming is voltooid. </li><li> Desinfecteer de BSC, het afsluiten van de apparatuur, en de overdracht van alle data naar een extern laboratorium locatie voor verdere analyse. </li><li> Analyseer de gegevens en het genereren van 3-dimensionale beelden op basis van IVIS resultaten utilizing de LivingImage software. <ol><li> Zorg ervoor dat het beeld in de juiste richting en verlichting / kleurbalans is ingesteld. Binnen de Tool Palette de opties omvatten Beeld aanpassen, Correcties, Image Information en ROI Tools. </li><li> Maak gebruik van ROI vormen om specifieke signaalsterkte op basis van locatie te identificeren. </li><li> Reconstructie van de oppervlakte topografie om de muis lichaam te markeren, te initialiseren 3D DLIT reconstructie, en het gebruik van lineaire fit aan het orgel kaart ingesteld op de topografische reconstructie. </li></ol></li><li> Verdere virale titratie analyse kan worden uitgevoerd door middel van inzameling van bloed en organen. Titratie in deze studie werd afgerond door middel van homogenisatie van hersenweefsel in gemodificeerde adelaars medium (MEM). Het homogenaat werd serieel verdund en we besmet een plaat met 6 putjes van Vero cellen gedurende 1 uur. De cellen werden bedekt met een overlay agarose/2xMEM 1,5% en gedurende 2 dagen bij 37 °. Cellen werden gefixeerd met 10% formaline gedurende 30 min en gekleurd metkristalviolet. </li></ol>

<ol><li>Steele, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Neurovirulence+and+Tissue+Tropism+of+Wild-type+and+Attenuated+Strains+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Administered+by+Aerosol+in+C3H%2FHeN+and+BALB%2Fc+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology+Online%22%5BJournal%5D)">Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice.</a> Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).</li>
<li>Ludwig, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+neurovirulence+of+attenuated+and+non-attenuated+strains+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).</li>
<li>Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Neuroinvasion+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse.</a> Virology. , 208-662 (1995).</li>
<li>Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficient+packaging+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus-specific+RNAs+into+viral+particles+is+determined+by+nsP1-3+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis.</a> Virology. 344, 315-327 (2006).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+non-invasive+imaging+of+alphaviral+brain+infection%3A+Reducing+animal+numbers+and+morbidity+to+identify+efficacy+of+potential+vaccines+and+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals.</a> Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).</li>
<li>Cook, S. H., Griffin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase+Imaging+of+a+Neurotropic+Viral+Infection+in+Intact+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals.</a> J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nat. Med. 4, 245-247 (1998).</li>
<li>Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Monkeypox+Viruses+Pathogenesis+in+Mice+by+In+Vivo+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 4, e6592(2009).</li>
<li>Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Imaging+Reveals+Systemic+Dissemination+of+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+in+the+Absence+of+Interferon+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors.</a> J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , (1959).</li>
<li>Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+mouse+model+for+the+evaluation+of+potential+antiviral+compounds%3A+results+with+Venezuelan+equine+encephalomyelitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).</li>
<li>Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pegylated+Alpha+Interferon+Is+an+Effective+Treatment+for+Virulent+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+and+Has+Profound+Effects+on+the+Host+Immune+Response+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection.</a> J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Hoewel dit protocol omvat de aspecten imaging in vivo analyse is belangrijk om de bioluminescent vector herkennen als een sleutelfactor voor toekomstige studies. Onze gebruik van TC83, een verzwakte vaccinstam VEEV als vector voor expressie van luciferase zodat grote hoeveelheden van het enzym worden geproduceerd door de hoge replicatie van het virus in het CNS zoals eerder beschreven 1-4. Terwijl de toevoeging van een tweede subgenome promotor en het luciferase gen resulteert in verdere verzwakking ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isofluraan </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenogen IVIS System (Spectrum) </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XGI-8-gas Anesthesie System </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XIC-3 Containment Box </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LivingImage 4.0 Software </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Telemetrie / identificatie-chips </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td> IPTT-300 </td><td> Animal ID en TemperARD </td></tr><tr><td> BD Integra 1ml TB spuit met 26 gx 3/8 &quot;naald </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305279 </td><td></td></tr><tr><td> Vet Bond weefsel lijm </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9259532 </td><td></td></tr><tr><td> Vetropolycin oogzalf </td><td> Webster Veterinary Products </td><td> 78444656 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing 1X </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> BMDS Chip Reader </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td> DAS-7007S </td><td></td></tr><tr><td> DAS-host-software </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td></td><td> Wordt gebruikt om probe informatie te downloaden </td></tr></tbody></table>

in vivo imaging systems (ivis) detectie van een neuro-invasieve encefalitisch virus

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Moderne ontwikkelingen in de imaging-technologie aan te moedigen verdere ontwikkeling en verfijning in de manier waarop virale onderzoek wordt uitgevoerd. In eerste instantie voorgesteld door Russel en Burch in Hume&#39;s 3 V&#39;s (vervanging, vermindering, verfijning), het gebruik van diermodellen in wetenschappelijk onderzoek is onder constante druk om nieuwe methoden te identificeren om het gebruik van dieren te verminderen, terwijl het verbeteren van de wetenschappelijke nauwkeurigheid en snelheid. Een belangrijke uitdaging om Hume&#39;s opdrachtgevers is echter hoe te zorgen voor de studies zijn statistisch nauwkeurige terwijl het verminderen van dierziekten morbiditeit en totale aantallen. Werkzaamheid studies vereisen momenteel een groot aantal dieren om te worden beschouwd als statistisch significant en leiden vaak tot hoge morbiditeit en mortaliteit eindpunten voor de identificatie van immuunbescherming. We gebruik in vivo imaging systemen (IVIS) in combinatie met een vuurvlieg bioluminescent enzym aan de invasie van het centraal zenuwstelsel (CNS) geleidelijk volgen door een lingenphalitic virus in een muizenmodel. Typisch, de ziekte relatief langzaam echter virusreplicatie is snel, vooral in de CNS en kan leiden tot een vaak fatale afloop. Na intranasale infectie van muizen met de TC83-Luc, een verzwakt Venezolaanse equine encephalitis virus stam aangepast voor expressie een luciferasegen, kunnen wij virusreplicatie visualiseren in de hersenen ten minste drie dagen vóór de ontwikkeling van klinische ziekteverschijnselen. Gebruik te maken van CNS invasie als een belangrijke encefalitisch ontwikkeling van de ziekte eindpunt zijn we in staat om snel therapeutische en vaccin bescherming te identificeren tegen TC83-Luc infectie voordat de klinische symptomen zich ontwikkelen. Met IVIS technologie zijn we in staat om de snelle en nauwkeurige testen van drugs therapeutica en vaccins te tonen terwijl het verminderen van het aantal dieren en morbiditeit.

Van een genetisch gemodificeerde virus, TC83-Luciferase zagen we een toename bioluminescent signaalsterkte als de virus replicatie beweegt van de nasale regio in de centrale CNS (figuur 1). Door de hoge virale replicatie rate verwachten we hoge bioluminescent signaal (figuur 2A) afhankelijk van de vector en het dier immuunrespons op de vector zien. We verwachten dat dit signaal verhoging blijven een piek tussen dagen 5-7 na infectie in combinatie met virale replicatie piek in het CNS <s...

Gebruik makend van luciferase en in vivo imaging-systemen (IVIS) als een roman middel om ziekte-eindpunten identificeren voordat klinische ontwikkelingen voordoen. IVIS heeft ons toegestaan ​​om te visualiseren in real time de invasie van encefalitisch virussen over meerdere dagen, met een meer accurate ziekte model voor toekomstige studie. Het is ook toegestaan ​​om het potentieel beschermende kenmerken van antivirale middelen en vaccins sneller identificeren dan op dit moment gebruikte dierlijke modellen. De mogelijkheid om individuele dieren te gebruiken over meerdere tijdstippen zorgt voor minder dierenbenodigdheden, kosten en de overall morbiditeit voor de dieren gebruikt zorgen voor een meer humane en meer wetenschappelijke middelen van de ziekte studie.

In vivo Imaging Systems (IVIS) Detectie van een neuro-invasieve encefalitisch Virus

Moderne vorderingen in beeldvormingstechnologie stimuleren verdere ontwikkeling en verfijning van de wijze waarop viraal onderzoek wordt uitgevoerd. Aanvankelijk voorgesteld door ...

Vandaag presenteren wij een methode om een centrale zenuwinfectie door een alfavirus binnen Aurine-soorten aan te tonen met behulp van bioluminescentie-technologie. Deze methode maakt gebruik van TC 83, de levend-verzwakte vaccinstam van het Venezolaanse equine encefalitisvirus met een ingevoegd vuurvlieg-luciferasegen, waarmee we de replicatie van het virus kunnen volgen naarmate het zich verspreidt in de gastheer. In een onlangs gepubliceerd artikel over vaccins tonen we onze capaciteit aan om de invasie van het CZS te visualiseren en dit te gebruiken als studie-eindpunt voor het testen van de effectiviteit van vaccins en antivirale behandelingen voordat er klinische ziekteverschijnselen optraden in onze controlegroepen.Hallo, mijn naam is Allison Ard en ik ben diertechnoloog in de hoog-containmentlaboratoria hier aan de University of Texas Medical Branch. Het werk dat u in deze video zult zien is uitgevoerd door mij, Michael Patterson, een promovendus hier aan UTMB, en Katie Taylor, een senior promovendus in ons laboratorium. Al het getoonde werk is uitgevoerd in het Galveston National Laboratory met volledige IACUC-goedkeuring, in overeenstemming met de regelgeving voor milieugezondheid en veiligheid, onder gebruik van in vivo beeldvormingssystemen.IVUS stelt ons in staat om het aantal dieren in onze studies te verminderen, dankzij de mogelijkheid om dagelijks beelden van elk individueel dier te genereren. Vandaag krijgt u een overzicht van de voorbereiding van het dier, inclusief het scheren van het voorhoofd, BMDS, chippen, intranasale infectie met TC 80 D, intraperitonele injectie van Lucifer voor beeldvorming, en het hanteren en overbrengen van het dier vanuit de Biocon-behuizing naar de beeldvormingsbox. Vanuit de beeldvormingsbox brengen we het dier over naar de Caliper-beeldvormingsunit, gevolgd door het eigenlijke beeldvormingsproces, twee- en driedimensionale beeldvorming, en het terugbrengen van de dieren na beeldvorming naar de veiligheidskast.Ons dierenlaboratorium beschikt over één biosafety cabinet klasse II waarin alle in vitro- en in vivo-procedures worden uitgevoerd. Naast de biosafety cabinet staat de Cali ivu spectrum met een aangesloten isofluraanverdampert en computerinterface. De isofluraanverdampert maakt een precieze toediening van inhalatieanesthesie mogelijk en is een snellere en veiligere methode om muizen te anesthetiseren in vergelijking met injecteerbare anesthetica.De XI C3 beeldvormingsbox is een afgesloten eenheid voorzien van HEPA-filtratie, waardoor we dieren veilig binnen het laboratorium kunnen transporteren. In eerdere studies hebben we vastgesteld dat zeedieren met donkerder haar een geremd bioluminescent signaal vertonen dat direct gerelateerd is aan hun vacht. We raden aan om het voorhoofd en de snuit te scheren om de signaaldetectie gedurende de gehele studie te verbeteren.Gedurende onze studies maken we gebruik van BMDS-transponderchips, waarmee we draadloos temperatuurgegevens en identificatiegegevens van de dieren kunnen verzamelen. Deze verzamelmethode zorgt voor minder handelingen met de dieren en minder stress. De vacht wordt met een ethanol-doekje mat gemaakt en de chip wordt subcutaan ingebracht.Terwijl de muis onder narcose is. We anesthetiseren de dieren voor intranasale infectie. Zodra ze bewusteloos zijn, houden we elk dier voorzichtig bij de nekvel vast met de snuit naar boven gericht.Pipetteer 20 µL in elke neusgat. Voor een totaal van 40 µL per muis krijgen de dieren de tijd om tussen de druppels door te ademen, zodat het inoculum zich niet verzamelt in de achterkant van de keel. Voor de IP-injectie van luciferine worden de dieren voorzichtig vastgehouden door in de nekvel te knijpen en de staart onder de pink en ringvinger te plaatsen.Luciferian wordt vervolgens in de buikholte van elk dier geïnjecteerd om maximale diffusie van Lucifer in de bloedbaan te waarborgen. We wachten vijf tot 10 minuten na de injectie voordat de muizen worden geanestheseerd voor beeldvorming. Zodra ze zijn geanestheseerd, kunnen de dieren naar de XI C3 beeldvormingscontainer worden verplaatst.Hun koppen worden voorzichtig op stroken zwarte isolatietape geplaatst, wat craniale verplaatsing vermindert. Omdat ademhalingsbewegingen het beeldvormingsproces zullen verstoren bij alle beeldvorming, inclusief driedimensionale beeldvorming, zorgen volledige ledemaatprotractie en een buikligging in de XI C3-unit voor een optimale topografische mapping. Wanneer alle dieren correct zijn geplaatst, wordt de XI C3-box afgesloten en de buitenkant van de unit met ethanol afgeveegd; desinfecteer de handen voordat de box uit de veiligheidskast wordt gehaald.Bij het plaatsen van de XI C3-box in de ivus Imaging Unit dient u ervoor te zorgen dat de toevoer- en afvoerlijnen voor het anesthetische middel correct zijn aangesloten op de HEPA-filters die aan de XI C3-box zijn bevestigd. Controleer daarnaast of het beeldvormingsraster de muizen volledig omsluit voordat u de imaging unit sluit en de toevoer van anesthesie inschakelt. Zodra u de Living Image-software heeft geopend, dient u in te loggen met uw gebruikersnaam.Daarna initialiseert u de IVUS-eenheid. Wanneer de IVUS-eenheid gereed is, wordt de temperatuurindicator groen, wat gebeurt rond -90 °C. We gebruiken een automatische detectie voor de belichtingstijd en laten alle overige instellingen op hun standaardwaarden staan.Zodra het beeld is verkregen, verschijnt het op het hoofdscherm. U heeft de optie om regio's van interesse (regions of interest) te selecteren, waarmee u automatisch specifieke gebieden met een sterke signaalsterkte kunt detecteren. Daarnaast kunt u handmatig gebieden van sterkte invoeren die u wilt visualiseren en die het systeem niet automatisch identificeert voor driedimensionale beeldvorming.Selecteer een optie voor de sequentie-instelling, selecteer de imaging wizard en selecteer bioluminescentie. Zodra bioluminescentie is geselecteerd, klikt u op DLIT en vervolgens op next. Controleer onder DLIT of de juiste reporter is geselecteerd voor US Firefly en klik op Next.Zorg ervoor dat alle informatie correct is. In dit geval is het onderwerp van de beeldvorming een muis met een gezichtsveld van maat C. Klik vervolgens op 'volgende', waarna er een set van vijf afbeeldingen wordt gegenereerd met variërende golflengten, van vijf 60 nanometers tot zes 40.In ons eerste beeld hebben we ook de topografische afbeelding die is gemaakt om driedimensionale beeldvorming mogelijk te maken. Vervolgens klikken we op 'acquire sequence'. Zodra alle vijf de beelden zijn verkregen, kunnen we de instellingen van de beeldvormingssequentie sluiten en beginnen met de manipulatie van ons beeld.Om een driedimensionale reconstructie te ontwikkelen, moeten we eerst zorgen voor een nauwkeurige topografische kaart. We stellen de muis als subject in met een dorsale oriëntatie en reconstrueren deze. We markeren de muis zelf, waarbij we voorkomen dat er delen van het achtergrondgebied van de box worden gemarkeerd.Klik op volgende; dit gedeelte kan enige tijd in beslag nemen, afhankelijk van uw afbeelding en het gebruikte computersysteem. Zodra dit voltooid is, beschikt u over een topografische kaart van het lichaam van de muis. Vervolgens gaat u over naar de DLIT 3D-reconstructie.Zorg ervoor dat de drempelwaarden en de weefseleigenschappen correct zijn ingesteld. Selecteer start bij de hersenen en selecteer vervolgens reconstruct. Dit is een ander tijdspunt, wat afhankelijk van uw computersysteem enige tijd kan duren.Wanneer u klaar bent, verschijnt er een signaal op uw topografische kaart. Klik vervolgens op 3D-tools, klik op registratie, orgaanatlas en selecteer voor ons vrouwelijke dorsale oriëntatie. We kunnen vervolgens de opaciteit van de organen aanpassen om deze beter te kunnen zien; klik op lineaire fit om de topografische kaart op de digitale organenset af te stemmen.We kunnen alle organen verwijderen, behalve de organen die we daadwerkelijk willen identificeren met het signaal voor het US-brein. Met deze technologie kunnen we ook een driedimensionale video maken, waardoor we kunnen roteren, de opaciteit kunnen wijzigen, het beeld kunnen aanpassen, inzoomen, organen kunnen verwijderen en uiteindelijk weer uitzoomen. Wanneer de beeldvorming is voltooid, schakelt u de isofluraanverdamper uit en koppelt u de XI C3-containmentbox los.Plaats de verzegelde doos terug in de biosafety cabinet en verwijder de muizen voorzichtig van de elektrische tape. Voor langere imagingduur kunnen de muizen binnen de ABS L twee worden opgewarmd door middel van correcte hantering met handschoenen.We observeren de dieren nauwgezet om volledig herstel van de anesthesie te waarborgen. We willen Dr. Pessler en iedereen in het laboratorium bedanken die heeft bijgedragen aan dit project. Daarnaast willen we het Galveston National Laboratory bedanken voor het ter beschikking stellen van de faciliteiten en apparatuur, evenals het Institute for Translational Sciences voor de financiering van dit onderzoek.

in-vivo-imaging-systems-ivis-detection-neuro-invasive-encephalitic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

BioImaging methoden die worden gebruikt om cellen biodistributie van nanodeeltjes te beoordelen zijn van toepassing voor therapeutische en diagnostische controle van nanoformulated verbindingen. De werkwijzen die hierin beschreven zijn gevoelig en specifiek wanneer beoordeeld door histologische coregistration. De methodieken voor een translationeel weg van knaagdier voor de menselijke toepassingen.

Geregistreerd BioImaging van nanomaterialen voor diagnostische en therapeutische monitoring

Human cytomegalovirus (HCMV) infectie van pasgeborenen is een belangrijke oorzaak van mentale retardatie, maar de moleculaire gebeurtenissen die tot virus-geïnduceerde pathogenese zijn nog steeds slecht begrepen. Om de dynamiek van de hersenen infectie te onderzoeken, hebben we aangepast...

Gebruik van<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging aan de progressie van de Experimentele Mouse Cytomegalovirusinfectie in Pasgeborenen Monitor

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor intracerebroventriculaire en intravasculaire injectie van virale deeltjes of fluorescente microbeads in de neonatale muizenhersenen. Het lokalisatiepatroon van het virus en de nanodeeltjes kan worden gedetecteerd door microscopische evaluatie of door in situ hybridisatie.

Intracerebroventriculaire en Intravasculaire Injectie van virusdeeltjes en TL Microkralen in de Neonatale Brain

We beschrijven een muismodel van experimentele cerebrale malaria en laten zien hoe inflammatoire en microvasculaire pathologie in vivo kunnen worden gevolgd met behulp van magnetische resonantie beeldvorming.

In vivo Tracking van Oedema Ontwikkeling En Microvasculaire Patologie In Een Model Van Experimentele Cerebrale Malaria Met Magnetic Resonance Imaging

Hier presenteren we een protocol voor het creëren van een immunocompetente ICR (Institute of Cancer Research) Murine model van infectie van het centrale zenuwstelsel om de ontwikkeling van neuropathie weer te geven. Monitoring van acute virale encefalitische stoornissen door identieke ziekte scores kan worden uitgevoerd voor het tonen van Denguevirus-geïnduceerde neuropathie in vivo.

Een Muriene model van dengue virus-geïnduceerde acute virale encefalitis-achtige ziekte

Hier presenteren we protocollen om te onderzoeken op bijzondere waardeverminderingen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele autoimmune encefalomyelitis in vivo. Wij ingaan specifiek op het bepalen van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit en gelatinase activiteit die betrokken zijn bij migratie van leukocyten in de glia-limitans.

Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo

Roman, immunokleuring-compatibele weefsel clearing technieken zoals de ultieme 3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen toestaan de 3D-visualisatie van rabiësvirus herseninfectie en zijn complexe cellulaire omgeving. Dikke, antilichaam gelabelde hersenweefsel segmenten zijn optisch transparant gemaakt om de beeld diepte te vergroten en 3D-analyse mogelijk te maken door confocale laser scanning microscopie.

Hoge-resolutie 3D-beeldvorming van rabiës virus infectie in solvent-geklaard hersenweefsel

Dit protocol is gericht op het genereren van direct geherprogrammeerde interneuronen in vivo, met behulp van een AAV-gebaseerd virale systeem in de hersenen en een FLEX synapsin-driven GFP Reporter, die het mogelijk maakt voor celidentificatie en verdere analyse in vivo.

In vivo directe herprogrammering van ingezeten gliacellen in interneuronen door intracerebrale injectie van virale vectoren

Miniscope in vivo calcium imaging is een krachtige techniek om neuronale dynamica en microcircuits te bestuderen in vrij gedragende muizen. Dit protocol beschrijft het uitvoeren van hersenoperaties om goede in vivo calciumbeeldvorming te bereiken met behulp van een miniscoop.

Stereotaxische virale injectie en gradiënt-index lensimplantatie voor diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming

We presenteren een nieuwe benadering voor twee-fotonmicroscopie van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide-nanodeeltjes aan glioblastoom in een muismodel.

Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

Leer een methode voor het detecteren van centrale zenuwstelselinfecties door een alfavirus met behulp van bioluminescente technologie en IVIS-beeldvorming. Dit vermindert het aantal dieren en versnelt vaccinonderzoek.

In vivo Imaging Systems (IVIS) Detectie van een neuro-invasieve encefalitisch Virus

Meer video's verkennen