Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging
12 december 2012
Een werkwijze wordt beschreven voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in voorafbepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex. Eerst wordt intrinsieke optisch imaging gebruikt om een functionele kaart te verkrijgen. Dan twee-foton microscopie wordt gebruikt om het etiket en beeld neuronen binnen een micro-domein van de kaart.
Het algemene doel van deze procedure is om micro-domeinen in een functionele kaart nauwkeurig te targeten om de structuur en functie van neuronen met hoge resolutie te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst intrinsieke signaalbeeldvorming uit te voeren over een groot gebied van de cortex om een kaart van het te bestuderen stimuluskenmerk te verkrijgen. De tweede stap is om de precieze locatie in de kaart te bepalen die voor hoge resolutie naar fotonbeeldvorming moet worden gericht.
Vervolgens, na zorgvuldige positionering van de met fluorescerende kleurstof geladen pipet, worden neuronen gelabeld met de fluorescerende marker. Ten slotte worden hoge resolutie naar fotonbeelden van neuronale reacties of structuren verzameld. Uiteindelijk kan een intrinsieke signaalkenmerkkaart worden gebruikt om een gebied van belang te vinden, zoals een oriëntatie-pinwheel singulariteit, dat vervolgens kan worden gericht voor studie met één neuronresolutie.
Het grote voordeel van dit protocol is dat men de cortex op verschillende ruimtelijke schalen kan beeldvormen met behulp van dezelfde microscoopopstelling met slechts een paar snelle aanpassingen aan het systeem. Dit stelt iemand in staat om deze technieken te combineren om de grove resolutie intrinsieke signaalkaart te gebruiken als een gids voor het kiezen van een gebied van neuronen om te labelen met fluorescerende sondes voor hoge resolutiebeeldvorming. Het dier is geanesthetiseerd volgens een door het institutionele dierenverzorgingscomité goedgekeurd protocol, en de schedel is blootgelegd en schoongemaakt.
Tandcementmix is gebruikt om een roestvrij stalen kopplaat met een rechthoekige opening in het midden aan de schedel te bevestigen. Een metalen kamer bovenop de kopplaat dient als reservoir voor beeldvorming met de wateronderdompeling objectieflens. De kopplaat is bevestigd op een XY-trap met behulp van metalen palen.
Gebruik een tandboor om een groot gebied bot binnen de rechthoekige opening van de kopplaat te verdunnen. Breng botwas aan om af en toe bloeden te stoppen. Het dunne gebied moet zich uitstrekken tot voorbij de grenzen van de geplande craniotomie.
Boor vervolgens een twee bij twee millimeter vierkante omtrek in het bot voor de craniotomie. Spoel de kamer regelmatig met vers kunstmatig cerebraal spinaal vocht om botsplinters te verwijderen en warmtedissipatie naar de onderliggende cortex te minimaliseren. Til nu het bot op met een nummer drie forceps.
Gebruik een nummer vijf forceps en Vana veerscharen om de bovenste lagen van de dura te verwijderen, waarbij de onderste laag intact blijft. De laatste laag dura is transparant en er moeten duidelijk peilsvaatjes zichtbaar zijn doorheen. Breng een druppel warm 2% aeros aan, opgelost in A CSF, en plaats onmiddellijk een dekglas over de craniotomie.
Eerst een gelfoam gedrenkt in A CSF rond de buitenkant van het dekglas om te voorkomen dat de agros uitdroogt tijdens intrinsieke signaalbeeldvorming. Bevestig vervolgens de intrinsieke signaalbeeldvorming CCG-camera aan de standaard C-mount poort bovenop de twee foto microscoop en plaats een verlichtingslichtbron op de luchttafel nabij de XY-trappositie en bevestig de lichtgeleider boven de craniotomie. Trek de primaire dichroic en de spiegel onder de seamount-poort terug zodat het gereflecteerde rode licht dat nodig is voor intrinsieke signalen direct van de craniotomie naar de CCD-camera zal passeren.
Plaats een infraroodfilter in de lichtbaan om te voorkomen dat de cortex opwarmt. Plaats vervolgens een filter dat groen licht doorlaat en neem een digitaal referentiebeeld op van de corticale oppervlaktebloedvaten. Vervolgens beweegt u de Z-focus naar 500 micrometer onder het corticale oppervlak.
Vervang de groene filter door een rode filter om de cortex te verlichten voor het meten van intrinsieke signalen. Zorg ervoor dat de cortex uniform verlicht is. Bescherm de craniotomie tegen het licht geproduceerd door de visuele stimulusweergave en presenteer een reeks visuele stimuli en neem reflectiedatabeelden op om een oriëntatiekaart te genereren Binnen 10 minuten, verzamel gegevens die overeenkomen met vier herhalingen van een reeks van acht stimuli met vier oriëntaties en twee richtingen voor elke oriëntatie.
Analyseer nu de intrinsieke signaalgegevens om een valse oriëntatiekleurenkaart te genereren zoals hier te zien is. Selecteer vervolgens potentiële doelgebieden voor tweefotonlabeling van neuronen. Bijvoorbeeld oriëntatiepinwheel singulariteiten punten in de kaart waar alle voorkeursoriëntaties samenkomen.
Vervolgens overlapt u de oriëntatiekaart en het beeld van de corticale oppervlaktevaten en gebruikt u de lay-out van functionele domeinen en de locatie van grote oppervlaktevaten om een doel te selecteren, waarbij u locaties met grote bloedvaten en arteriën vermijdt. Bereid de fluorescerende D-oplossingen voor en trek een lange taps toelopende pipet volgens de instructies in het geschreven protocol. Laad vijf microliter van de kleurstofmix in de pipet.
Verwijder vervolgens de laatste laag dura om de pipetinbrenging te vergemakkelijken en verkrijg de hoogste kwaliteit tweefotonbeelden zoals geïllustreerd door dit diagram. De pipet moet onder een hoek van 30 graden in de cortex worden gedreven om tussen de kamer en het objectief te passeren. Daarom zal de corticale oppervlaktelocatie van de pipetinbrengpositie niet direct boven het gerichte gebied van belang liggen.
Om bijvoorbeeld een doelgebied 200 micron onder het corticale oppervlak te labelen, zal de pipetinbrengpositie op het corticale oppervlak ongeveer 350 micron lateraal ten opzichte van de doelpositie zijn. Verplaats de XY-trap om de corticale oppervlakte-inbrengpositie onder het 20 x of 40 x objectief te centreren. Zodra de inbrengpositie onder het objectief is gecentreerd, verhoogt u de Z-positie van het objectief met twee millimeter.
Schakel vervolgens de groene epifluorescentielicht in en visualiseer de rode Alexa-kleurstof in de pipet en beweeg de pipet totdat de punt boven de corticale oppervlakte-inbrengpositie ligt. Terwijl u de pipetpunt bekijkt door de oculairen van de microscoop met helderveldverlichting, laat u de pipet zakken tot
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het labelen van neuronen met fluorescerende kleurstoffen in specifieke functionele micro-domeinen van de neocortex. De aanpak maakt gebruik van intrinsieke signaal optische beeldvorming om een functionele kaart te creëren, gevolgd door twee-foton microscopie voor hoog-resolutie beeldvorming van neuronen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Neuroimaging
- Cellulaire biologie
Achtergrond
- Het begrijpen van neuronale structuur en functie is cruciaal in de neurowetenschap.
- Functionele kaarten helpen bij het identificeren van gebieden van belang in de cortex.
- Fluorescente labeling maakt gedetailleerde beeldvorming van neuronale reacties mogelijk.
- Twee-foton microscopie levert hoog-resolutie beelden van neuronen op.
Doel van het onderzoek
- Om micro-domeinen in de neocortex te targeten voor gedetailleerd onderzoek.
- Om de structuur en functie van neuronen op hoge resolutie te onderzoeken.
- Om intrinsieke signaal beeldvorming te gebruiken voor het in kaart brengen van stimulus kenmerken.
Gebruikte methoden
- Intrinsieke signaal optische beeldvorming om een functionele kaart van de cortex te maken.
- Identificatie van specifieke locaties binnen de kaart voor verder onderzoek.
- Positionering van een pipette geladen met fluorescerende kleurstof voor neuron labeling.
- Twee-foton microscopie voor het vastleggen van hoog-resolutie beelden van neuronen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labeling van neuronen in getargeteerde micro-domeinen.
- Hoog-resolutie beelden onthullen gedetailleerde neuronale structuren.
- Intrinsieke signaal kaarten leiden effectief de targetering van gebieden van belang.
- Aangetoonde mogelijkheid om neuronale reacties op single neuron resolutie te bestuderen.
Conclusies
- De methode maakt nauwkeurige targetering en beeldvorming van neuronen mogelijk.
- Het combineren van functionele mapping met hoog-resolutie beeldvorming verbetert het begrip van neuronale functie.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verschillende studies in de neurowetenschap.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables precise targeting of functional micro-domains in cortical maps, supporting mechanistic de-risking in neuroscience target validation. By linking intrinsic signal mapping with two-photon imaging, it provides predictive confidence in neuronal structure-function relationships. The approach enhances translational continuity from discovery to preclinical studies in sensory processing research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking neuronal activity to specific functional micro-domains in sensory cortex.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct visualization of dendritic spines and axonal projections in targeted neuronal populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by validating target engagement at subcellular resolution within disease-relevant circuit contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neuronal systems for downstream compound screening by labeling defined micro-domains with fluorescent indicators.
- Operational Value: Ensures assay standardization through reproducible targeting of orientation pinwheel singularities using intrinsic signal maps as fiducial references.
- Scalability: Facilitates platform reuse across visual, somatosensory, and auditory functional maps using the same microscope setup.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling longitudinal tracking of structural changes in targeted neuronal micro-domains.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target validation by correlating functional map features with single-neuron structural phenotypes.
- Predictive Confidence: Enhances risk-adjusted advancement decisions through quantitative dendritic spine and axon density measurements in defined cortical layers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates early discovery biology with lead identification by providing spatially resolved neuronal labeling for mechanistic follow-up studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise targeting of functional micro-domains identified via intrinsic signal imaging.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized neuronal labeling protocols that yield consistent fluorescent signal across targeted cortical spheres.
- Analytics: Generates quantitative readouts including dendritic spine density, axonal projection patterns, and calcium transient amplitudes for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling structural phenotyping in disease-relevant sensory processing circuits.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across sensory modalities due to dependence on intrinsic signal mapping rather than modality-specific probes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through direct correlation of functional map features with subcellular neuronal structure.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility by using intrinsic signal maps as spatial guides for pipette targeting across experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neuronal target engagement studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through quantitative structural metrics derived from labeled neuronal micro-domains.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intrinsic signal optical imaging, two-photon microscopy, and micropipette-based neuronal labeling techniques.
- Needs a two-photon microscope equipped for intrinsic signal imaging, fluorescent dye excitation, and Z-depth control for cortical targeting.
- Demands cross-team standardization of coordinate systems between imaging and electrophysiology or molecular biology workflows.
- Involves adaptation considerations across model systems due to variations in cortical thickness, vascularization, and functional map organization.
- Practical limitations include dependence on intact cortical surface vasculature for intrinsic signal signal-to-noise ratio and susceptibility to motion artifacts during prolonged imaging sessions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Surgical Preparation of the Animal
2:57
Intrinsic Signal Optical Imaging
5:10
Bulk Loading of Fluorescent Calcium Indicators
8:35
Single-cell Electroporation of Fluorescent Dyes
9:09
Results: Targeted Labeling of Neurons Visualized using Two-photon Imaging
10:48
Conclusion
