Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking

Het algemene doel van deze procedure is om individuele bacteriën en evoluerende isogene microkolonies te analyseren met volledige ruimtelijke en temporele resolutie onder constante omgevingscondities met behulp van een microfluïdisch kweekapparaat. Dit wordt bereikt door eerst een microfluïdisch kweeksysteem te ontwerpen met CAD-software. Vervolgens worden wegwerpbare microfluïdische kweekapparaten gefabriceerd uit polydimethylsiloxaan, die picoliter-bioreactoren bevatten met een hoogte van één micron om bacteriën te beperken tot monolaagse groei.

De microbiële cultuur wordt vervolgens in het microfluïdische apparaat geïnfuseerd om individuele moedercellen in de bioreactoren te inoculeren. Deze cellen worden uitgebreid door continue infusie van groeimedium door het systeem. De resultaten worden verkregen via geautomatiseerde time-lapse microscopie, die de cultivatie van een industrieel relevante stam van Corynebacterium glutamicum, groeidata en cel-cel heterogeniteit aantonen.

In de conventionele biotechnologie zijn de meeste analyses gebaseerd op gemiddelde gegevens. Ons microfluïdische apparaat faciliteert enkelcelanalyse van individuele bacteriën met ruimtelijke en temporele resolutie. Het is een nuttig instrument om de cel-tot-cel heterogeniteit van isogene microkolonies nauwkeurig te bestuderen.

We passen gangbare SU-8 fotolithografie en chipmolding met polydimethylsiloxaan toe om microfluïdische apparaten voor eenmalig gebruik te vervaardigen met een resolutie van submicro-media. We hebben onze technologie succesvol gedemonstreerd met verschillende biotechnologische micro-organismen, zoals Escherichia coli en Corynebacterium glutamicum. Begin met het ontwerpen van het microfluïdische apparaat met behulp van CAD-software.

Het ontwerp dat in dit protocol wordt gepresenteerd bestaat uit twee inlaatopeningen voor het zaaien, een gradiëntgenerator voor het mengen van twee verschillende substraten, één uitlaatopening en zes arrays die elk uit vijf bioreactoren bestaan. Bereid in een cleanroom een siliconen wafer van vier inch voor en spin-coat één micron SU-8 2000.5 fotolak op de wafer, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats de gecoate wafer op een warmteplaat bij 95 °C om overtollig oplosmiddel te verwijderen, en plaats vervolgens het eerste laag fotomasker, bestaande uit de vanggebieden van de picoliter-reactoren, en de gecoate wafer in de maskaliner.

Belicht vervolgens de wafer in vacuümcontactmodus met licht van 350 tot 400 nanometer gedurende drie seconden bij een intensiteit van zeven milliwatt per vierkante centimeter. Voer een post-exposure bake uit op een vlakke warmteplaat bij 95 °C om de polymerisatie van SU-8 te initiëren. Plaats de wafer vervolgens gedurende één minuut in een SU-8 developer-bad en breng de wafer daarna voor enkele seconden over naar een tweede container met verse SU-8 developer.

Spoel de wafer met isopropanol om de SU-8 ontwikkelaar te verwijderen en droog de wafer met een stikstofstroom of een wafer-spinner. Voer vervolgens een hard-bake uit op de wafer gedurende 10 minuten bij 150 °C. Maak daarna de tweede laag zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol om de master-mal te voltooien.

Begin de fabricage van de PDMS-chip door de basis en het hardingsmiddel in een verhouding van 10 op 1 te mengen. Ontgas het PDMS-mengsel gedurende ongeveer 30 minuten in een vacuümdesiccator totdat alle bellen zijn verdwenen. Plaats vervolgens de SU-8 wafer in een gietvorm en giet een laag van drie millimeter PDMS-mengsel op de wafer.

Bak vervolgens het PDMS gedurende drie uur bij 80 °C in een oven. Zodra het is afgekoeld, wordt de PDMS-plaat voorzichtig van de wafer gepeld en wordt de plaat met een schoon en scherp scalpel in afzonderlijke chips gesneden. Was de chips gedurende 90 minuten in een n-pentaanbad, gevolgd door twee acetonwasbaden van elk 90 minuten.

Droog de chips een nacht lang om eventuele solventresten te verwijderen. Vlak voor het experiment worden de in- en uitlaatgaten in de PDMS-chip geponst met een naald of een pons met een diameter die iets kleiner is dan die van de connectoren die worden gebruikt om de slangjes met de PDMS-chip te verbinden. Reinig vervolgens de microfluïdische PDMS-chip voorzichtig met isopropanol en gebruik plakband om eventuele aanhechtende stofdeeltjes te verwijderen.

Reinig daarna eerst een glazen objectglas van 170 micron met aceton, vervolgens met isopropanol en daarna met gedeïoniseerd water, en droog het objectglas met een stroom stikstof. Zodra het objectglas schoon en droog is, worden het glazen objectglas en de PDMS-chip gedurende 25 seconden geplasmageoxideerd met een vermogen van 50 Watt en een zuurstofflow van 20 sccm. Lijn vervolgens de PDMS- en glazen chip zorgvuldig uit voordat u de PDMS op het glas plaatst, waardoor deze binnen enkele seconden hecht.

Bevestig de binding door de opstelling 10 seconden te bakken bij 80 °C. Om de bacteriën voor te bereiden op een chip-experiment, inoculeert u een enkele kolonie van een gewenste bacteriële stam, zoals C.glutamicum, in 20 mL vers BHI-medium en incubeert u de cultuur overnacht bij 30 °C op een rotatieve schudder bij 120 RPMs. De volgende ochtend brengt u 10 µL van de startcultuur over naar een tweede cultuur met 20 mL van het gewenste medium en laat u de cellen overnacht groeien onder dezelfde omstandigheden.

Voorverwarm de volgende dag de incubator van een omgekeerde microscoop tot 30 °C. Afhankelijk van de specifieke installatie kan dit tot twee uur duren. Terwijl de installatie opwarmt, opent u de incubator, selecteert u het gewenste objectief en bereidt u dit voor met het benodigde montagemedium.

Monteer vervolgens de chip in de chiphouder en zet deze vast. Centreer het monster op de microscoop en stel scherp op de picoliter bioreactor-arrays. Wanneer de chip in beeld is, verbindt u de in- en uitlaten met de juiste slangjes en plaatst u vervolgens het uitlaatslangje in een afvalreservoir.

Vul vervolgens een spuit met vers medium, plaats deze in een spuitenpomp en spoel de microfluïdische kanalen gedurende één uur door met een stroomsnelheid van 200 nanoliter per minuut om de chip voor te bereiden. Terwijl de cellen zich nog in de vroege exponentiële groeifase bevinden, brengt u één milliliter van de bacteriële cultuur over in een steriele spuit en vervangt u de spuit en de slang die het medium bevatten door de celsuspensie en een nieuwe slang. Infuseer de celsuspensie in de kanalen met een volumetrische stroomsnelheid van 200 nanoliter per minuut totdat de meeste picoliter-bioreactoren gevuld zijn.

Als er slechts een klein aantal bioreactoren is gevuld, verhoog dan de stroomsnelheid naar 800 tot 1200 nanoliters per minuut. Wanneer de gewenste hoeveelheid cellen is gezaaid, ontkoppel dan de celsuspensie, sluit het groeimedium opnieuw aan op de chip en perfuseer met vers medium bij 100 nanoliters per minuut. Scan vervolgens de chip en selecteer specifieke bioreactoren voor time-lapse imaging.

Configureer vervolgens een time-lapse microscopie-sequentie om de bioreactoren van begin tot eind in beeld te brengen en start het experiment. Zodra alle picoliter-bioreactoren overgroeid zijn, stopt u het experiment en voert u de chips op de juiste wijze af. Om met de analyse te beginnen, bepaalt u eerst welke bioreactoren aan alle gewenste criteria voor het experiment voldoen, zoals het aantal en de positie van de moedercellen.

Bepaal met een analyseprogramma, zoals Image J, de groeisnelheid van elke microkolonie door het aantal cellen op elk tijdstip te tellen. Bereken de maximale groeisnelheid door de tijd uit te zetten tegen de logaritme van het aantal cellen. Het hier gepresenteerde systeem kan worden toegepast om verschillende bacteriële soorten te bestuderen met betrekking tot diverse biologische parameters, zoals groei, morfologie of een fluorescent signaal.

In dit voorbeeld werd C.glutamicum gekweekt onder standaard kweekcondities en de resulterende groeicurves afgeleid van drie isogene microkolonies worden hier getoond. De picoliter-bioreactoren zijn ook nuttig gebleken voor het analyseren van de eiwitproductie door middel van time-lapse fluorescentiemicroscopie, zoals hier wordt getoond. Door de cellen bloot te stellen aan een lage concentratie van de eiwitinducer IPTG, kunnen de cel-tot-cel variaties van het eiwit op enkelcelniveau binnen kolonies worden bestudeerd, uitgaande van één enkele moedercel.

De gedemonstreerde techniek kan worden toegepast om individuele bacteriële cellen te monitoren en te analyseren met volledige controle over de omgeving. Dit is nauwelijks mogelijk met behulp van conventionele cultivatiesystemen op laboratoriumschaal. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u microfluïdische cultivatiechips voorbereidt om vergelijkbare analyse van individuele cellen uit te voeren.