Name: Het gebruik van omgekeerde fase eiwitseries (RPPA) naar Protein Expression Variatie Verkennen binnen Individuele Nier cel kankers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Verken proteomische expressievariatie in niercelkanker met behulp van omgekeerde fase eiwitarrays (RPPA). Deze methode maakt analyse van tumorheterogeniteit en behandelingsrespons mogelijk voor betere therapeutische strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk van auteurs FCO, DF, JN, DJH en GDS hierboven genoemde wordt gefinancierd door de Chief Scientist Office, subsidie-nummer: ETM37 en ondersteund door het Cancer Research UK Experimenteel Kankeronderzoek Geneeskunde Centrum. Het werk van AL wordt gefinancierd door de Royal College of Surgeons of Edinburgh Robertson Trust, de Melville Trust voor de verzorging en genezing van kanker en de Medical Research Council. IO wordt ondersteund door een Royal Society of Edinburgh Schotse regering Fellowship medegefinancierd door Marie Curie-acties en het Verenigd Koninkrijk Medical Research Council. De auteurs willen graag SCOTRRCC mede-aanvragers en medewerkers bedanken voor hun nuttige discussies op een aantal van de onderwerpen die in dit document.

1. Identificatie van morfologische en moleculaire Tumor Heterogeniteit <ol><li> Tumoren verwijderd van -80 ° C vriezer en op droog ijs bewaard. </li><li> Verdeel tumoren in secties van ongeveer 1 cm 3. Kaart de oorspronkelijke positie van elke tumor sectie ten opzichte van elkaar en label met een unieke naam. Store monsters in afzonderlijke cryovials bij -80 ° C tot aan gebruik. </li><li> Coat monsters in LGO en gesneden in een cryostaat bij -22 ° C. </li><li> Monsters gekleurd met hematoxyline en eosine tegenkleuring methode. </li><li> Microscopie analyse van vriescoupes te zorgen dat ze zijn CCRCC natuur, levensvatbare tumor en voor het sorteren (laaggradige, hooggradige of gemengde laag / hoog kwaliteit, een uitdaging om te differentiëren Fuhrman graad 1 tot 4 op vriescoupe). Figuur 1 a &amp; b (H &amp; E-kleuring van hoge lage en gemengde graad). </li><li> Selecteer tot 4 monsters van elke morfologisch verschillende regio&#39;s binnen elk tumor voor eiwitextractie. </li></ol> 2. Eiwit Extractie uit tumormonsters <ol><li> Snijd tumormonster van oktober </li><li> Place 50-75 mg weefsel in 2 ml buizen met 990 ul lysis buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), 150 mM NaCl] aangevuld met aprotinine (Sigma A6279) (10 mg / ml), fosfatase-inhibitor cocktail 2 (Sigma, P5716), fosfatase-inhibitor cocktail 3 (Sigma, P0044) en een protease inhibitor cocktail (Roche, 11836153001). </li><li> Voeg een 5 mm stalen kogel aan elke buis toegevoegd en gehomogeniseerd bij 50 Hz gedurende 5 minuten tweemaal telkens met TissueLyser, om de hoogte van homogenisering na elke periode van 5 minuten. </li><li> Breng gehomogeniseerde monster op nieuwe 2 ml buis met behulp van pipet het verlaten van de stalen kogel achter. </li><li> Voeg 10 ul van Triton X-100 aan elk monster voor centrifugeren bij 13.000 g gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Overdracht supernatanten verse reactievaatjes. </li><li> Bepaal eiwitconcentratie met BCA assay (figuur 2). </li><li>Normaliseren eiwitconcentraties van 1 mg / ml. </li></ol> 3. Antilichaam Validatie <ol><li> Bereid eiwitmonsters (geëxtraheerd uit geschikte cellijnen of weefsel) voor western blot en draaien op een 10% SDS-PAGE gel. </li><li> Doorvoermonsters op nitrocellulose membraan overnacht bij 4 ° C. </li><li> Blokkeren membraan in Li-Cor Odyssey Blokkeringsbuffer (50:50 verdund in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Verdun de primaire antilichamen in Li-Cor Odyssey Blokkeringsbuffer (50:50 verdund in PBS) aan de fabrikant aanbevolen verdunning typisch 1 op 1.000. </li><li> Incubeer membraan in primaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C. </li><li> Make up 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T; 1 ml Tween20 / 1L PBS). </li><li> Wassen membraan in PBS-T bij kamertemperatuur gedurende 5 min (x3). </li><li> Verdun fluorescent gelabelde secundaire antilichamen in Odyssey Blokkeringsbuffer (50:50 verdund in PBS) 0,01% SDS bij 1:10.000 verdunning (1,5 μl/15 ml). </li><li> Incubeer membraan in het voortgezetantilichamen bij kamertemperatuur gedurende 45 min onder zachtjes schudden - is het belangrijk om het membraan te beschermen tegen licht totdat zij definitief gescand. </li><li> Wassen membraan in PBS-T bij kamertemperatuur gedurende 5 min (x3), waarbij het membraan in het donker. </li><li> Wassen membraan in PBS bij kamertemperatuur gedurende 5 min (x3) om resterende Tween20 te verwijderen, opnieuw in, met het membraan in het donker. </li><li> Lig membraan plat op een stuk filtreerpapier in het donker en laat aan de lucht drogen - waardoor het membraan te drogen kan het signaal te verbeteren en achtergrondgeluiden te verminderen, maar het nutteloos voor het strippen en opnieuw indringende. </li><li> Scan de membraan op de Licor Odyssey scanner. Houd het membraan in het donker totdat het gescand. </li><li> Geselecteerde antilichamen die een enkele overheersende band op het juiste molecuulgewicht genereren. Figuur 3 toont voorbeelden van aanvaardbare en onaanvaardbare antilichamen voor gebruik met RPPA. </li></ol> 4. RPPA Printing <ol><li> Eiwitlysaten werden gespot op nitrocellulose-gecoat glas dia&#39;s (Fastslides-Whatman) met een MicroGrid II robot spotter. De gebruikte dia&#39;s bevatte 2 pads waarop de monsters werden gespot. Elke pad werd gespot met identieke monsters, in dit geval 100 monsters. Andere beschikbare formaten zijn 1, 8 en 16 pad dia&#39;s. Hoe hoger het aantal pads hoe kleiner het aantal monsters dat kan worden gespot op elk. </li><li> Een reeks van vijf 2-voudige verdunningen werden van elk monster en elk werd gespot in drievoud (resulterend in een totaal van 15 spots per monster). </li></ol> 5. RPPA eiwitdetectie <ol><li> Natte slides dan Licor Blokkeringsbuffer (50:50 verdund in PBS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een schommelende platform. </li><li> Bereid 800 pi van primaire antilichamen in Licor Blokkeringsbuffer (50:50 verdund in PBS) in de gewenste concentratie en op ijs bewaren. </li><li> Monteer de dia&#39;s in ofwel (i) de single frame Chip Clipof (ii) de &quot;FastFrame &#39;vier baai diahouder zodat een goede afdichting wordt gevormd tussen de dia en de incubatie kamer. </li><li> Verwijder resterende buffer van putten en voeg 600 ul primaire antilichaam respectievelijk aan de putjes. </li><li> Plaats de glijbaan en kamer in een verzegelde natte doos en incubeer op rocken platform overnacht bij 4 ° C. </li><li> Maken 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T, 100 ul Tween 20/100 ml PBS). </li><li> Verwijder dia&#39;s uit koelruimte en zorgvuldig de primaire antilichamen te verwijderen uit elk putje. </li><li> Voeg 600 ul van PBS-T en wassen dia&#39;s op rocken platform bij RT gedurende 5 minuten (X3). </li><li> Bereid fluorescent gelabelde secundaire antilichamen door verdunning in Odyssey Blokkeringsbuffer (50:50 verdund in PBS) 0,01% SDS bij 1:2000 verdunning (1 pi / 2 ml) in eerste instantie. </li><li> Verwijder buffer van putten en voeg 600 ul fluorescent gelabelde secundaire antilichamen respectievelijk aan de putjes. Incubeer secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 45 min onder zachtjes schudden - itis belangrijk om het membraan te beschermen tegen het licht totdat definitief is gescand. </li><li> Verwijderen secundaire antilichamen van goed en kort was (x3) in 600 ul PBS-T bij kamertemperatuur. Verwijder dia uit drager, over te brengen naar een geschikte container en was meer dan PBS-T gedurende 15 minuten, waardoor het membraan in het donker. </li><li> Verwijderen PBS-T en verder wassen met PBS membraan bij kamertemperatuur gedurende 15 min om resterende Tween-20 verwijderen, opnieuw in, het membraan in het donker. </li><li> Droog de Fastslide in 50 ° C oven gedurende 10 min en scan het Li-Cor Odyssey scanner. Houd de dia in het donker totdat het is gescand. </li><li> Scannen van de dia bij 680 nm en / of 800 nm, afhankelijk van het secundaire antilichaam / gebruikte antilichamen. Voor twee-kleurdetectie altijd zeer cross-geadsorbeerde secundaire antilichamen tegen kruisreactiviteit te minimaliseren. Zorgvuldige selectie van primaire en secundaire antilichamen is nodig voor twee kleuren detectie. Van primair belang is de selectie vanverschillende gastheersoorten (bijvoorbeeld konijn en muis) van de twee primaire antilichamen. Dit maakt discriminatie door anti-konijn en anti-muis secundaire antilichamen die met kleurstof gelabeld met gemakkelijk te onderscheiden emissiespectra. </li><li> Beeldbestanden worden opgeslagen als. Tiff-bestanden. Figuur 4 (beeld van gescande bestanden). </li></ol> 6. Data-analyse <ol><li> Start de MicroVigene Software (VigeneTech, Carlisle, MA, USA). </li><li> Open. Tiff image-bestand met de scan van de RPPA dia. </li><li> Selecteer een vooraf gedefinieerde sjabloon bestand dat een raster om te overlappen met het beeld van de RPPA slide zal hebben. </li><li> Klik op het definiëren Regio&#39;s of Interest (ROI) knop, om het Grid. </li><li> Plaats de Grid over de RPPA plekken. Figuur 6a (beeld van het net over de afbeelding). </li><li> Klik op de knop Alles selecteren om alle ROI te markeren. </li><li> Klik op Alles zoeken. MicroVigene zal Automatisch vinden de ROI, vinden de vlekken, trekt u de achtergrond, verwijder stof en kwantificeren vlekken. </li><li> Klik op de View Verdunning Curve knop om de resultaten voor alle monsters op de RPPA dia. </li><li> Klik op Opslaan Verdunning Data. </li><li> Aangezien elk monster wordt afgedrukt over 5 verdunning punten elk in drievoud er 15 punten te analyseren, waardoor de kans op fouten vermindert en verbetert de kwaliteit van curve fitting. MicroVigene produceert een vier-parameter logistische log-model &quot;Supercurve&quot; algoritme (Figuur 6b), die alle spots een sigmoïde curve van antigeen-antilichaam bindingskinetiek produceren omvat. De aanname is dat hetzelfde antilichaam-antigen bindingskinetiek vindt plaats in elk monster plaats, zelfs in de verschillende monsters, waardoor door alle spots op een rij een gemeenschappelijke response curve past, kan het vertrouwen van de curve fitting 10,11 Y = a + ((ba) / (1 + e (c * d-ln (x))) waarbij x het dilution factor en Y de signaalintensiteit. Monsters kunnen relatief worden geanalyseerd met de y0 waarde, die in onze analyse de y-waarde overeenkwam in het midden van de waarden na x kaart brengen die op de supercurve. </li><li> Exporteer de gegevens in Microsoft Excel en plot y0 zoals in figuur 7. </li><li> Intratumorale eiwit variantie werd apart berekend voor onbehandelde en behandelde behandelde patiënten in een ANOVA kader. Variantie distributies combineren van gegevens uit alle geanalyseerde eiwitten werden vergeleken door een Mann-Whitney test (MWT). Intratumorale afwijkingen voor de individuele eiwitten werden vergeleken door een F-test waarbij aannames van normaliteit en homoscedasticiteit gehouden, respectievelijk beoordeeld aan de hand van de Lillefours en Fligner tests; valse ontdekking tarief (FDR) correctie toegepast 12. Differentiële eiwitexpressie tussen onbehandelde en behandelde patiënt monsters getest voor elk eiwit met student t-test waar normaal en homoscedasticiteit veronderstellings voldaan, anders MWT werd uitgevoerd; FDR werd aangebracht boven gecombineerde t-test en MWT waarden 12. Belang van eiwitexpressie en variantie Pearson correlatie voor de eiwitten werden geschat met een standaardbenadering [R referentie] en FDR toegepast 12. </li></ol>

<ol><li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li>
<li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li>
<li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52(2010).</li>
<li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li>
<li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter+and+intratumour+heterogeneity%3A+a+barrier+to+individualized+medical+therapy+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma.</a> Front. Oncol. 2, 49(2012).</li>
<li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li>
<li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557(2012).</li>
<li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li>
<li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li>
<li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53(2011).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+False+Discovery+Rate%3A+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De hier gepresenteerde methode RPPA is een high throughput alternatief voor de veel gebruikte maar relatief lage doorzet western blot techniek eiwitanalyse. De werkwijze maakt honderden monsters te semi-kwantitatief geanalyseerd en vergeleken gelijktijdig waardoor directe vergelijking van de belangrijkste eiwitten in een brede selectie van cellijnen en weefselmonsters. Multiplexing met verschillende antistofspecies verder vergroot het vermogen van de techniek die meerdere antilichamen gelijktijdig worden gebruikt. De hi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> aprotinine </td><td> Sigma </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> fosfatase-inhibitor cocktail 2 </td><td> Sigma </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> fosfatase-inhibitor cocktail 3 </td><td> Sigma </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> protease inhibitor cocktail </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Triton-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> Li-Cor Odyssey Blokkeringsbuffer </td><td> Li-Cor </td><td> 927-40.000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85600 </td></tr><tr><td> MicroGrid II robot spotter </td><td> Biorobotics </td><td></td></tr><tr><td> FastFrame &#39;vier bay diahouder </td><td> Whatman papier </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> FAST Slide - 2-Pad </td><td> Whatman papier </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye 680LT geit anti-muis IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68.020 </td></tr><tr><td> IRDye 800CW geit anti-konijn IgG </td><td> Licor </td><td> 926-32.211 </td></tr></tbody></table>

het gebruik van omgekeerde fase eiwitseries (rppa) naar protein expression variatie verkennen binnen individuele nier cel kankers

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Op dit moment is er geen curatieve behandeling voor gemetastaseerd clear cell niercelcarcinoom, de meest voorkomende variant van de ziekte. Een belangrijke factor in deze behandeling weerstand gedacht dat de moleculaire complexiteit van de ziekte 1 zijn. Gerichte therapie zoals tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib zijn gebruikt, maar slechts 40% van de patiënten, reageren met de overgrote meerderheid van deze patiënten relapsing binnen 1 jaar 2. Als zodanig de vraag intrinsieke en verworven resistentie in niercelkanker patiënten is zeer relevant 3. Met het oog op resistentie tegen studeren TKI&#39;s, met als uiteindelijk doel het ontwikkelen van efficiënte en gepersonaliseerde behandelingen, wordt sequentiële weefsel na een bepaalde periode van gerichte therapie nodig, een aanpak die succesvol was gebleken bij chronische myeloïde leukemie 4. Echter, de toepassing van een dergelijke strategie niercelcarcinoom wordt bemoeilijkt door de hoge both inter-en intratumorale heterogeniteit, wat een kenmerk is van niercelcarcinoom 5,6 en andere vaste tumoren 7. Intertumoral heterogeniteit als gevolg van transcriptoom-en genetische verschillen is goed ingeburgerd, zelfs bij patiënten met een soortgelijke presentatie, stadium en de graad van de tumor. Bovendien is het duidelijk dat er grote morfologische (intratumorale) heterogeniteit in RCC, die waarschijnlijk nog grotere moleculaire heterogeniteit vertegenwoordigen. Gedetailleerd in kaart brengen en categoriseren van RCC tumoren door gecombineerde morfologische analyse en Fuhrman indeling maakt het mogelijk de selectie van representatieve gebieden voor proteomische analyse. Eiwit analyse van RCC 8 is aantrekkelijk vanwege de algemene beschikbaarheid in pathologische laboratoria, maar de toepassing ervan kan problematisch vanwege de beperkte beschikbaarheid van specifieke antilichamen 9. Als gevolg van de dot-blot aard van de omgekeerde fase eiwitseries (RPPA), antilichaam de specificiteit moeten be geprevalideerde en als zodanig strenge kwaliteitscontrole van de gebruikte antilichamen is van het grootste belang. Ondanks deze beperking de dot blot format, dat de mogelijkheid assay miniaturisatie, waardoor het drukken van honderden monsters op een nitrocellulose dia. Afgedrukte dia kan vervolgens worden geanalyseerd op soortgelijke wijze als Western-analyse met behulp van doelspecifieke primaire antilichamen en fluorescent gelabelde secundaire antilichamen, waardoor multiplexing. Differentiële eiwitexpressie in alle monsters op een dia kunnen dan tegelijkertijd worden geanalyseerd door het relatieve fluorescentie in een kosteneffectieve en high-throughput manier.

Een voorbeeld van een gescande RPPA dia te zien in Figuur 4 (i) met zowel 680 en 800 nm kanalen getoond. Het scheiden van de beelden door golflengte, Figuur 4 (ii) in staat stelt elke pad op de RPPA slide te analyseren en individuele eiwit expressie bepaald figuur 4 (iii). Zoals te zien in figuur 4 (iii) de expressie van individuele eiwitten in de monsters is uniek met gelsoline met een hoog expressieniveau in vergelijking met de dia cMYC die een veel l...

RPPA kan de eiwitexpressie van honderden monsters gedrukt op nitrocellulose dia gelijktijdig worden uitgelezen met behulp van fluorescent gelabelde antilichamen. Deze techniek is toegepast om het effect van medicamenteuze behandeling heterogeniteit studeren in clear cell niercarcinoom.

Het gebruik van omgekeerde fase eiwitseries (RPPA) naar Protein Expression Variatie Verkennen binnen Individuele Nier cel kankers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Het doel van deze procedure is om proteomische expressieveranderingen in niercelkanker te bestuderen met behulp van reverse phase protein arrays of RPPA. Dit wordt bereikt door eerst heterogene gebieden van individuele tumoren te kaarten en te selecteren. De tweede stap is het extraheren van eiwitten uit de monsters.Vervolgens worden de eiwitten genormaliseerd en op RPPA-slides afgedrukt. De laatste stap is het analyseren van de slides met behulp van antilichamen tegen eiwitten van belang. Uiteindelijk wordt RPPA gebruikt om differentiële proteomische expressieveranderingen in twee behandelingsgroepen van niercelkanker te tonen.Deze methode kan helpen om enkele van de belangrijkste vragen op het gebied van niercelkanker te beantwoorden. Er bestaat immers een grote eiwitheterogeniteit. De implicaties van deze techniek zijn dat het mogelijk een positieve invloed heeft op de behandeling van patiënten met niercelkanker die worden behandeld met gerichte therapieën.Dit komt omdat we zowel de heterogeniteit vóór en na de behandeling in weefselmonsters kunnen onderzoeken en daardoor hopelijk nieuwe drugbare doelen kunnen identificeren voor patiënten die verworven resistentie ontwikkelen tegen deze behandelingen. Het demonstreren van de cryostat en H-knie procedure zal worden gedaan door onderzoekslabmanager Helen Caldwell, het demonstreren van de eiwitextractietechniek zal worden gedaan door onderzoekstechnicus van onze groep, Jo Nanda. Het demonstreren van de OR PPA-afdruk zal worden gedaan door onze collega uit St. Andrews, Peter Mullen.Om deze procedure te beginnen, verwijdert u de tumoren uit de min 80 graden Celsius vriezer en bewaart u ze op droogijs. Verdeel de tumoren in secties van ongeveer één centimeter kubus. Kaart de oorspronkelijke positie van elke tumorsectie ten opzichte van elkaar en label met een unieke naam.Bekleed de monsters met OCT en snij ze in een cryostat van min 22 graden Celsius nadat de monsters zijn gekleurd. Gebruik de hemat, toïne en DSN tellers kleuringsmethode, analyseer de bevroren secties door middel van microscopie. Zorg ervoor dat de secties een levensvatbare tumor van duidelijke cel niercelcarcinoom zijn en gradeer ze als hoog graad, laag graad of gemengde laag en hoog graden.Selecteer maximaal vier monsters uit elke morfologisch verschillende regio binnen elke tumor voor eiwitextractie, die vervolgens wordt gedemonstreerd om eiwit uit tumormonsters te extraheren. Plaats 50 tot 75 milligram weefsel. Snijd van een CT in twee milliliterbuisjes.Voeg 990 microliters lysisbuffer toe, aangevuld met een proteïne in en fosfatase en proteaseremmers. Voeg een enkele vijf millimeter stalen kogel toe aan elke buis en homogeniseer gedurende vijf minuten op 50 hertz. Gebruik een weefsellaser.Controleer het niveau van homogenisatie en homogeniseer vervolgens nog eens vijf minuten. Gebruik een pipette om het gehomogeniseerde monster over te brengen naar een nieuwe twee milliliterbuis, laat de stalen kogel achter en een 10 microliters Triton X 100 voor elk monster, en centrifugeer vervolgens 13.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Breng de S supernatanten over naar verse microcentrifugebuisjes en bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-assay.Normaliseer eiwitconcentraties tot één milligram per milliliter vóór onze PPA-afdruk. Er worden een reeks van vijf tweevoudige verdunningen gemaakt van elk monster. Een van de meest tijdrovende aspecten van deze procedure is het maken van honderden verdunningen. Een succesvol resultaat kan worden verzekerd door voor het afdrukken van slides te controleren.Een microgrid twee robotische spotter wordt vervolgens gebruikt om eiwitlysaten op nitrocellulose gecoate glazen slides te spotten. Elke monster wordt in drievoudig gespot, wat resulteert in een totaal van 15 spots per monster. De slides die in dit experiment worden gebruikt, bevatten twee pads waarop de monsters worden gespot.Elke pad werd gespot met identieke monsters, in dit geval 100 monsters. Andere beschikbare formaten zijn één acht en 16 pad slides. Hoe hoger het aantal pads, hoe kleiner het aantal monsters dat erop kan worden gespot.Om de procedure voor eiwitdetectie te beginnen, bevochtig slides, een overtollig blokkeringsbuffer en incubeer op kamertemperatuur gedurende één uur op een wiegenplatform, bereid 800 microliters primaire antilichamen in blokkeringsbuffer bij de gewenste concentraties en bewaar op ijs. Na de incubatie van één uur. In blokkeringsbuffer monteer slides in de enkele frame chip clip of de snelle frame vier basis slide houder zodat een strakke afdichting wordt gevormd tussen de slide en de incubatiekamer.Verwijder resterende buffer uit de putjes en voeg 600 microliters primaire antilichamen toe aan de respectieve putjes. Plaats de slides en de kamer in een verzegeld natte doos en incubeer gedurende een nacht op een wiegenplatform bij vier graden Celsius. Verwijder de slides uit de koude kamer op de volgende ochtend.Verwijder voorzichtig de primaire antilichamen uit elk. Putje, voeg 600 microliters 0.1%PBS tussen 20 of PBST toe en was slides op een wiegenplatform bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Vervang de PBST met vers PBST op deze manier.Was slides in totaal drie keer. Verwijder buffer uit de putjes en voeg 600 microliters van fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen toe bij de juiste verdunning aan de respectieve putjes. Incubeer met secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten met zacht schudden, het is belangrijk om het membraan te beschermen tegen licht totdat het wordt gescand.Na 45 minuten verwijdert u secundaire antilichamen uit de putjes en was ze kort drie keer in 600 microliters PBST bij kamertemperatuur. Verwijder de slides van de drager, breng ze over naar een geschikte container en was in overtollig PBST gedurende 15 minuten. Houd het membraan in het donker.Verwijder PBST en was het membraan met PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten om resterende tween 20 opnieuw te verwijderen, houd het membraan in het donker. Probeer de snelle slides in een oven van 50 graden Celsius gedurende 10 minuten. Scan uiteindelijk de slides als 680 nanometer en/of 800 nanometer, afhankelijk van de gebruikte secundaire antilichamen.<

the-use-reverse-phase-protein-arrays-rppa-to-explore-protein

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

We zullen aantonen de opzet en analyse van pre-microRNA 96-wells-arrays voor QPCR het gebruik van een robot als door de hand met een Thermo Scientific Matrix multichannel pipet.

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

This video demonstrates the methodology for performing Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to study protein expression patterns from cell lysate. In RPPA, the lysate containing a mixture of proteins is printed on nitrocellulose slides and proteins of interest are analyzed using fluorescently labeled antibodies.

Reverse Phase Protein Arrays Based Protein Expression Analysis: A Procedure for Simultaneous Quantification of Expression of Multiple Proteins from Cell Lysate

Implementatie van een orthotope model niercelcarcinoom in immunocompetente muizen levert de onderzoeker een klinisch relevante systeem gedefinieerd door de aanwezigheid van een primaire niertumor en longmetastasen in hetzelfde dier. Dit systeem kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan behandelingen in vivo preklinisch testen.

Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën

Dit manuscript beschrijft de kopie nummer variatie analyse uitgevoerd in serum of plasma DNA met behulp van real-time PCR-aanpak. Deze methode is geschikt voor de voorspelling van medicamenteuze resistentie bij castratie resistente prostaatkanker patiënten, maar het zou informatief ook voor andere ziekten.

Serum en Plasma kopiëren nummer detectie met behulp van PCR in real time

Hier presenteren we een protocol voor antilichaam arrays om te identificeren van de wijzigingen in de signaalroutes in verschillende cellulaire modellen. Deze veranderingen, veroorzaakt door drugs/hypoxie/ultra-violet licht/straling, of overexpressie/Downregulatie/uitsparingen, zijn belangrijk voor verschillende modellen van de ziekte en kunnen aangeven of een therapie effect sorteren zullen of mechanismen van drugs kan identificeren weerstand.

Beoordeling van weerstand tegen Tyrosine Kinase remmers door een ondervraging van signaaltransductie trajecten door antilichaam Arrays

Een gedetailleerd protocol voor het genereren van zelf-geassembleerde humane eiwit arrays voor de screening van kinase remmers wordt gepresenteerd.

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

Uitgezaaid helder celnieraal celcarcinomis is een ziekte zonder een uitgebreid diermodel voor grondig preklinisch onderzoek. Dit protocol illustreert twee nieuwe diermodellen voor de ziekte: het orthotopicalisch geïmplanteerde muismodel en het kipchorioallantoïsche membraanmodel, die beide longmetastasen aantonen die lijken op klinische gevallen.

Vergelijking van uitgezaaide Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model opgericht in muisnier en op Kip Chorioallantoic Membraan

Hier presenteren we protocollen met gedetailleerde instructies voor het implementeren van 3D-celculturen met behulp van collageen- en collageen-agarosematrices in een microfysiologisch systeem. Deze protocollen ondersteunen de co-cultuur van spheroïden in de nierproximale tubulus en niercelcarcinoom, waardoor in vivo omstandigheden worden gesimuleerd en geavanceerd onderzoek naar interacties tussen nierkankercellen mogelijk wordt.

Microfluïdische co-cultuur van gezond nier- en tumorepitheel om de progressie van nierkanker te modelleren

Op massaspectrometrie gebaseerde proteomische gegevens zijn beschikbaar in open databases en toegankelijk met behulp van gratis tools. Gezien de complexiteit van het doorzoeken en beschrijven van databases, missen veel biologen de kennis om deze datasets te gebruiken. Hier bieden we een gids over het gebruik van gratis tools voor het doorzoeken van basisproteomische gegevens.

Navigeren door de op massaspectrometrie gebaseerde proteomische gegevens met behulp van gratis computationele tools

Een precieze muis model voor acute nierschade (AKI) als gevolg van ischemie is een belangrijk instrument om acute nierschade te onderzoeken en eventueel vinden therapeutische instrumenten om schade aan de nieren te behandelen. De opknoping gewicht systeem biedt een tool voor onmiddellijke en betrouwbare renale arterie occlusie en reperfusie zonder dat renale congestie.

Het gebruik van een Opknoping gewicht System voor geïsoleerde renale arterie occlusie

Verken proteomische expressievariatie in niercelkanker met behulp van omgekeerde fase eiwitarrays (RPPA). Deze methode maakt analyse van tumorheterogeniteit en behandelingsrespons mogelijk voor betere therapeutische strategieën.

Het gebruik van omgekeerde fase eiwitseries (RPPA) naar Protein Expression Variatie Verkennen binnen Individuele Nier cel kankers (Video) | JoVE Journal

Het gebruik van omgekeerde fase eiwitseries (RPPA) naar Protein Expression Variatie Verkennen binnen Individuele Nier cel kankers

Meer video's verkennen