Name: De Citrobacter rodentium Muis Model: Studeren pathogeen en gastheer Bijdragen aan infectieuze colitis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Leer colitis induceren bij muizen met Citrobacter rodentium-infectie via orale gavage. Deze methode onderzoekt pathogeen-gastheer interacties, barrièrefunctie en histologische schade in het gastro-intestinale systeem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies aan BAV van de Crohn en Colitis Foundation of Canada (CCFC) en de Canadese Instituten for Health Research (CIHR). NL werd gefinancierd door een gediplomeerde studententijd van CIHR. BAV is het kinder met darm-en leveraandoeningen (KIND) Stichting Leerstoel Pediatric IBD Research en de Canada Research Chair in Pediatric Gastroenterology.

1. Voorbereiding van Citrobacter rodentium Inoculum en orale sondevoeding van Muizen <ol><li> Voorbereiden en autoclaaf Luria Bertani bouillon (LB). </li><li> Verkrijgen levensvatbare C. rodentium uit een bevroren glycerol voorraad en streeploos op LB-agar plaat met behulp van een steriele enten lus of pipetpunt. Incubeer bij 37 ° C geroerd. Enten 3 ml steriel LB bouillon in een falcon kweekbuis met kolonies van de LB plaat met een entnaald of pipetpunt. Bereiding van het inoculum worden gedaan met behulp van aseptische technieken. </li><li> Incubeer de C. rodentium cultuur aëroob bij 37 ° C overnacht in een benchtop incubatie schudinrichting bij 200 rpm. De geïnoculeerde LB-bouillon moet troebel zijn na een nacht cultuur. </li><li> Gebruik een lamp gaven maag gavage naald bevestigd aan een 1 ml spuit elke muis gavage met 100 ul van de overnacht C. rodentium cultuur. Voorzichtig scruff de muis, door stevig vast te pakken in de losse huid over zijn nek en rugmet duim en vingers. Trek het dier het hoofd met de wijsvinger naar het hoofd te immobiliseren en de slokdarm recht voor het inbrengen van de maagsonde naald. </li><li> Houd de muis in een rechtopstaande positie en richt de lamp punt van de maagsonde naald langs de zijkant van haar mond en over haar tong. Voorzichtig langs de naald langs het dak van de mond en vooruit naar beneden de slokdarm. Als er een weerstand gevoeld tijdens deze procedure, moet u de sonde naald en plaats deze opnieuw. </li><li> Injecteer langzaam 100 ul van de bacteriële inoculum en verwijder voorzichtig de sonde naald. Toezicht houden op de ademhaling en het gedrag van de muis na terugkeer het aan zijn kooi. </li></ol> Opmerkingen: <ul><li> In stap 2 en 3, maken ook een falcon kweekbuis behulp van aseptische technieken met 3 ml steriel LB bouillon gedurende de nacht worden gekweekt om te garanderen dat er geen bacteriële besmetting van de bouillon zelf. De LB-bouillon moet duidelijk blijken na een nacht cultuur. </li><li&gt; voorzichtig roeren vóór de cultuur in de falcon-buis worden geladen spuiten voor gavage zodat een gelijke dosis bacteriën wordt aan elke muis in stap 4. </li><li> Overnachting cultuur moet worden weggegooid als het is ingeënt voor meer dan 24 uur. </li><li> Alle C. rodentium infecties en huisvesting van geïnfecteerde dieren worden uitgevoerd in een Biosafety Level 2 faciliteit. </li></ul> 2. Het meten van Colonic epitheliale barrière permeabiliteit in C. rodentium-geïnfecteerde muizen <ol><li> Meet barrière integriteit op een gewenst tijdstip na infectie. </li><li> Op de dag van de test, om genoeg 4 kDa fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een concentratie van 80 mg ml-1 tot elke muis gavage met 150 pi en de standaard curve te bereiden. </li><li> Nekvel de muis en gavage met 150 ul FITC-dextran. Trek voedsel uit de kooi op dit moment. </li><li> Verdoven muizen 4 uur nagavaging en verzamel zo veel mogelijk bloed (~ 450 pi) door hartpunctie. Voeg het bloed tot een eindconcentratie van 3% zuur citraat dextrose in een microcentrifugebuis om coagulatie te voorkomen. Euthanaseren de muizen en verzamel colon weefsels in PBS voor bacterietellingen (stap 3,1 tot 3,5) en in 10% formaline fixatie weefsel en uiteindelijk immunofluorescentiekleuring (stap 4,1 tot 4,8). </li><li> Draai de bloedmonsters bij 1.000 xg gedurende 12 min in een centrifuge bij 4 ° C. Verzamel de serum en vul aan tot 1/10 en 1/100 in PBS. Voeg 100 ul van elk monster bij deze twee verdunningen van een plaat met 96 putjes in duplo. </li><li> De standaard curve te bereiden, verdun het oorspronkelijke 80 mg ml-1 FITC-dextran gebruikt om de muizen in PBS maagsonde de volgende concentraties: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 en 0 ug / ml . Voeg 100 pl van elke concentratie een plaat met 96 putjes in drievoud. </li><li> Kwantificeer de fluorescentie van elk monster met behulp van een fluorometer bij een excitatie wavelength van 485 nm en 535 nm emissie golflengte. </li><li> Analyseer de ruwe gegevens getrokken waarbij de standaardcurve. Voer de ruwe gegevens voor elk monster in de vergelijking van de lijn die door de standaardcurve van de concentratie van FITC-dextran bepalen in elk monster. </li></ol> Opmerkingen: <ul><li> Vanaf stap 4 verder, houden bloedmonsters op ijs en het minimaliseren van de blootstelling aan licht. </li><li> Bij het meten van epitheliale barrière-integriteit een tijdstip op of vóór en 7 dagen na infectie is optimaal, aangezien ernstige weefselbeschadiging na dit punt. Het meten van barrière-integriteit voor ernstige schade voorkomende kunt u bepalen maximale verschillen in permeabiliteit tijdens C. rodentium infectie tussen muizenstammen. </li><li> Zorg ervoor dat niet-geïnfecteerde muizen in de controlegroep ook worden getest op epitheliale barrière integriteit. </li></ul> 3. Meting van de bacteriële verontreiniging in de weefsels van C. rodentium-geïnfecteerde muizen <ol><li> Voeg 1 ml steriele PBS eennd een geautoclaveerd metalen kraal met een ronde bodem 2 ml centrifugebuis met behulp van aseptische techniek. Afzonderlijke weefsels verzameld van elk dier worden in afzonderlijke buizen PBS. Weeg de buizen voorafgaande aan de toevoeging van het weefsel. </li><li> Verwijder de blindedarm en de dikke darm van de muis. Scheid de blindedarm van de dikke darm en druk de luminale inhoud behulp van een tang. Voeg de inhoud van een buis PBS. Na scheiding 0,5 cm secties van het distale colon en blindedarm 10% formaline fixatie lengterichting opengesneden de resterende colon en blindedarm en wassen met steriele PBS voordat weefsels in tubes. </li><li> Weeg de buizen met PBS en het weefsel Homogeniseer de monsters met een bead beater gedurende 6 minuten bij 30 Hz. </li><li> Met behulp van aseptische technieken, voeg 180 ul steriele PBS per putje van een plaat met 96 putjes. Voeg 20 ul van elk monster gehomogeniseerde het eerste putje in elke rij. Meng goed en serieel te verdunnen, het toevoegen van 20 pi van elk voorheen goed om verdunningen te verkrijgen van 10 -1 (we eerstll) tot 10 -6. Plaat 10 pi van elke verdunning van elk monster in drievoud op een vierkante bodem LB plaat met een raster. Incubeer overnacht bij 37 ° C. </li><li> Tellen kolonievormende eenheden (CFU) en de gemiddelde 3 tellen en noteer de verdunning waarbij elk monster werd geteld. Vermenigvuldigen gemiddelde CFU met 50, tot 20 ul van de oorspronkelijke 1 ml monster werd gebruikt, en met de verdunningsfactor waarop het monster werd geteld resulteert in CFU / ml. Tenslotte delen door het weefsel gewicht CFU / g bepalen. </li></ol> 4. Histologische evaluatie en immunofluorescentiekleuring van geïnfecteerde Colon Tissues <ol><li> Verzamel weefsels als in stap 3.2. Bewaren weefsels in formaline &#39;s nachts, daarna wassen met 70% ethanol. Embedden weefsels in paraffine en gesneden 5 um secties voor kleuring. Vlek met hematoxyline &amp; eosine voor histologische beoordeling en gaat u verder met de volgende stappen voor immunofluorescentie kleuring. </li><li> Om weefsels deparaffinize vóór de kleuring, plaats schuift ineen Coplin kleuring pot en zet in 65 ° C waterbad gedurende 10 minuten. Vervolgens plaats dia&#39;s in xyleen voor vier wasbeurten van 2 minuten elk. Objectglaasjes dan gerehydrateerd met twee 5 minuten wassen in 100% ethanol, gevolgd door 5 min was in elk van de volgende: 95% ethanol, 75% ethanol en dH 2 0. Deze wasbeurten moet worden gedaan in een hoofdkap gebruiken om blootstelling aan schadelijke dampen te voorkomen. </li><li> Plaats de glaasjes in de Coplin pot met voorverwarmd natriumcitraatbuffer en plaats in een stomer gedurende 30 min, laat zitten voor 30 minuten. Dit proces breekt het eiwit verknopingen gevormd door formalinefixatie ophalen potentieel antigene plaatsen. </li><li> Wassen met PBS gedurende 5 min azide, driemaal. Droge slides en mark omgeving weefsel met een PAP pen op een hydrofobe barrière te creëren, waarbij de kleurstoffen gelokaliseerd op het weefsel. </li><li> Block weefsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met blokkerende buffer (bijvoorbeeld α-geiteserum) in een vochtige kamer immunokleuring. </li><li> Verdun primary antilichaam gewenste concentratie met antilichaamverdunning buffer. Giet blokkeerbuffer en breng 50 tot 100 ul van primair antilichaam aan weefsels. Incubeer bij 4 ° C gedurende de nacht of bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Wassen met PBS gedurende 5 min azide, driemaal. Voeg 50 tot 100 pi secondair antilichaam verdund in buffer antilichaamverdunning aan de weefsels en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker. Wassen met dH 2 O 5 minuten, driemaal. </li><li> Uitdrogen dia&#39;s, voeg DAPI Verleng Gold montage medium en breng een dekglaasje aan. Bekijk dia&#39;s onder een fluorescentie microscoop. </li></ol> Opmerkingen: <ul><li> PBS azide kan gesubstitueerd met vers bereide PBS als alternatief voor bacteriële groei in het wasmedium uit stap 4 verder voorkomen. </li></ul>

<ol><li>Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD%3A+lessons+from+mouse+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).</li>
<li>Cario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+Receptors+in+Inflammatory+Bowel+Diseases%3A+A+Decade+Later%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).</li>
<li>Eckmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Inflammatory Bowel Disease.</a> Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).</li>
<li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).</li>
<li>Luperchio, S., Schauer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+Citrobacter+rodentium+and+transmissible+murine+colonic+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia.</a> Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).</li>
<li>Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+host+responses+to+enteric+bacterial+pathogens%3A+a+balancing+act+between+resistance+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance.</a> Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).</li>
<li>MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+defences+to+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host defences to Citrobacter rodentium.</a> International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).</li>
<li>Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+the+Citrobacter+rodentium+infection+model+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).</li>
<li>Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+plays+a+critical+role+in+maintaining+mucosal+integrity+during+Citrobacter+rodentium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis.</a> Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).</li>
<li>Dennis, A., Kudo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p50+subunit+of+NF-%CE%BAB+is+critical+for+in+vivo+clearance+of+the+non-invasive+enteric+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).</li>
<li>Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88+signalling+plays+a+critical+role+in+host+defence+by+controlling+pathogen+burden+and+promoting+epithelial+cell+homeostasis+during+Citrobacter+rodentium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis.</a> Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).</li>
<li>Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signaling+mediated+by+MyD88+is+required+for+a+protective+innate+immune+response+by+neutrophils+to+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium.</a> Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).</li>
<li>Bry, L., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+T+cell+dependent+serum+antibody%2C+but+not+the+gut-associated+lymphoid+tissue%2C+for+surviving+acute+mucosal+infection+with+Citrobacter+rodentium%2C+an+attaching+and+effacing+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).</li>
<li>Simmons, C. P., Clare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+B+lymphocytes+and+CD4%2B+T+cells+in+immunity+to+infection+by+the+attaching+and+effacing+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).</li>
<li>Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Roles+of+Notch+and+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+Pathways+in+the+Regulation+of+Hyperplasia+and%2For+Colitis+in+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection.</a> Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Citrobacter rodentium infectie een waardevol model voor de studie van zowel infectieziekten en colitis bij muizen. Dit unieke model maakt de karakterisering van zowel gastheer reacties en de pathogene eigenschappen van bacteriën. De stappen die in dit protocol detail het succesvolle gebruik van dit model. Er zijn verschillende kritische stappen in dit protocol in gedachten te houden bij het opwekken van colitis en het analyseren van reacties. Enerzijds de bereiding van een verse ove...

Enterische infectie door bacteriële pathogenen triggers gastro-intestinale (GI) ontsteking en intestinale pathologie en pathofysiologie, waaronder diarree en intestinale epitheliale barrière disfunctie. De virulentie mechanismen waardoor bacteriële pathogenen koloniseren het maagdarmkanaal van de gastheer, evenals specifieke gastheer responsen die verdedigen tegen dergelijke infecties slecht begrepen, hebben echter recente ontwikkelingen in de modellering van enterische bacteriële infecties begonnen ons begrip van deze processen ondersteunen. Enterische bacteriën zijn ook verbonden met inflammatoire darmziekten (IBDs). De IBDs Crohn&#39;s Disease (CD) en UC complexe ziekten van onbekende etiologie die wordt gekenmerkt door chronische darmontsteking en weefselschade. Veel muismodellen van darmontstekingen bestaan ​​van spontane ontsteking in genetisch gemodificeerde stammen, zoals IL10 - / - muizen, chemische problemen met verbindingen, zoals natriumsulfaat dextran (DSS) en dinitrobenzene sulfonzuur (DNBS) 1. Er is verondersteld dat de onaangepaste chronische ontstekingsreacties in IBD patiënten ontwikkelen genetisch gevoelige individuen op abnormale blootstelling van de intestinale mucosale immuunsysteem darmbacteriën 2, dus de studie van modellen van colitis infectieuze ook een groot potentieel voor het definiëren van potentieel pathogene ontvangende . reacties op darmbacteriën Citrobacter rodentium geïnduceerde colitis is een van de zeldzame modellen van colitis infectieuze dat goed is gekarakteriseerd 1,3, waardoor de analyse van gastheer responsen tegen enterische bacteriën en verder begrip van mogelijke mechanismen van IBD pathogenese, een essentiële stap in de ontwikkeling van nieuwe preventieve en therapeutische behandelingen. C. rodentium is een gram-negatieve bevestiging en uitwissen (A / E), murine specifieke bacteriële pathogenen die nauw verband houdt met de belangrijke menselijkepathogenen enteropathogene E. coli (EPEC) en enterohemorragische E. coli (EHEC) 3-8. De familie van A / E pathogenen nauw hechten aan het apicale membraan van gastheercel en de cecal colonepitheel, die een niet-invasieve voetstuk-achtige structuur van de gastheercel. Orale uitdaging met C. rodentium van 10 8 -10 9 organismen produceert een robuust model van infectieuze colitis gekenmerkt door dikke hyperplasie of verlenging van de crypten, mononucleaire immuuncellen infiltratie en goblet cel depletie 3,4. De eerste site van kolonisatie, een paar uur na uitdaging is bovenaan cecal patch, gevolgd door overgang naar het distale colon 2 tot 3 dagen na infectie 3. In immunocompetente muizenstammen wordt klaring van het pathogeen bereikt 3 tot 4 weken na infectie 1,3,4. Echter veel genetisch gemodificeerde stammen, namelijk gen deficiënte of knockout (- / -) muizen zijn, bleken increa weersed vatbaarheid voor infecties resulteert in overdreven schade en / of chronische infecties en ontstekingen 9-14. Het gebruik van deze infectieuze colitis model in deze knock-out stammen, veel ontbreekt aangeboren signaleringeiwitten, is onmisbaar in het onthullen van een aantal gastheereiwitten integraal naar de resolutie van de intestinale infecties en ontstekingen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Luria Broth </td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> Voeg 25 g LB poeder 1 liter water. Autoclaaf voor gebruik. </td></tr><tr><td> Vierkante bodem plaat met rooster </td><td> Visser </td><td> 08-757 11A- </td><td></td></tr><tr><td> Falcon cultuur buis </td><td> Sarstedt </td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td> Bulb getipt maag gavage naald </td><td> Fine Science Tools </td><td> 18.060-20 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml spuit </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDa FITC-dextran </td><td> Sigma </td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td> Citroenzuur </td><td> Sigma </td><td> C7129 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Natriumcitraat </td><td> Visser </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Visser </td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td> Zuurcitraatdextrose </td><td></td><td></td><td> 20 mM ctiric zuur, 110 mM natriumcitraat, 5 mM dextrose </td></tr><tr><td> Zwarte 96-putjesplaat </td><td> Visser </td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td> Metalen kralen (5 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 69989 </td><td></td></tr><tr><td> 10% formaline </td><td> Visser </td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml flacon </td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> Visser </td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td> Eosine </td><td> Visser </td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td> Xyleen </td><td> Visser </td><td&gt; HC700-1GAL </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin vlekken jar </td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumcitraatbuffer </td><td></td><td></td><td> 10 mM natriumcitraat, 0,05% Tween 20, pH 6,0 </td></tr><tr><td> Pap pen </td><td> Cedarlane </td><td> Mu22 </td><td></td></tr><tr><td> Geitenserum </td><td> Sigma </td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumine (BSA) </td><td> Visser </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> Sigma </td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td> Het blokkeren van buffer </td><td></td><td></td><td> 2% geitenserum, 1% BSA, 0,1% triton X-100, 0,05% Tween 20, 0,05% natriumazide, 0,01 M PBS, pH 7,2, mix en bewaar bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> Antilichaamverdunning buffer </td><td></td><td></td><td> 0,1% triton X-100, 0,1% BSA, 0,05% natriumazide, 0,04% EDTA </td></tr><tr><td> Het blokkeren van buffer &amp; antilichaamverdunning buffer voor tir </td><td></td><td></td><td> Dezelfde recepten als hierboven, maar zonder toevoeging van detergentia (Triton X-100 en Tween 20) </td></tr><tr><td> Verleng Gold antifade Reagens met DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td></td></tr><tr><td> Dekglaasjes </td><td> Visser </td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td> Benchtop incubatie shaker </td><td> Barnstead Lab Line </td><td> Max Q4000 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorometer </td><td> Perkin Elmer </td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td> Gekoelde centrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td> Stoomboot </td><td> Black &amp; Decker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluorescentiemicroscoop </td><td> Zeiss </td><td> Axio Image.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

de<em&gt; citrobacter rodentium</em&gt; muis model: studeren pathogeen en gastheer bijdragen aan infectieuze colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Dit protocol beschrijft de stappen om een robuust model van infectieziekten en colitis produceren, evenals de methoden om Citrobacter rodentium infectie in muizen karakteriseren. C. rodentium is een gram-negatieve murine specifieke bacteriële pathogenen die nauw verband houdt met de klinisch belangrijke humane pathogenen enteropathogene E. coli en enterohemorragische E. coli. Na infectie met C. rodentium, immunocompetente muizen last van bescheiden en van voorbijgaande aard gewichtsverlies en diarree. Histologisch, worden intestinale crypte rek, immuun cel infiltratie en goblet cel depletie waargenomen. Klaring van infectie wordt bereikt na 3 tot 4 weken. Meting van intestinale epitheliale barrière integriteit bacteriologische belasting en histologische schade op verschillende tijdstippen na infectie, kan de karakterisering van muizenstammen gevoelig voor infectie. De virulentiemechanismes waardoor bacteriële pathogenen koloniseren de darm van de gastheer, evenals specifieke gastheer responsen die verdedigen tegen dergelijke infecties worden slecht begrepen. Daarom C. rodentium model van enterische bacteriële infectie dient als een waardevol instrument om te helpen in ons begrip van deze processen. Enterische bacteriën zijn ook verbonden met inflammatoire darmziekten (IBDs). Er is verondersteld dat de onaangepaste chronische inflammatoire reacties die bij IBD patiënten ontwikkelen genetisch gevoelige individuen na abnormale blootstelling van de intestinale mucosale immuunsysteem darmbacteriën. Daarom is de studie van modellen van infectieuze colitis biedt aanzienlijke mogelijkheden voor het definiëren van potentieel pathogene gastheer responsen tegen darmbacteriën. C. rodentium geïnduceerde colitis is een dergelijke zeldzame model waarmee voor de analyse van gastheer responsen tegen darmbacteriën, bevordering van ons inzicht in potentiële mechanismen van IBD pathogenese;essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe preventieve en therapeutische behandelingen.

Tijdens een standaard infectie experiment worden de muizen geïnfecteerd met ongeveer 2,5 x 10 8 CFU door gavage van 100 pi overnacht C. rodentium cultuur. Infectie van C57BL / 6 muizen met C. rodentium resulteert in een bescheiden en van voorbijgaande aard gewichtsverlies en diarree. Hoewel een zeldzame gebeurtenis met C57BL / 6 muizen, kunnen dieren ziek worden en vereisen euthanization. Derhalve muizen worden gecontroleerd mate van gewichtsverlies en symptomen van angst zoals piloerect bon...

Citrobacter rodentium infectie biedt een waardevol model voor enterische bacteriële infecties te bestuderen, evenals het hosten immuunreacties en colitis bij muizen. Dit protocol beschrijft de meting van de barrière integriteit, pathogeen belasting en histologische schade waardoor de grondige karakterisering van pathogeen en gastheer bijdragen aan murine infectieuze colitis.

De<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Muis Model: Studeren pathogeen en gastheer Bijdragen aan infectieuze colitis

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Het algemene doel van deze procedure is om colitis te induceren door muizen te infecteren met het gramnegatieve pathogeen citrobacter rodent, waardoor de interacties tussen pathogeen en gastheer in het maag-darmkanaal kunnen worden bestudeerd. Dit wordt bereikt door eerst een cultuur van zero redemption gedurende de nacht te inoculeren. In de tweede stap worden de muizen geïnfecteerd via orale gavage met het overnight-inoculum.Vervolgens worden op dag zeven na infectie, tijdens de laatste stap, het caecum, de dikke darm en de luminale inhoud verzameld. De weefsels worden geplaatst, de bacteriële kolonies worden geteld en de weefsels worden immunogekleurd voor de betreffende gastheerproteïnen. Uiteindelijk kunnen de pathogene belasting, de barrièrefunctie, histologische schade en veranderingen in de respons van de gastheer worden beoordeeld via immunohistochemie.Hoewel deze methode een robuust model biedt voor infectieuze colitis, waardoor de interacties tussen gastheer en pathogeen en immuunresponsen kunnen worden bestudeerd, kan deze ook worden aangepast om de effecten van bacteriële infectie op het risico op dikkedarmkanker te onderzoeken. Over het algemeen zullen personen die ni

the-citrobacter-rodentium-mouse-model-studying-pathogen-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Stel een chronische bacteriële infectie muismodel met...

Chronisch Salmonella Infected Muis Model

Source: Winston, J. A., et al. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the procedure for inoculating antibiotic-pretreated mice with Clostridium difficile spores to establish a murine model of infection for studying pathogenesis and host responses.

Establishing a Mouse Model of Clostridium difficile Infection

Multi-modaliteit beeldvorming is een waardevolle benadering voor het bestuderen van bacteriële kolonisatie in kleine proefdiermodellen. Dit protocol beschrijft infectie van muizen met...

4D multimodale beeldvorming van<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecties in Muizen

Diermodellen hebben bewezen waardevolle instrumenten definiëren gastheer en pathogeen specifieke mechanismen die bijdragen aan de ontwikkeling van chronische ontsteking. Hier beschrijven we een muismodel van orale infectie met het humaan pathogeen Porphyromonas gingivalis en detail methoden om de progressie van inflammatie lokale en systemische plaatsen.

Een muismodel voor pathogenen geïnduceerde Chronische ontsteking op lokale en systemische sites

Hier wordt een procedure beschreven voor de oprichting van systemische infectie in de neonatale rat met culturen van Escherichia coli K1. Deze niet-invasieve procedure toestaat kolonisatie van het maagdarmkanaal, translocatie van het pathogeen in de systemische circulatie, en invasie van het centraal zenuwstelsel bij de choroid plexus.

Non-Invasive Model van Neuropathogenic Escherichia coli Infectie in de Neonatale Rat

De mogelijkheid om urineweginfecties (UTI) te modelleren is cruciaal om bacteriële pathogenese te begrijpen en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische methoden te stimuleren. Het doel van dit werk is om muismodellen van experimentele UTI en katheter-geassocieerde UTI te demonstreren die bevindingen naspelen en voorspellen die bij mensen worden gezien.

Oprichting en karakterisering van UTI en Cauti in een muismodel

Dit protocol beschrijft de cefoperazon muismodel van Clostridium difficile infectie (CDI) met een klinisch relevante en genetisch handelbaar stam, R20291. Nadruk op klinische ziekte monitoring, C. difficile bacteriële opsomming, toxine cytotoxiciteit en histopathologische veranderingen in heel CDI in een muismodel worden beschreven in het protocol.

-Cefoperazone behandelde muismodel van klinisch relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Strain R20291

Een gedetailleerd protocol voor een muismodel voor enterohemorrhagic E. coli (EHEC) kolonisatie met behulp van bacteriën bioluminescentie-label wordt gepresenteerd. Het opsporen van deze bioluminescente bacterie door een niet-invasieve in vivo imaging systeem in levende dieren kan verder ons huidige begrip van EHEC kolonisatie.

Detectie van de Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisatie in lymfkliertest Host door niet-invasieve In Vivo bioluminescentie systeem

Lymfkliertest distale colostomie biedt een lymfkliertest model voor menselijke afleiding colitis, een overwegend lymfatische colitis in dikke darm segment van de fecale stream uitgesloten.

Lymfkliertest distale colostoma, een nieuw Model van afleiding Colitis in C57BL/6 muizen

In dit protocol wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-cel adoptief transfer colitismodel beschreven. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen. Deze zijn specifiek voor een immunodominant darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin, dat wordt overgedragen in ontvangende Rag1-/- muizen, wat leidt tot darmontsteking.

Inductie van darmontsteking door adoptieve overdracht van CBir1 TCR transgene CD4 + T-cellen naar immunodeficiënte muizen

Leer colitis induceren bij muizen met Citrobacter rodentium-infectie via orale gavage. Deze methode onderzoekt pathogeen-gastheer interacties, barrièrefunctie en histologische schade in het gastro-intestinale systeem.

De

Meer video's verkennen