Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking
December 6th, 2013
In dit protocol wordt de fabricage, installatie en basisbediening van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cel analyse van prokaryotische micro-organismen geïntroduceerd. Industrieel relevante micro-organismen werden geanalyseerd als bewijs van principe, waardoor inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit over bepaalde tijdsperioden mogelijk werden, wat nauwelijks mogelijk is met conventionele methoden.
Het algemene doel van deze procedure is om enkele bacteriën en zich ontwikkelende isogene microkolonies te analyseren met volledige ruimtelijke en temporele resolutie onder constante omgevingscondities met behulp van een microfluïdisch kweekapparaat. Dit wordt bereikt door eerst een microfluïdisch kweeksysteem te ontwerpen met behulp van CAD-software. Vervolgens worden wegwerpbare microfluïdische kweekapparaten gemaakt van polydimethylsiloxaan die picoliter bioreactoren bevatten, een micron en hoogte om bacteriën te beperken tot monolaaggroei.
Microbiële cultuur wordt vervolgens in het microfluïdische apparaat geïnjecteerd om enkele moedercellen binnen de bioreactoren te inoculeren. Deze cellen worden uitgebreid door continue infusie van groeimedium door het systeem. Resultaten worden verkregen uit geautomatiseerde time-lapse microscopie die de kweek van een industrieel relevante stam van Corynebacterium glutamicum, groeidata en cel-cel heterogeniteit toont.
In conventionele biotechnologie zijn de meeste analyses gebaseerd op gemiddelde gegevens. Ons microfluïdische apparaat maakt eenpersoonsanalyse van individuele bacteriën met ruimtelijke en temporele resolutie mogelijk. Het is een nuttig hulpmiddel om de cel-cel heterogeniteit van isogene microkolonies nader te bekijken.
We passen algemene SU-8 fotolitografie en polydimethylsiloxaan chipvorming toe om wegwerpbare microfluïdische apparaten met sub micro media resolutie te vervaardigen. We hebben onze technologie met succes gedemonstreerd met verschillende biotechnische micro-organismen zoals Escherichia coli en Corynebacterium glutamicum. Om te beginnen, ontwerpt u het microfluïdische apparaat met behulp van CAD-software.
Het ontwerp dat in dit protocol wordt gepresenteerd, bestaat uit twee zaaingangen, een gradiëntgenerator voor het mengen van twee verschillende substraten, een uitlaat en zes arrays die elk vijf bio-reactoren bevatten. Bereid in een cleanroom een vier-inch siliciumwafer voor en draai een laag van één micron SU-8 2000.5 fotoresist op de wafer zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats de gecoate wafer op een hotplate bij 95 graden Celsius om overtollig oplosmiddel te verwijderen en plaats vervolgens de eerste laag fotomasker bestaande uit de vasthoudgebieden van de picoliterreactoren en de gecoate wafer in de maskeraligner.
Stel vervolgens de wafer in vacuümcontactmodus bloot aan 350 tot 400 nanometer licht gedurende drie seconden met een intensiteit van zeven milliwatt per vierkante centimeter. Voer een post-exposure bake uit op een vlakke hotplate bij 95 graden Celsius om de polymerisatie van SU-8 te initiëren. Plaats vervolgens de wafer gedurende één minuut in een SU-8 developerbad en breng de wafer vervolgens over in een tweede container met verse SU-8 developer gedurende enkele seconden.
Spoel de wafer in isopropanol om de SU-8 developer te verwijderen en droog de wafer met behulp van stikstofstroom of een wafer spinner. Bak vervolgens de wafer gedurende 10 minuten bij 150 graden Celsius. Fabriqueer vervolgens de tweede laag zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol om de mastermal te voltooien.
Begin met de PDMS chipfabricage door de basis en het draagmiddel in een verhouding van 10 tot 1 te mengen. Ontgast het PDMS-mengsel gedurende ongeveer 30 minuten in een vacuüm exsiccator tot alle luchtbellen zijn verdwenen. Plaats vervolgens de SU-8 wafer in een mal en giet een drie millimeter laag PDMS-mengsel op de wafer.
Bak vervolgens de PDMS gedurende drie uur bij 80 graden Celsius in een oven. Zodra het is afgekoeld, verwijdert u voorzichtig de PDMS plaat van de wafer en snijdt u de plaat in enkele chips met behulp van een schone en scherpe scalpel. Was de chips in een n-pentaanbad gedurende 90 minuten, gevolgd door twee wasbeurten met aceton gedurende 90 minuten elk.
Laat de chips een nacht drogen om eventuele resten van oplosmiddel te verwijderen. Vlak voor het experiment, prikt u de inlaat- en uitlaatgaten in de PDMS chip met behulp van een naald of ponsmachine met een iets kleinere diameter dan de connectoren die worden gebruikt om slangen met PDMS chip te verbinden. Reinig vervolgens de microfluïdische PDMS chip zorgvuldig met isopropanol en gebruik scotch tape om eventuele vastzittende stofdeeltjes te verwijderen.
Reinig ook een 170 micron dunne glazen plaat eerst met aceton, vervolgens isopropanol, gevolgd door gedeïoniseerd water en droog de plaat met een stroom stikstof. Zodra het schoon en droog is, oxideert u de glazen plaat en PDMS chip gedurende 25 seconden met behulp van plasma met een vermogen van 50 Watt en een zuurstroomsnelheid van 20 sccm. Richt vervolgens de PDMS en glazen chip zorgvuldig uit voordat u de PDMS op het glas plaatst, wat ervoor zorgt dat deze binnen enkele seconden hecht.
Vastzet de binding door de opstelling gedurende 10 seconden bij 80 graden Celsius te bakken. Om de bacteriën voor een chipexperiment voor te bereiden, inoculeert u een enkele kolonie van een gewenste bacteriestam, zoals C. glutamicum in 20 milliliter vers BHI-medium en incubeer de cultuur een nacht bij 30 graden Celsius op een roterende shaker bij 120 RPM. De volgende ochtend draagt u 10 microliters van de startercultuur over in een tweede cultuur met 20 milliliter van het gewenste medium en laat u de cellen overnacht onder dezelfde omstandigheden groeien.
De volgende dag, verwarmt u de incubator van een omgekeerde microscoop voor tot 30 graden Celsius. Dit kan tot twee uur duren, afhankelijk van de individuele opstelling. Terwijl de opstelling warm wordt, opent u de incubator en selecteert u het gewenste objectief en bereidt u het voor met eventueel vereist montagemedium.
Monteer vervolgens de chip in de chiphouder en zet hem op zijn plaats. Centreer het monster op de microscoop en focus op de picoliter bioreactor arrays. Met de chip in focus, verbindt u de in- en uitlaten met geschikte slangen en plaatst u vervolgens de uitlaatslang in een afvalreservoir.
Vul vervolgens een spuit met vers medium, plaats deze in een spuitpomp en spoel de microfluïdische kanalen gedurende een uur bij een stromingssnelheid van 200 nanoliter per minuut om de chip te primen. Terwijl de cellen nog in de vroege exponentiële groeifase zijn, brengt u één milliliter
Overzicht
Dit protocol introduceert de fabricage en werking van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor enkelcelanalyse van prokaryotische micro-organismen. Het toont inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit van industrieel relevante micro-organismen.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Enkelcelanalyse
- Prokaryotische microbiologie
Achtergrond
- Microfluïdische apparaten maken nauwkeurige controle van omgevingscondities mogelijk.
- Conventionele methoden vertrouwen vaak op gemiddelde gegevens, wat de inzichten in het gedrag van individuele cellen beperkt.
- Enkelcelanalyse kan heterogeniteit tussen cellen onthullen.
- Microbiële kweektechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van groeidynamiek.
Doel van de studie
- Om enkele bacteriën en isogenenische microkolonies te analyseren met ruimtelijke en temporele resolutie.
- Om een microfluïdische kweekapparaat te ontwikkelen voor verbeterde microbiële analyse.
- Om de toepassing van het apparaat met verschillende micro-organismen te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Ontwerpen van microfluïdische systemen met behulp van CAD-software.
- Fabricage van apparaten van polydimethylsiloxaan (PDMS) met picoliter bioreactoren.
- Geautomatiseerde time-lapse microscopie voor gegevensverzameling.
- Inoceren van enkele moedercellen en continu toevoeren van groeimedium.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kweek van Corynebacterium glutamicum en Escherichia coli.
- Inzichten in groeigegevens en cel-cel heterogeniteit.
- Demonstratie van de capaciteiten van de microfluïdische apparaat voor enkelcelanalyse.
- Effectief fabricageproces voor microfluïdische apparaten met sub-micrometer resolutie.
Conclusies
- De microfluïdische PLBR is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van microbieel gedrag.
- Het maakt gedetailleerde analyse van individuele cellen onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk.
- Deze aanpak kan ons begrip van microbiële dynamica aanzienlijk verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic picoliter bioreactor enables single-cell analysis of microbial strains under tightly controlled environmental conditions, addressing a critical gap in phenotypic screening where population averages mask strain heterogeneity. By resolving growth dynamics, morphology, and stress responses at the single-cell level, the platform supports target validation and lead identification in antimicrobial development and strain engineering programs. The system’s compatibility with time-lapse fluorescence microscopy allows real-time monitoring of metabolite or protein production, providing predictive confidence in strain performance before scale-up.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking single-cell behavior to genetic or environmental perturbations in industrially relevant microbes.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct observation of stress response and metabolite production in trapped single cells and microcolonies.
- Predictive Value: Reveals cell-to-cell heterogeneity in growth and fluorescence, improving confidence in strain selection for downstream development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for antimicrobial or metabolic screening by isolating isogenic microcolonies derived from single mother cells.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible single-cell readouts via automated time-lapse imaging, reducing variability in growth rate and fluorescence measurements.
- Scalability: The simple PDMS fabrication and chip-based design allow rapid adaptation across microbial species and assay formats in microfluidics-enabled labs.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-scale single-cell insights to preclinical strain optimization by tracking time-dependent phenotypes under controlled media flow and perturbation conditions.
- Mechanistic De-risking: Allows oscillating media conditions to mimic industrial fermentation stresses, enabling early assessment of robustness and production consistency.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of intracellular fluorescence (e.g., from inducible promoters) with growth dynamics, supporting biomarker-guided strain development.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic picoliter bioreactor fits within the early discovery workflow, enabling hypothesis-driven strain characterization prior to lead identification and preclinical optimization.
- Discovery Biology: Tests strain-specific responses to substrates, inducers, or stressors by monitoring single-cell growth and fluorescence in real time.
- Screening: Generates quantitative, spatially resolved growth curves and fluorescence trajectories for comparing clonal variants under identical conditions.
- Analytics: Provides single-cell resolution data on division rates, morphology shifts, and protein expression, enabling statistical deconvolution of population heterogeneity.
- Translational Research: Connects microfluidic observations to scalable phenotypes by linking single-cell behavior to population-level outcomes in bioproduction contexts.
- Enterprise Reuse: The standardized chip design and fabrication process allow reuse across projects targeting different microbial chassis or production pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in strain performance by resolving isogenic heterogeneity invisible to bulk assays like flow cytometry or plate readers.
- Operational Value: Ensures environmental control and reagent exchange precision through continuous media flow and rapid medium switching, improving assay reliability.
- Strategic Value: Increases confidence in go/no-go decisions by identifying subpopulations with atypical production or stress survival early in discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by flagging strains with unstable or low-yielding subpopulations before investment in scale-up.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, soft lithography, and time-lapse microscopy operation.
- Depends on access to cleanroom facilities for SU-8 master fabrication and PDMS molding equipment.
- Necessitates standardized protocols for chip sterilization, inoculation, and sealing to ensure reproducibility across users and labs.
- Adaptation to non-model organisms may require optimization of trapping dimensions and media flow rates based on cell size and growth kinetics.
- Practical limitations include device fouling during long runs and the need for manual chip handling despite automated imaging.
