Verbeterd protocol voor Laser Microdissection der humane pancreatische eilandjes Van Chirurgische Specimens
January 6th, 2013
Laser microdissectie is een techniek die het herstel van de geselecteerde cellen uit minieme hoeveelheden parenchym mogelijk maakt. Hier beschrijven we een protocol voor die menselijke pancreatische eilandjes van chirurgische preparaten worden gebruikt voor transcriptoom studies. Ons protocol verbetert de intrinsieke autofluorescentie van menselijke beta-cellen, waardoor hun collectie.
Hallo, Mijn naam is Dorte van het Thea Hands Institute aan de University of Technology, Reen Laser. Microdissectie is een techniek waarmee een speciale celpopulatie kan worden verkregen uit zeer kleine hoeveelheden moedertumor. De gedissecteerde cellen kunnen worden gebruikt voor transcriptomische en proteomische studies, DNA-beoordeling of chromosoombeschouwingen.
Hier bieden we ons protocol voor het verkrijgen van humane pancreas meta cellen uit chirurgische specimens voor transcriptomische studies. Snijd het pancreasweefsel in kleine stukken. Plaats een stuk in het midden van een cryo mal en bedek het met bevroren inbeddingsmateriaal.
Bevriest het weefsel onmiddellijk Met gekoeld twee materiaal Bhutan en bewaar het bij min 80 graden Celsius. Sectielabel 40 kleefdia's en koel ze voor in de Christed Chamber. Bevestig het bevroren weefsel op de monstershouder met de OCT compound na het trimmen van de cryo blok.
Snijd 40 10 micrometer dikke secties. Breng één sectie over naar één dia door de achterkant van de dia met uw vinger aan te raken om alleen de positie voor het plaatsen van de sectie op te verwarmen. Probeer de Secties twee tot drie minuten in de cryo dode en bewaar ze daarna bij min 80 graden Celsius, bereid de Ation reagentia voor en koel alle vloeistoffen behalve seline op ijs. Dit zal de intrinsieke autofluorescentie van huisdierencellen verhogen voorafgaand aan de micro dissectie.
Vier secties worden elke keer ontsmet. Behandel twee secties tegelijk. Bevestig ze eerst in 70% ethanol gedurende 30 seconden.
Was vervolgens de secties met vijf tot zes snelle doppen. In DPC behandeld water daarna. Dehydrateer het weefsel een minuut in 100% ethanol en herhaal deze stap, bekijk de dia's in seline gedurende vier minuten.
Start ondertussen de dehydratie van een ander paar secties. Laat de dia's ten slotte drie tot vijf minuten in het donker drogen. Bescherm het weefsel tegen vocht en de autofluorescentie tegen bleken door de twee dia's rug aan rug in een folie Wrap 50 ml buis te plaatsen. Voor de sectie, reinig de microscoop met RNA's weg en klem de kleefdop in de robo Mover.
Plaats de dia in de stage en beweeg de dop dicht over de sectie zonder deze aan te raken. Lokaliseer de oogjes door de autofluorescente betere celgebieden te identificeren. De intrinsieke autofluorescentie van humane betere cellen ziet er geel uit in de opstelling, terwijl pancreaskanalen helder groene autofluorescentie vertonen.
Selecteer de betere celgebieden met het vrije hand selectiegereedschap en micro dissecteer ze door de laser te starten. Disseceer de oogjes van vier ontdekte cryo secties in één kleeddop binnen 40 tot 60 minuten. Indien gewenst, controleer het gevangen weefsel door de dop naar het controlepunt van de microscoop te verplaatsen.
Verwijder de dop uit de robo mover en pipet het. 10 microliter extractiebuffer in het deksel van de dop voor celdisrupsie. Bewaar de dop ondersteboven bij 42 graden Celsius gedurende 30 minuten.
Centrifugeer het lysate, label de buis en bewaar het bij min 80 graden Celsius tot de RNA-extractie kan plaatsvinden. Voer de Ation laser, micro dissectie en lysis uit met alle 40 cryo dissecties. Verenigt vervolgens de 10 lysaten en ga verder met de RNA-isolatie met behulp van de UR PU RNA-isolatiekit volgens het meegeleverde protocol om 11 microliter RNA te verkrijgen.
In het algemeen vonden we geen directe relatie tussen de hoeveelheid microdissect weefsel en de RNA-opbrengst. Verschillen in het tijdsinterval tussen de oogst door de chirurgen en het invriezen van het pancreasspecimen na onderzoek door de patholoog, kunnen gedeeltelijk verantwoordelijk zijn voor de kwaliteit en hoeveelheid van het herstelde RNA. Andere belangrijke factoren om te overwegen zijn de laserenergie die wordt toegepast voor micro dissectie met de lagere energie, met behulp van de hogere RNA-integriteit, evenals de laserfocus en de afstand van de laserdruksnijderpuntpunten. Bovendien kan de RNA-hoeveelheid worden geoptimaliseerd door de afstand tussen de kleeddop en de laag mogelijk te houden.
Vermijd verlies van microgedissekte weefsel tijdens het opvangproces, op voorwaarde dat de laser micro dissectie microscoop beschikbaar is. Deze procedure kan worden geïmplementeerd in alle onderzoeksinstellingen die gedeeltelijke pancreasresecties uitvoeren, waardoor de toegang tot humaan ooglidmateriaal van zowel niet-diabetische als diabetische proefpersonen wordt vergroot.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor laser microdissectie om humane pancreaseilandjes te herstellen van chirurgische specimens. De techniek verbetert de verzameling van bètacellen voor transcriptomische studies.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Transcriptomics
Achtergrond
- Laser microdissectie maakt het mogelijk om specifieke celpopulaties te isoleren.
- Het is vooral nuttig voor kleine weefselmonsters.
- De techniek kan worden toegepast op verschillende studies, waaronder transcriptomische en proteomische analyses.
- Verbeterde autofluorescentie helpt bij het verzamelen van gerichte cellen.
Doel van het onderzoek
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het verkrijgen van humane pancreaseilandjes.
- Om het onderzoek naar bètacellen in transcriptomische onderzoeken te vergemakkelijken.
- Om de efficiëntie van celverzameling uit chirurgische specimens te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Laser microdissectietechniek toegepast op pancreasweefsel.
- Voorbereiding van weefselmonsters door snijden in kleine stukken.
- Inbedding van weefsel in een gekoeld medium voor optimale dissectie.
- Verzameling van bètacellen voor verdere analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van humane pancreaseilandjes.
- Verbeterde autofluorescentie van bètacellen waargenomen.
- Het protocol toonde effectiviteit aan voor transcriptomische studies.
- Vereenvoudigde verzameling van gerichte celpopulaties uit kleine monsters.
Conclusies
- Het protocol verbetert de herstelbaarheid van humane pancreaseilandjes.
- Laser microdissectie is een waardevol hulpmiddel voor cellulaire analyse.
- Verbeterde methoden kunnen leiden tot betere inzichten in transcriptomische onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables precise isolation of human pancreatic beta cells from limited surgical specimens, addressing a critical bottleneck in transcriptomic studies of diabetes-relevant tissues. By enhancing intrinsic autofluorescence through ice-cold reagent processing, the protocol reduces tissue handling time and improves RNA preservation, directly supporting target validation in metabolic disease research. This approach strengthens mechanistic de-risking by providing purified cell populations for downstream omics applications in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure beta cell populations for pathway analysis in type 2 diabetes models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through rapid, accurate identification of target cells via enhanced autofluorescence, reducing false positives in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by providing consistent, high-integrity RNA inputs from microdissected islets.
- Operational Value: Supports reproducible quantitative outputs essential for screening readiness and platform reuse in biomarker discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by enabling transcriptomic analysis of human pancreatic islets directly linked to diabetic pathophysiology.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supplying defined cell populations for mechanistic follow-up studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis testing in early biology, supporting assay development through standardized inputs, and informing translational decisions via quantitative molecular profiling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating beta cells for functional target validation in metabolic disease models.
- Screening: Delivers assay-ready samples with reproducible RNA yields, critical for screening compound effects on isolated islets.
- Analytics: Generates quantitative transcriptomic readouts that allow comparison between diabetic and non-diabetic states to inform lead identification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing human-relevant samples that bridge in vitro findings to disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for accessing primary human islets across multiple projects, reducing dependency on variable donor sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in beta cell-specific signaling pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through controlled tissue processing and defined dissection parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in human-relevant cells, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diabetes targets based on validated human islet transcriptomic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, cryosectioning, and laser microdissection instrumentation.
- Dependent on access to a PALM MicroBeam system or equivalent LMD platform with AutoLPC capability.
- Necessitates standardized reagent handling protocols to maintain autofluorescence and RNA integrity across users.
- Involves adaptation considerations for varying pancreatic specimen quality and ischemic time between harvest and freezing.
- Limited by RNA yield constraints, necessitating pooling of multiple microdissected samples for sufficient input to downstream kits.
