Verbeterd protocol voor Laser Microdissection der humane pancreatische eilandjes Van Chirurgische Specimens
6 januari 2013
Laser microdissectie is een techniek die het herstel van de geselecteerde cellen uit minieme hoeveelheden parenchym mogelijk maakt. Hier beschrijven we een protocol voor die menselijke pancreatische eilandjes van chirurgische preparaten worden gebruikt voor transcriptoom studies. Ons protocol verbetert de intrinsieke autofluorescentie van menselijke beta-cellen, waardoor hun collectie.
Hallo, mijn naam is Dorte van het Thea Hands Institute aan de University of Technology, Reen Laser. Microdissectie is een techniek waarmee een specifieke celpopulatie kan worden verkregen uit zeer kleine hoeveelheden van een oorspronkelijke tumor. De gedissecteerde cellen kunnen worden gebruikt voor transcriptomische en proteomische studies, DNA-beoordelingen of chromosoomanalyses.
Hier presenteren wij ons protocol voor het verkrijgen van menselijke pancreatische metacellen uit chirurgische specimens voor gebruik in transcriptomische studies. Snijd het pancreatische weefsel in kleine stukjes. Plaats één stukje in het midden van een cryovorm en bedek dit met gekoelde inbeddingscompound.
Bevries het weefsel onmiddellijk met gekoelde twee materialen Bhutan en bewaar het bij -80 °C. Label 40 adhesieluides voor secties en koel deze vooraf af in de gekoelde kamer. Fixeer het bevroren weefsel op de monsterhouder met de OCT-compound nadat het cryoblok is bijgesneden.
Snijd 40 coupes van 10 micrometer dik. Breng één coupe over naar één objectglas door met uw vinger de achterzijde van het glas aan te raken om enkel de positie te verwarmen waar de coupe op wordt geplaatst. Droog de coupes twee tot drie minuten in de cryodesiccator en bewaar ze daarna bij minus 80 degrees Celsius, bereid de stainingsreagentia voor en koel alle vloeistoffen, behalve PBS, op ijs. Dit zal de intrinsieke autofluorescentie van de cellen verhogen voorafgaand aan de microdissectie.
Vier secties worden telkens gedehydrateerd. Behandel twee secties tegelijk. Fixeer deze eerst gedurende 30 seconden in 70%ethanol.
Was de coupes vervolgens met vijf tot zes korte dompelbeurten in water dat behandeld is met DPC. Dehydrateer het weefsel gedurende één minuut in 100% ethanol en herhaal deze stap, en incubeer de preparaten vervolgens vier minuten in seline.
Begin ondertussen met de dehydratie van een ander paar coupes. Laat de objectglazen tot slot drie tot vijf minuten in het donker aan de lucht drogen. Bescherm het weefsel tegen vocht en de autofluorescentie tegen bleking door de twee objectglazen rug-aan-rug in een met folie omwikkelde 50 ml buis te plaatsen. Reinig de microscoop voor de sectie met RNAs away en klem de lijmkap in de robo Mover.
Plaats het preparaat op de tafel en beweeg de dop dicht bij de sectie zonder deze aan te raken. Lokaliseer de eyelets door de autofluorescerende bètacelgebieden te identificeren. De intrinsieke autofluorescentie van menselijke bètacellen verschijnt geel in de opstelling, terwijl pancreaskanalen een heldergroene autofluorescentie vertonen.
Selecteer de beste celgebieden met de tool voor vrije handselectie en microdissecteer deze door de laser te activeren. Dissecteer de oogjes van vier gedestilleerde cryosecties in één kleefkap binnen 40 tot 60 minuten. Indien gewenst, controleer het opgevangen weefsel door de kap naar het controlepunt van de microscoop te verplaatsen.
Verwijder de dop uit de robo mover en pipetteer 10 µL extractiebuffer in het deksel van de dop voor celdisruptie. Incubeer de dop ondersteboven bij 42 °C gedurende 30 minuten.
Centrifugeer het lysaat, label de buis en bewaar deze bij -80 °C tot de RNA-extractie kan plaatsvinden. Voer de laser-microdissectie en lyseren uit met alle 40 cryodissecten. Voeg daarna de 10 lysaten samen en ga verder met de RNA-isolatie met behulp van de UR PU RNA-isolatiekit volgens het meegeleverde protocol om 11 µL RNA te verkrijgen.
In het algemeen hebben we geen direct verband gevonden tussen de hoeveelheid gemicrodissecteerd weefsel en de RNA-opbrengst. Verschillen in het tijdsinterval tussen de afname door de chirurgen en het invriezen van het pancreasmonster na onderzoek door de patholoog kunnen gedeeltelijk verklaren waarom de kwaliteit en kwantiteit van het herwonnen RNA varieerden. Andere belangrijke factoren om rekening mee te houden zijn de toegepaste laserenergie voor microdissectie, waarbij een lagere energie resulteert in een hogere RNA-integriteit, evenals de laserfocus en de afstand van de richtpunten van de laser-druksnijder. Daarnaast kan de RNA-kwantiteit worden geoptimaliseerd door de afstand tussen de adhesiekap en het monster zo klein mogelijk te houden.
Voorkom verlies van gemicrodissecteerd weefsel tijdens het opvangkproces, mits een laser-microdissectiemicroscoop beschikbaar is. Deze procedure kan worden geïmplementeerd bij elke onderzoeksinstelling waar partiële pancreatectomieën worden uitgevoerd, waardoor de toegang tot menselijk ooglidmateriaal van zowel niet-diabetische als diabetische proefpersonen wordt vergroot.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor laser-microdissectie om menselijke pancreaseilandjes uit chirurgische specimens te herstellen. De techniek verbetert de collectie van bètacellen voor transcriptomische studies.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Transcriptomics
Achtergrond
- Laser-microdissectie maakt de isolatie van specifieke celpopulaties mogelijk.
- Het is bijzonder nuttig voor kleine weefselmonsters.
- De techniek kan worden toegepast in diverse studies, waaronder transcriptomische en proteomische analyses.
- Het verbeteren van de autofluorescentie helpt bij het verzamelen van doelcellen.
Doel van de studie
- Het bieden van een gedetailleerd protocol voor het verkrijgen van menselijke pancreaseilanden.
- Het faciliteren van de studie van bètacellen in transcriptomisch onderzoek.
- Het verbeteren van de efficiëntie van celverzameling uit chirurgische specimens.
Gebruikte methoden
- Toepassing van de laser-microdissectietechniek op pancreastweefsel.
- Voorbereiding van weefselmonsters door deze in kleine stukjes te snijden.
- Inbedding van weefsel in een gekoelde verbinding voor optimale dissectie.
- Verzameling van bètacellen voor verdere analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van menselijke pancreaseilandjes.
- Verbeterde autofluorescentie van bètacellen waargenomen.
- Protocol heeft effectiviteit aangetoond voor transcriptomische studies.
- Vergemakkelijkte collectie van specifieke celpopulaties uit kleine monsters.
Conclusies
- Het protocol verbetert het herstel van menselijke pancreaseilandjes.
- Lasermicrodissectie is een waardevol instrument voor cellulaire analyse.
- Verbeterde methoden kunnen leiden tot betere inzichten in transcriptomisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor management
Lasermicrodissectie maakt de precieze isolatie van menselijke pancreatische bètacellen uit beperkte chirurgische monsters mogelijk, waarmee een kritiek knelpunt in transcriptomische studies van diabetes-relevante weefsels wordt weggenomen. Door de intrinsieke autofluorescentie te versterken via verwerking met ijskoude reagentia, verkort het protocol de weefselhandteringstijd en verbetert het de RNA-preservatie, wat direct bijdraagt aan targetvalidatie in onderzoek naar metabole ziekten. Deze aanpak versterkt de mechanistische risicoreductie door gezuiverde celpopulaties te leveren voor downstream omics-toepassingen in vroege discovery-workflows.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door zuivere bètacelpopulaties te isoleren voor route-analyse in modellen voor diabetes type 2.
- Operationele waarde: Vergemakkelijkt biologische risicoreductie door snelle en nauwkeurige identificatie van doelcellen via verbeterde autofluorescentie, waardoor fout-positieven bij de selectie van doelcellen worden verminderd.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op assay-standaardisatie door consistente RNA-inputs van hoge integriteit te leveren vanuit gemicrodissecteerde eilandjes.
- Operationele waarde: Ondersteunt reproduceerbare kwantitatieve resultaten die essentieel zijn voor screening-gereedheid en platformhergebruik in biomarker-ontdekkingspipelines.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door transcriptomische analyse van menselijke pancreaseilandjes mogelijk te maken die direct gekoppeld zijn aan de diabetische pathofysiologie.
- Operationele waarde: Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door gedefinieerde celpopulaties te leveren voor mechanistische vervolgstudies.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door hypothesetoetsing in de vroege biologie mogelijk te maken, assay-ontwikkeling te ondersteunen via gestandaardiseerde inputs en translationele beslissingen te informeren via kwantitatieve moleculaire profilering.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en biologische risicoreductie door het isoleren van bètacellen voor functionele targetvalidatie in modellen van metabole ziekten.
- Screening: Levert assay-klare monsters met reproduceerbare RNA-opbrengsten, wat cruciaal is voor het screenen van compound-effecten op geïsoleerde eilandjes.
- Analytics: Genereert kwantitatieve transcriptomische readouts die vergelijking tussen diabetische en niet-diabetische toestanden mogelijk maken om de identificatie van lead-verbindingen te informeren.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door mens-relevante monsters te leveren die in vitro bevindingen overbruggen naar ziektemechanismen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor toegang tot primaire menselijke eilandjes over meerdere projecten heen, waardoor de afhankelijkheid van variabele donorbronnen wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in bètacel-specifieke signaleringspaden te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door gecontroleerde weefselverwerking en gedefinieerde dissectieparameters.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege beoordeling van target engagement in menselijk-relevante cellen mogelijk te maken, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van diabetes-targets op basis van gevalideerde menselijke eilandjes-transcriptomische profielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in histologie, cryosectie en instrumentatie voor laser-microdissectie.
- Afhankelijk van toegang tot een PALM MicroBeam-systeem of een equivalent LMD-platform met AutoLPC-functionaliteit.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor de omgang met reagentia om autofluorescentie en RNA-integriteit tussen verschillende gebruikers te waarborgen.
- Houdt rekening met aanpassingen voor variërende kwaliteit van pancreasmonsters en ischemische tijd tussen winning en invriezen.
- Beperkt door restricties in RNA-opbrengst, waardoor het poolen van meerdere gemicrodissecteerde monsters noodzakelijk is voor voldoende input voor downstream kits.
