Name: Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Leer hoe u neuronen labelt in specifieke functionele microdomeinen van de neocortex met intrinsieke signaalbeeldvorming en twee-fotonmicroscopie. Deze methode combineert functionele mapping met hoge-resolutiebeeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Eye Institute R01EY017925 en R21EY020985 en financiering van de Dana &amp; Whitehall Foundations naar PK We hebben ook Matthew Petrella bedanken voor hulp bij chirurgische procedures; Grace Dion voor het traceren van de dendrieten getoond in figuur 5A en Pratik Chhatbar voor commentaar op het manuscript.

1. Chirurgische Voorbereiding <ol><li> Laten anesthesie en permanent toezicht op de hartslag, eindigen getijden CO 2, EEG, en de temperatuur. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Medische Universiteit van South Carolina en waren gebaseerd op die we eerder gepubliceerde 9,15. </li><li> Maak de dorsale oppervlak van de schedel door het snijden van de huid met een scalpel. Prepareer het bindweefsel bovenop het bot met behulp van een Brudon curette. Reinig het bot met behulp van katoen getipt applicators en een gaasje. Breng bot was (indien nodig) naar de schedel, af en toe bloeden te stoppen door kleine afgezant aderen. </li><li> Bevestig een titanium of roestvrij staal kopplaat de schedel (over het gebied waar de craniotomie worden uitgevoerd) met tandheelkundig cement gemengd met zwarte verf (zie Materialen). Een rechthoekige opening in het midden van de kopplaat geeft toegang tot de craniotomie en optische. Bevestig een metalen kamer bovenop de kopplaat. Deze kamer dient als vloeistofreservoir voor beeldvorming met water immersie objectief. </li><li> Bevestig de kopplaat op een xy tafel met metalen palen. </li><li> Dunnen een groot deel van het bot in de rechthoekige opening van de kopplaat door een tandartsboor. Het gebied dat moet worden uitgedund moet zich uitstrekken tot ver buiten de grenzen van de geplande craniotomie. De dikke schedel van knaagdieren zoogdieren moet verdund als hoge-resolutie beelden worden verkregen van de neocortex omdat bij de craniotomie site, de dikte van bot zal de dikte van de agarose bepalen tussen het dekglaasje en neocorticale oppervlak (zie hieronder) . </li><li> Boor een 2 x 2 mm vierkante omtrek in het bot de craniotomie. Periodiek Spoel de kamer met verse kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) aan het bot scherven te verwijderen en het minimaliseren van de warmteafvoer van de onderliggende cortex. Breng bot was als nodig is, om af en toe bloeden te stoppen. </li><li> Lift het bot flap met een # 3 tang. </li><li> Verwijder alles behalve de onderste laag van dura met een fijn pincet (# 5CO) en Vannas lente schaar. De dura in knaagdieren zoogdieren dik en ondoorzichtig maar kan worden verwijderd in verschillende lagen. Bloeden is zeldzaam, maar kan worden gestopt met Gelfoam en eventuele bloedresten moet voorzichtig worden verwijderd van de overblijvende laag dura behulp van een tang en spoelen met ACSF. De laatste laag dura is transparant en pial vaartuigen duidelijk zichtbaar doorheen. Het verlaten van deze laatste laag van dura intact tijdens een intrinsiek signaal beeldvorming zal de slaagkans van laden van bulkgoederen fluorescerende calcium indicatoren voor de daaropvolgende twee-foton beeldvorming fase van het experiment (zie Discussie). </li><li> Breng een druppel van warme 2% agarose (opgelost in ACSF) en onmiddellijk een dekglaasje plaats over de craniotomie. Controleer de craniotomie opdat respiratoire en cardiovasculaire pulsaties minimaal zijn middels een chirurgische dissectiemicroscoop of de lenzen van de twee-foton microscoop in bright-field-modus. </li></ol> 2. Intrinsieke Signal Optical Imaging <ol><li> Voeg gel-schuim doordrenkt met ACSF rond de buitenkant van de coverglass de agarose uitdroogt tijdens intrinsieke signaal imaging. </li><li> Bevestig de intrinsieke signaal imaging CCD camera de standaard C-mount poort aan de bovenzijde van de twee-foton microscoop (Figuur 1). Plaats de belichtingslichtbron de lucht tafel bij de kruistafel (Figuur 1A). Positioneer en bevestig de lichtgeleiders over de craniotomie en gitaarkop plaat / kamer (Figuur 1B). Zodat Schuif de primaire dichroïsche spiegel en onder de C-mount poort die gereflecteerd rood licht nodig voor intrinsieke signalen rechtstreeks overgaan van de craniotomie de CCD camera (figuur 1C-D). Met behulp van de 4x lucht doelstelling (0,13 NA, 17 mm WD), een 2 x 2 mm gezichtsveld is beschikbaar voor intrinsieke signaal beeldvorming. </li><li> Plaats een warmte filter in de light pad naar de cortex voorkomen verwarming. Gebruik een filter dat groen licht (546 nm centrum λ) en neem een ​​digitale referentiebeeld van de corticale oppervlak bloedvaten passeert. </li><li> Verplaats de aandacht z tot 500 urn onder het corticale oppervlakte. Een rood filter (630 nm center λ) de cortex verlichten meten intrinsieke signalen. Plaats de lichtgeleiders zodanig dat de corticale oppervlak gelijkmatig verlicht. Scherm de craniotomie van het licht geproduceerd door de visuele stimulus display. Presenteer een opeenvolging van visuele stimuli en opnemen reflectie gegevens beelden. Een oriëntatie kaart binnen 10 min genereren verzamelen overeenkomend met 4 herhalingen van een sequentie van 8 stimuli (4 oriëntaties en twee richtingen voor elke oriëntatie). </li><li> Analyseer de intrinsieke signaal gegevens naar een valse kleuren oriëntatie kaart te genereren. Selecteer potentieel doelwit regio&#39;s voor twee-foton etikettering van neuronen, bijvoorbeeld oriëntatie pinwheel singulariteiten - punten in de kaart waaralle preferente oriëntaties convergeren (Figuur 2A). Overlay de oriëntatie kaart en het beeld van de corticale oppervlak vaatstelsel (Figuur 2B-C). Gebruik de indeling van functionele domeinen en de locatie van grote oppervlakteschepen selecteren van een doel, het vermijden plaatsen met grote bloedvaten en arteriolen 15. </li></ol> 3. Bulk Laden van TL-Calcium-indicatoren <ol><li> Bereid een oplossing van 20% Pluronic / DMSO door 1 g Pluronic in 5 pi DMSO. Verwarm het mengsel op 60 ° C gedurende 10 min om volledig op te lossen Pluronic. Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 4 pi van het Pluronic / DMSO mengsel in een 50 ug flesje met fluorescente calcium indicator Oregon Green 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Voeg 1 pl van een rode kleurstof (Alexa Fluor 594, 2 mM stock-oplossing) en 35 pi pipetoplossing (zie Materialen) voor een eindconcentratie van 1 mM OGB-1 uur. Sonificeer de oplossing voor ½ uur ineen waterbad gekoeld en centrifugeer met een 0,45 urn filter om onzuiverheden te verwijderen. </li><li> Trek een lange taps pipet met een buitendiameter tip diameter van 2,0-2,5 micrometer. Plaats 5 pl van het kleurstofmengsel in de pipet. </li><li> Verwijder de laatste laag aan dura pipet insertie en het verkrijgen van de hoogste kwaliteit beelden twee-foton. </li><li> Bepaal de identificatie op de corticale oppervlak dat de pipet worden geplaatst om zijn doel in corticale laag 2/3. De vooraf bepaalde corticale doel een pinwheel singulariteit in de richting kaart (Figuur 2). De pipet wordt gedreven in de cortex op een hoek van 30 ° te geven tussen de kamerwand en het doel. Dus de doelregio 200 urn onder het corticale oppervlak label, wordt de pipet invoerpositie aan de corticale oppervlak ongeveer 350 urn dwars op de beoogde positie (Figuur 3 AB). </li><li> Verplaats de kruistafel (waarop het dier en de pipette micromanipulator worden geplaatst) om naar het midden van de corticale oppervlak invoerpositie onder de doelstelling (figuur 3C). Gebruik een 20x of 40x objectief met een werkafstand (WD) van ten minste 3 mm (zie materialen), zodat de pipet gemakkelijk de cortex voeren zonder het doel of het been langs de wand van de craniotomie. Zodra de invoerpositie wordt gecentreerd onder de doelstelling, verhogen de Z-positie van het doel met 2 mm (figuur 3D). Met de groene epi-fluorescentie ingeschakeld om de rode Alexa kleurstof zichtbaar in de pipet, met de diagonale as van de micromanipulator de pipet bewegen totdat de punt is gericht (en gericht) onder het objectief direct boven de corticale oppervlak invoerpositie ( figuur 3E). </li><li> Laat de pipet verticaal (langs de z-as) tot de pipet bereikt het corticale oppervlak (figuur 3F), terwijl continu het bekijken van de pipetpunt via de OCUlars van de microscoop. Met behulp van bright-field verlichting, de corticale oppervlak bloedvaten en de resterende meningeale membranen (pia en arachnoidea) zijn goed zichtbaar als de pipet het corticale oppervlak benadert. Als de pipet niet bereikt het gewenste item positie, breng de pipet en opnieuw te kalibreren richten op basis van de vasculaire monumenten op het corticale oppervlak. </li><li> Verwijder de doelstelling, lont overmatig hersenvocht uit de craniotomie en droog de aangrenzende bot met behulp van niet-pluizend absorptie speren. Breng een druppel warm 3% agarose (opgelost in ACSF) de cortex dat zichtbaar is door de craniotomie (Figuur 3G) stabiliseren. In niet-knaagdieren, 3% agarose moet pulsaties temperen voor succesvolle opname van fluorescerende kleurstoffen door neuronen. Voor intrinsieke optisch imaging slechts 2% agarose is nodig omdat de combinatie van 2% agarose en de coverglass de noodzakelijke stabiliteit. Hier wordt geen coverglass gebruikt voor het kleurstof-beladingsstap zodat 3% agarosenodig. Nadat de agarose is gestold, plaatst u een 40x objectief (0,8 NA, 3,3 mm WD) en opnieuw te vullen de kamer met ACSF. </li><li> Overschakelen van de bright-field tot twee-foton bekijken en zoek de pipetpunt. Met de diagonale as van de micromanipulator, verplaatst de pipet totdat de punt op de gewenste diepte in de cortex (Figuur 3H). Af en toe druk uitwerpen rookwolken van de kleurstof mengsel (een paar psi, elke puls 0,1 sec) zal helpen voorkomen dat de pipetpunt verstopt raakt. Omdat OGB-1 uur alleen zichtbaar bij binnenkomst cellen, de rode Alexa kleurstof is essentieel voor visualisatie van de pipetpunt in de cortex. </li><li> Alvorens tot neuronen in corticale Layer 2/3 geladen met de volledige dosis van kleurstof, opnieuw richten van de doelstelling op de corticale oppervlakte om de diepte van de pipetpunt bevestigen en de tip in de doellocatie op basis van de indeling van waarborgen oppervlak bloedvaten. Als de pipet in laag 2/3, moeten kleine pufjes van het kleurstofmengsel verlichten deextracellulaire ruimte en onthullen een dichte montage van ronde cellichamen als donkere schaduwen. </li><li> Voor het laden van neuronale cellichamen in een sfeer van cortex 3-600 micrometer diameter, injecteren de kleurstof mengsel in de extracellulaire ruimte met 30 tot 90 pulsen, elke puls 1,0 sec, 2-10 psi. De pulsen van druk niet zo groot zijn dat het weefsel beweegt. Na de injectie is voltooid, een paar minuten wachten, en verwijder de pipet en objectief. Wacht 1 uur om de OGB-1 uur tot volledig overgenomen-up door neuronen. </li><li> Verwijder de agarose voor de kleurstof laden en spoel de opname kamer. Doe een kleine druppel van 2-3% agarose op het oppervlak wordt snel een dekglaasje over de craniotomie. Omdat de fluorescente kleurstoffen zijn lichtgevoelig, voorkomen overbelicht de cortex bright-field of epi-fluorescent licht. Plaats een hoge NA (1,0) 20x objectief in de objectieve houder en opnieuw centreren de gelabelde corticale regio onder de doelstelling met behulp van de xy tafel. Scherm de craniotomie van extraneous lichtbronnen, bijvoorbeeld visuele stimulus display, met behulp van meerdere lagen van black-out materiaal. </li></ol> 4. Eencellige Elektroporatie van fluorescerende kleurstoffen <ol><li> Voor het bestuderen van dendritische morfologie, een oplossing van 100 uM Alexa Fluor 594 (1:20 verdunning in ACSF van 2 mM Alexa Fluor 594 voorraad). Voor functionele beeldvorming van dendrieten een OGB zout kan worden gebruikt 16,17. </li><li> Trek een long taper pipet met een tip grootte van 1 pm en laden 5 pi kleurstof in de pipet. Alle andere stappen van het richten een functioneel domein identiek zijn met de bulk laadmethode (figuren 1-3). Om de pipetpunt naast een neuronale cellichaam membraan positioneren, toezicht op de toename van de impedantie van de elektrode en oefen druk pufjes van de kleurstof naar de extracellulaire ruimte te verlichten en te zien cellichamen als schaduwen in de loop van twee-foton beeldvorming. </li><li> Wanneer de pipetpunt grenst aan een neuronale cel lichaam membraan met de Axoporator 800A toepassing1 tot 3 pulsen (-8 t -10 V, 10 msec puls). De onmiddellijke vullen van de neuron met kleurstof gemakkelijk gevisualiseerd met twee-foton microscopie. Haal de pipet en het verzamelen van beelden met hoge resolutie van dendrieten en axonen in vivo. </li></ol>

<ol><li>Blasdel, G. G., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dyes+reveal+a+modular+organization+in+monkey+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex.</a> Nature. 321, 579-585 (1986).</li>
<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iso-orientation+domains+in+cat+visual+cortex+are+arranged+in+pinwheel-like+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns.</a> Nature. 353, 429-431 (1991).</li>
<li>Ohki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+ordered+arrangement+of+single+neurons+in+orientation+pinwheels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels.</a> Nature. 442, 925-928 (2006).</li>
<li>Shmuel, A., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+for+direction+of+motion+and+its+relationship+to+orientation+maps+in+cat+area+18%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18.</a> J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).</li>
<li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li>
<li>Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience+with+moving+visual+stimuli+drives+the+early+development+of+cortical+direction+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity.</a> Nature. 456, 952-956 (2008).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+layout+of+functional+domains+in+area+17+and+across+the+area+17%2F18+border+in+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).</li>
<li>Kara, P., Boyd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-architecture+for+binocular+disparity+and+ocular+dominance+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex.</a> Nature. 458, 627-631 (2009).</li>
<li>da Costa, N. M., Martin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+Cortical+Column+Would+that+Be%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Whose Cortical Column Would that Be.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16(2010).</li>
<li>Kaschube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universality+in+the+evolution+of+orientation+columns+in+the+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex.</a> Science. 330, 1113-1116 (2010).</li>
<li>Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+in+area+21a+of+the+cat+revealed+by+optical+imaging%3A+comparison+with+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex.</a> Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).</li>
<li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475, 501-505 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).</li>
<li>Nevian, T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+indicator+loading+of+neurons+using+single-cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation.</a> Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).</li>
<li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).</li>
<li>Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+valproic+acid+exposure+alters+functional+organization+in+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex.</a> Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).</li>
<li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471, 177-182 (2011).</li>
<li>Rochefort, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+direction+selectivity+in+mouse+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of direction selectivity in mouse cortical neurons.</a> Neuron. 71, 425-432 (2011).</li>
<li>Mrsic-Flogel, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-972 (2007).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonhoeffer%2C+T+%22Brain+mapping%3A+The+Methods%22">Brain mapping: The Methods</a>. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).</li>
<li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li>
<li>Hofer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+connectivity+and+response+dynamics+of+excitatory+and+inhibitory+neurons+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex.</a> Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We een methode om de labeling van neuronale cellichamen (of dendrieten en axonen) in vooraf bepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex richten. Fuserende intrinsieke optisch beeldvorming met twee-foton microscopie biedt de mogelijkheid te bepalen welke cellen bij synapsen en de micro-domein van elke functionele kaart, of neuronale selectiviteit correleert met de locatie van de neuron in een functionele kaart en de neuronale circuitcomponenten die veranderen met visuele ervaring 7 of de toepassing va...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. Life support / experiment prep </td></tr><tr><td> Isofluraan </td><td> Webster Vet </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluraan vaporizer </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Terugkoppeling gereguleerde verwarming deken </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> ECG-monitor </td><td> Digicare Biomedische </td><td> LifeWindow Lite </td><td></td></tr><tr><td> EEG-versterker </td><td> AM Systems </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> EEG monitor </td&gt; <td> Hewlett Packard </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> Einde tidal CO 2-monitor </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> Optimaliseer ventilatie </td></tr><tr><td> Hardmetalen boor bramen voor het boren bot </td><td> Henry Schein </td><td> fijne (0,5 mm tip) en grof (1,25 mm tip) </td><td></td></tr><tr><td> Cement voor kopplaat / kamer </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> Black Powder Tempera Paint </td><td> Sargent Art Inc </td><td> 22-7.185 </td><td> Toevoegen aan cement aan het licht afscherming te verbeteren en reflecties te verminderen </td></tr><tr><td> Agarose - Type III-A </td><td> Sigma </td><td> A9793 </td><td> Voor het minimaliseren van pulsaties in de loop van de intrinsieke signaal en twee-foton beeldvorming </td></tr><tr><td> Dekglaasje: 5 of 8 mm diameter, 0,17 mm dikte </td><td> Wereld Precision Instrumenten </td><td> 502040, 502041 </td><td> Voor het minimaliseren pulsaties tijdens beeldvorming, kan het dekglaasje worden gesneden behoefte </td></tr><tr><td> Brudon curettes </td><td> George Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> Reiniging schedel oppervlak </td></tr><tr><td> Bone wax </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> Snel stoppen met bloeden </td></tr><tr><td> Katoen Fooi Applicator </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 72.308-05 </td><td> Schoon en droog botoppervlak </td></tr><tr><td> Dumont # 5CO Forceps </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.295-20 </td><td> Pak individuele lagen van dura of pia </td></tr><tr><td> Vannas Spring Schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.000-03 </td><td> Cut dura </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pfizer </td><td> 09-0396-05 </td><td> Om het bloeden te stoppen op de dura </td></tr><tr><td> Absorptie speren</td><td> Fine Science Tools </td><td> 18.105-01 </td><td> Ultrasnelle en niet-pluizende absorberende van CSF </td></tr><tr><td> Blackout materiaal </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> Shield craniotomie </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. Kleurstofpreparaat / injectie </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 Bapta-1 AM </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> Calcium-indicator </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugaal filter (0,45 urn poriegrootte) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> Om verontreinigingen te verwijderen vóór de injectie </td></tr><tr><td> Glazen pipet trekker </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicaatglas filamented capillair (1,5 mm buitendiameter) </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> 1B150F-4 </td><td> Dye uitwerpen pipet </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> Voor het laden kleurstof in pipet </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> MP-285 </td><td> Om pipet positioneren </td></tr><tr><td> Drukpuls controller </td><td> Parker Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> Voor druk inspuiten van de kleurstof </td></tr><tr><td> Single-cell elektroporator </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoporator 800A </td><td> Voor elektroporatie van de kleurstof </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. Intrinsieke imaGing </td></tr><tr><td> 4x Doelstelling (0,13 NA, 17 mm WD) </td><td> Olympus </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> Intrinsieke hardware / software </td><td> Optische Imaging Inc </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> VDAQ software wordt gebruikt voor episodische beeldvorming </td></tr><tr><td> CCD Camera </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Lichtbron voeding </td><td> KEPCO </td><td> ATE 15-15M </td><td></td></tr><tr><td> Lichtbron </td><td> Optische Imaging Inc </td><td> HAL 100 </td><td> Lichtintensiteit op de corticale oppervlak is 3-5 mW </td></tr><tr><td> Green filter (voor vasculaire comping) </td><td> Optische Imaging Inc </td><td> λ = 546 nm (30 nm bandbreedte) </td><td> Ter referentie beeld van het oppervlak vaatstelsel </td></tr><tr><td> Rood filter (voor intrinsieke signaal) </td><td> Optische Imaging Inc </td><td> λ = 630 nm (30 nm bandbreedte) </td><td> Om intrinsieke signalen te verzamelen </td></tr><tr><td> Warmtefilter </td><td> Optische Imaging Inc </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. Twee-foton rig / imaging </td></tr><tr><td> Twee-foton microscoop en software </td><td> Prairie Technologies </td><td></td><td> Zie Shen et al.. 2012 voor lichtpad, filters en laservermogen </td></tr><tr><td> Ti: saffier-laser </td><td> Spectra-Physics </td><td> Mai Tai XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0,5 NA; 3,5 mm WD) </td><td> Olympus </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0,5 NA doel wordt alleen gebruikt voor het uitlijnen pipet de craniotomie (niet voor twee foton imaging) </td></tr><tr><td> 20x (1,0 NA; 2,0 mm WD) </td><td> Olympus </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0,8 NA; 3,3 mm WD) </td><td> Olympus </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> Air tafel </td><td> Newport </td><td> ST-200 </td><td> Isoleert de voorbereiding van externe trillingen </td></tr><tr><td> xy podium </td><td> Mike&#39;s Machine Co (Attleboro, MA) </td><td></td><td> Proefpersoon en Sutter micromanipulator geplaatst op xy tafel </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Recepten </td></tr><tr><td> Kunstmatige cerebro-spinale vloeistof </td><td> NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl2 (1,0 mM), CaCl2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4 </td></tr><tr><td> Pipetteer Oplossing 14 </td><td> NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gerichte labeling van neuronen in een specifiek functioneel micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton imaging

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In de primaire visuele cortex van de niet-knaagdier zoogdieren, worden neuronen geclusterd op basis van hun voorkeur voor stimuli functies zoals oriëntatie 1-4, richting 5-7, oculaire dominantie 8,9 en binoculaire dispariteit 9. Oriëntatie selectiviteit is de meest bestudeerde functie en een doorlopende kaart met een quasi-periodieke lay-out voor de gewenste oriëntatie aanwezig is in de gehele primaire visuele cortex 10,11. Integratie van de synaptische, cellulaire en netwerk bijdragen die leiden tot stimulans selectieve reacties in deze functionele kaarten vereist de hybridisatie van beeldvormende technieken die sub-micron overspannen millimeter ruimtelijke schalen. Bij conventionele intrinsieke signaal optische, kan de algemene indeling van functionele kaarten over het gehele oppervlak van de visuele cortex bepaald 12. De ontwikkeling van in vivo twee-foton microscopie met calcium gevoelige kleurstoffen laat toe bepalen synaptic-ingang te komen tot individuele dendritische spines 13 of een recordaantal activiteiten tegelijkertijd uit honderden individuele neuronale cellichamen 6,14. Bijgevolg combineert intrinsieke signaal beeldvorming met de sub-micron ruimtelijke resolutie van twee-foton microscopie biedt de mogelijkheid om een ​​precies welke dendritische cellen segmenten en bijdragen aan de micro-domein van elke functionele kaart in de neocortex. Hier laten we zien een hoge opbrengst methode voor het snel verkrijgen van een corticale oriëntatie kaart en tot een specifieke micro-domein in deze functionele kaart voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in een niet-knaagdier zoogdier. Met dezelfde microscoop gebruikt voor twee-foton beeldvorming, maken we eerst een oriëntatie kaart met behulp van intrinsieke signaal optische beeldvorming. Vervolgens laten we zien hoe je een micro-domein van belang het gebruik van een micropipet geladen met kleurstof om ofwel label richten op een bevolking van neuronale cellichamen of label van een enkel neuron zodanig dat dendrieten, stekels en axonen zijn zichtbaar invivo. Onze verfijningen ten opzichte van eerdere methoden vergemakkelijken onderzoek van neuronale structuur-functie relaties met subcellulaire resolutie in het kader van neocorticale functionele architecturen.

Om de precisie van onze dye labeling methoden illustreren, gericht op de kleinste micro-domein van elke bekende functionele kaart in de knaagdieren neocortex. Dun doorspekt het hele oriëntatie kaart in de primaire visuele cortex zijn singulariteiten. Deze komen op de plaatsen waar alle gewenste richtingen samenkomen, zodanig dat in valse kleuren kaarten van voorkeursrichting, de regio&#39;s rond de singulariteit eruit &quot;pinwheels&quot; (Figuur 2A-B). Een pinwheel per craniotomie is geselecteerd voor...

Een werkwijze wordt beschreven voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in voorafbepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex. Eerst wordt intrinsieke optisch imaging gebruikt om een ​​functionele kaart te verkrijgen. Dan twee-foton microscopie wordt gebruikt om het etiket en beeld neuronen binnen een micro-domein van de kaart.

Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Het algemene doel van deze procedure is om micro-domeinen in een functionele kaart nauwkeurig te targeten om de structuur en functie van neuronen met hoge resolutie te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst intrinsieke signaalbeeldvorming uit te voeren over een groot gebied van de cortex om een kaart van het te bestuderen stimuluskenmerk te verkrijgen. De tweede stap is om de precieze locatie in de kaart te bepalen die voor hoge resolutie naar fotonbeeldvorming moet worden gericht.Vervolgens, na zorgvuldige positionering van de met fluorescerende kleurstof geladen pipet, worden neuronen gelabeld met de fluorescerende marker. Ten slotte worden hoge resolutie naar fotonbeelden van neuronale reacties of structuren verzameld. Uiteindelijk kan een intrinsieke signaalkenmerkkaart worden gebruikt om een gebied van belang te vinden, zoals een oriëntatie-pinwheel singulariteit, dat vervolgens kan worden gericht voor studie met één neuronresolutie.Het grote voordeel van dit protocol is dat men de cortex op verschillende ruimtelijke schalen kan beeldvormen met behulp van dezelfde microscoopopstelling met slechts een paar snelle aanpassingen aan het systeem. Dit stelt iemand in staat om deze

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie.

In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen

Deze paper introduceert een benadering van het combineren van laser scanning fotostimulering met hele cel opnames in transgene muizen die GFP in beperkte remmende neuron populaties. De techniek maakt uitgebreide mapping en kwantitatieve analyse van lokale synaptische circuits specifieke remmende corticale neuronen.

Het in kaart brengen Remmende neuronale circuits door Laser Scanning fotostimulatie

Retrograde transport van fluorescente kleurstof labelt een sub-populatie van neuronen op basis van anatomische projectie. Gelabelde axons kunnen visueel worden...

Retrograde Fluorescerende Labeling Maakt Gerichte Extracellulair Single-unit Opnemen van geïdentificeerde neuronen<em&gt; In vivo</em

Ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen aan te passen als reactie op gedrags-uitdagingen.

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

We beschrijven de combinatie van focale UV-geïnduceerde foto-activatie van neuro-actieve verbindingen met whole-cell patch-clamp en multi-foton beeldvorming van intracellulaire natrium transiënten in dendrieten en de stekels van de hippocampus neuronen in acute weefsel plakjes van de hersenen van muizen.

Multi-foton intracellulaire Natrium Imaging In combinatie met UV-gemedieerde Focal uncaging van glutamaat in CA1 pyramidale neuronen

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

Presenteren we een methode geheel-cel patch-clamp opnamen en twee-foton imaging om vast te leggen van Ca2 + transiënten in neuronale dendrites in acute hersenen segmenten combineren.

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

Wanneer geïntegreerd met een kopplaat en een optisch ontwerp dat compatibel is met zowel enkelvoudige als twee-fotonmicroscopen, biedt de microprismalens een aanzienlijk voordeel bij het meten van neurale reacties in een verticale kolom onder verschillende omstandigheden, waaronder goed gecontroleerde experimenten in hoofdvaste toestanden of natuurlijke gedragstaken bij vrij bewegende dieren.

Langetermijnbeeldvorming van geïdentificeerde neurale populaties met behulp van microprisma's in vrij bewegende en met het hoofd gefixeerde dieren

Dit protocol biedt een uitgebreide beschrijving van een methode voor het gelijktijdig registreren van calciumsignalen van neuronen en astrocyten over meerdere geheugengerelateerde hersengebieden en demonstreert de toepassing ervan tijdens een leer- en geheugengedragsparadigma.

Een tweekleurige vezelfotometriemethode voor het registreren van activiteit van astrocytenneuronen over meerdere hersengebieden tijdens leer- en geheugengedrag

Leer hoe u neuronen labelt in specifieke functionele microdomeinen van de neocortex met intrinsieke signaalbeeldvorming en twee-fotonmicroscopie. Deze methode combineert functionele mapping met hoge-resolutiebeeldvorming.

Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging (Video) | JoVE Journal

Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging

Meer video's verkennen