De Citrobacter rodentium Muis Model: Studeren pathogeen en gastheer Bijdragen aan infectieuze colitis

Het algemene doel van deze procedure is om colitis te induceren door muizen te infecteren met het gram-negatieve spiegelpathogeen, citrobacter rodent, waardoor de studie van pathogeen- en gastheerinteracties in het maagdarmkanaal mogelijk wordt. Dit wordt bereikt door eerst een cultuur van nul redemptie gedurende een nacht te inoculeren. In de tweede stap worden muizen geïnfecteerd door orale gavages met het overnachtse inoculum.

Op dag zeven na infectie worden in de laatste stap het cecum, colon en luminale inhoud verzameld. De weefsels worden geplaatst, de bacteriekolonies worden geteld en de weefsels worden geïmmunostain voor de gastheer-eiwitten van belang. Uiteindelijk kunnen pathogenenbelasting, barrièrefunctie, histologische schade en veranderingen in gastheerreactie worden beoordeeld door middel van immunohistochemie.

Hoewel deze methode een robuust model van infectieuze colitis biedt, waardoor de studie van gastheer-pathogeeninteracties en immuunresponsen mogelijk is, kan deze ook worden aangepast om de effecten van bacteriële infectie op het risico op darmkanker te onderzoeken. Over het algemeen zouden personen die nieuw zijn met deze methode natuurlijk worstelen met de bacteriële infectie van de muizen, met of zonder, of met een gaag. Begin met het gebruik van een steriele inoculatie-lus om levensvatbare C-redemptie van een bevroren glycerolvoorraad op een LB-elektroplaat te strijken.

Na overnachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius, gebruik een inoculatie-lus om kolonies van de LB-plaat over te brengen naar drie milliliter steriele lb-broth. Vervolgens incubeert u de ERO Dunum-cultuur aëroob in een incubatieschudder op tafel bij 200 RPM gedurende een nacht bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend zou de geïnoculeerde lb-broth troebel moeten zijn.

Schud de cultuur voorzichtig om de bacteriële celcultuur gelijkmatig te verdelen en laad vervolgens een ene milliliter spuit met bouillon en bevestig deze aan een gastrische gavagenaald. Selecteer een muis voor gavage door de losse huid over de nek en rug stevig vast te grijpen met vinger en vinger. Trek vervolgens met een wijsvinger het hoofd van het dier naar achteren om het hoofd van het dier te immobiliseren en de slokdarm te strekken voor inbrenging.

Houd de muis rechtop en leid de punt van de bulb van de gastrische gavagenaald langs de zijkant van de mond van het dier en over zijn tong. Breng voorzichtig de naald langs het dak van de mond van het dier en breng de naald door de slokdarm naar beneden. Gebruik vervolgens de spuit om langzaam 100 microliter van het bacteriële inoculum te injecteren en verwijder vervolgens voorzichtig de gavagenaald.

Bewaak de ademhalingssnelheid en het gedrag van de muis na het terugbrengen ervan, zijn kooi op de dag van de test, pak de muis zoals zojuist is aangetoond en geef vervolgens het dier een gavage met 150 microliter vers bereide fitzy-dextrine. Haal het voedsel uit de kooi op dit moment, vier uur na gavage en vervolgens sedatie van het dier. Gebruik een hartpunctie om zoveel mogelijk bloed van het geanestheseerde dier te verzamelen.

Voeg het bloed toe aan een eindconcentratie van 3%zure citroendextrose in een microcentrifugebuis om stolling tegen te gaan. Draai vervolgens de bloedmonsters gedurende 12 minuten bij 1000 kaas en vier graden Celsius. Verzamel vervolgens het serum en dun het uit tot een tot 10 en een tot 100 in PBS bij 100 microliter van elk monster.

Bij deze twee verdunning tot een 96-wellplaat in duplicaat. Om de standaardcurve voor te bereiden, verdunt u 100 microliter monsters van de originele 80 milligram per milliliter. Fitz Dextrin gebruikt voor gavage van de muizen in PBS in donkere microcentrifugebuizen.

Voeg vervolgens de standaardmonsters toe aan een 96-wellplaat in drievoudig. Gebruik vervolgens een fluorimeter om de fluorescentie van elk monster te kwantificeren en om de FXI-dextrineconcentratie te bepalen. Begin deze stap door een milliliter steriele PBS en een autoclave-metaalkraal toe te voegen aan ronde bodem twee milliliter centrifugeerbuisjes. Weeg vervolgens elke buis.

Vervolgens, na het verwijderen van de seum en colon uit de muis, scheidt u de seum van de colon en snijdt u ze open in lengterichting. Verzamel de luminale inhoud met pincetten en voeg de inhoud toe aan een buis met PBS. Was de sequel en colonische weefsels met steriele PBS voordat u ze in afzonderlijke buizen plaatst.

Weeg nu de weefselbuizen en homogeniseer de monsters met behulp van een bead beater gedurende zes minuten. Voeg bij 30 hertz 180 microliter steriele PBS per putje toe aan een 96-wellplaat. Voeg vervolgens 20 microliter van elk gehomogeniseerd monster toe aan de eerste put in elke rij en meng goed.

Verdun de monsters serieel door 20 microliter van elk vorige putje toe te voegen om een verdunning van 10 tot de min één in de eerste put te verkrijgen tot 10 tot de min zes. Plateer vervolgens 10 microliter van elke verdunning van elk monster in drievoudig op een vierkante bodem LB-plaat met een raster na overnachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius. Tel de kolonievormende eenheden op één plaat.

Gemiddeld de drievoudig voor elk monster en noteer vervolgens de verdunning waarbij elk monster werd geteld. Vermenigvuldig het gemiddelde CFU met 50 en met de verdunningsfactor waarbij het monster werd geteld, resulterend in CFUs per milliliter. Deel tenslotte door het weefselgewicht om de CFUs per gram te bepalen na overnacht, formeel en fixatie van de eerder opgeslagen 0,5 centimeter colon en secumsectie.

De volgende ochtend was de weefsels met 70%ethanol en plaats in een cassette om naar een histologiefaciliteit te sturen om in paraffine ingebed en gekleurd te worden met hematine en eosina om de weefsels te deparizeren. Plaats de slides in een coplan-kleuringsvat in een 65 graden Celsius waterbad gedurende 10 minuten. Plaats de slides nu in xyleen voor vier wasbeurten van twee minuten.

Rehydrateer vervolgens de slides met twee vijf minuten wasbeurten en 10