Name: Generatie van een nieuw dendritisch celvaccin met melanoom en plaveiselkankerstamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Leer hoe een dendritische celvaccin met kankerstamcellen uit melanoom en plaveiselkanker een sterkere antitumorimmuniteit opwekt dan traditionele vaccins. Deze methode biedt nieuwe mogelijkheden voor kankerimmunotherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door The Will en Jeanne Caldwell Endowed Research Fund van het University of Michigan Comprehensive Cancer Center en gedeeltelijk door NIH grant CA82529 en de Gillson Longenbaugh Foundation.

1. ALDEFLUOR-kleuring
<ol><li>Voorbereiding van celmonsters: Bereid eencellige suspensie van tumorcellen voor, hetzij uit gekweekte tumorcellen, hetzij uit vers geoogste tumormonsters. Tel de cellen en pas de celsuspensie aan tot een concentratie van 1 x10 6 cellen/ml in ALDEFLUOR Assay Buffer.</li>
	<li>Label vier 12 mm x 75 mm polystyreen reageerbuizen als reageerbuizen als volgt: #1: Niet vastgehouden, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR plus DEAB, en #4: 7AAD.</li>
	<li>Plaats voor deze stuurbuizen 1 ml celsuspensie in #1 en #4, maar 2 ml in buis #2. Voeg 5 μl DEAB (ALDH-remmer) toe aan de buis #3 en houd het ijs vast. Voeg vervolgens 10 μl geactiveerd ALDEFLUOR-substraat toe aan buis #2, meng en breng onmiddellijk 1 ml van het mengsel over op buis #3.</li>
	<li>Voeg tegelijkertijd 2 μl geactiveerd ALDEFLUOR-substraat per miljoen cellen toe aan de rest van de cellen (monsterbuizen) ook bij 1 x 106 cellen/ml in ALDEFLUOR Assay Buffer.</li>
	<li>Incubeer zowel de 4 controlebuizen als de monsterbuizen gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C.</li>
	<li>Voeg na incubatie 5 μl 7AAD toe aan de controlebuis #4 en 1 μl 7AAD 1 x 106 cellen aan de monsterbuis. Incubeer 10 min bij 4 °C.</li>
	<li>Centrifugeer alle buizen gedurende 5 min op 250 x g en verwijder supernatant.</li>
	<li>Resuspend cellen in ALDEFLUOR Assay Buffer.</li>
	<li>Voer op flowcytometrie gebaseerde sortering uit.</li>
	<li>Stel de sorteerpoorten in met aldefluor-gebeitst cellen die met DEAB zijn behandeld als negatieve controle en de propidiumjodide (PI) 7AAD-cellen voor levensvatbaarheidscontrole. Op basis van deze controles werd een poort opgericht om de ALDEFLUOR+/ALDHhoge,D5- en SCC7-cellen te onderscheiden. Deze poorten zullen vervolgens worden gebruikt om alle hierboven voorbereide monstercellen voor de ALDEFLUOR+/ALDHhoge D5- en SCC7-cellen te sorteren.</li>
</ol>2. Bereiding van kankerstamcel Lysaat-pulse Dendritic Cell (CSC-TPDC) Vaccin
<ol><li>Euthanaseer muizen (respectievelijk syngeneïsche B6 en C3H) met behulp van CO2 en isoleer dijbeen- en scheenbeenderen.</li>
	<li>Doe de botten 1 minuut in 75% ethanol bij kamertemperatuur. Was vervolgens de botten met HBSS.</li>
	<li>Snijd de botten af en gebruik een naald van 21 G en een spuit van 10 ml om cellen in een schaal te duwen.</li>
	<li>Aspireer en blaas de cellen met behulp van de spuit om de eencellige suspensie te maken.</li>
	<li>Gooi na centrifugeren in 1500 tpm gedurende 5 minuten het supernatant weg. Voeg vervolgens 5 ml RBC-lysisbuffer toe om de RBC gedurende 1 min in 37 °C waterbad te laten lyseren.</li>
	<li>Tel het celnummer en pas de celsuspensie aan tot een concentratie van 1 miljoen cellen/ml in volledig medium (CM) met 10 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Kweek de cellen en compenseer CM plus IL-4 en GM-CSF 3 dagen later.</li>
	<li>Oogst op de 5e dag deonrijpe dendritische cellen (DC's) en bereid het DC-isolatiemedium voor dat 4,2 ml oplossing C plus 1 ml OptiPrep-dichtheidsgradiëntmedium bevat.</li>
	<li>Hang de celkorrels op in 5 ml CM. Voeg de celsuspensie langzaam toe aan het isolatiemedium. Centrifugeer bij 2.000 tpm bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verzamel de DC's tussen de CM en het isolatiemedium. Tel het celnummer en pas de celsuspensie aan tot een concentratie van 1 miljoen cellen/ml in kweekmedium dat 10 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4 bevat.</li>
	<li>Bereid tumorlysaten voor doorALDH-cellen hoog of ongesorteerd D5- of SCC7-cellen op te schorten in kweekmedium en vier keer te onderwerpen aan snelle blootstelling aan bevriezing en dooi, gevolgd door een spin van ∼ 100 x g gedurende 5 minuten om het membraangedeelte van de lysaten te verzamelen.</li>
	<li>Om CSC-TPDC voor te bereiden, pulseer DC's met het lysaat van autologeALDH-hoge cellen. Om H-TPDC voor te bereiden, pulseer DC's met ongesorteerd heterogeen tumorcellysaat. De verhouding tussen DC en tumorcellysaat is hetzelfde.</li>
</ol>3. Vaccinatie en evaluatie van de werkzaamheid
<ol><li>Vaccineer normale B6-muizen respectievelijk met 2.500 D5 CSC-TPDC of D5 H-TPDC tumorcellen subcutaan (s.c.). Vaccineer normale C3H-dieren.c. met respectievelijk 5.000 SCC7 CSC-TPDC- of SCC7 H-TPDC-tumorcellen.</li>
	<li>Daag na vaccinatie de B6-muizen uit met de heterogene D5-tumorcellen i.v.m. Euthanaseer de muizen 20 dagen later met CO2. Oogst de longen enumreer longmetastasen.</li>
	<li>Daag in het SCC7-model de C3H-muizen uit met ongesorteerde SCC7-tumorcellen.c aan de andere kant van het DC-vaccin. Controleer de tumorgrootte.</li>
	<li>Aan het einde van de experimenten euthanaseren de B6- en C3H-muizen met CO2. Op dag 34 na het eerste vaccin euthanaseer muizen met CO2en verzamel tegelijkertijd de milt van elke groep met een aseptische procedure.</li>
	<li>Activeer milt T- en/of B-cellen met geïmmobiliseerde anti-CD3 plus anti-CD28 mAbs in CM die hrIL-2 of LPS plus anti-CD40 (FGK45) mAb ascites bevatten.</li>
	<li>Verzamel na activering supernatanten en gebruik ze voor ELISA-test.</li>
	<li>Voor ELISA-test, laagplaten met antilichamen voor IFNγ, GM-CSF en IgG bij 4 °C O/N.</li>
	<li>Voeg na het aanbrengen van de blokkeerbuffer monsters en normen toe en incubeer bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was de plaat en voeg HRP-detectieantilichaam en TMB-substraat toe voor incubatie.</li>
	<li>Meet de absorptie op een ELISA-plaatlezer op 450 nm binnen 30 minuten na het stoppen van de reactie.</li>
</ol>

<ol><li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1%2Fp53-mediated+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li>
<li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li>
<li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li>
<li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice%3A+an+opposite+effect+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li>
<li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li>
<li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li>
<li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine%3A+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li>
<li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li>
<li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li>
<li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li>
</ol>

STEMCELL Technologies heeft open access publicatiekosten ondersteund.

De immunocompromitteerde gastheren, zoals SCID-muizen, sluiten immunologische beoordelingen van CSC's uit vanwege het gebrek aan adaptieve immuniteit binnen de gastheren. In deze studie evalueerden we de immunogeniciteit van CSC's in immunocompetente hosts, die de patiëntinstellingen beter zouden kunnen nabootsen. Verrijkte CSC's zijn immunogeen en kunnen een effectievere tumorbeschermende immuniteit veroorzaken wanneer hun lysaten als vaccin in DCs worden geladen in vergelijking met niet-geselecteerde tumorcellysaatgepulseerde DC's.  Mechanistisch werd de bescherming verleend door selectieve inductie van CSC-reactieve antilichamen en T-cellen8, evenals de productie van type 1-cytokine, bijvoorbeeld IFNγ en GM-CSF.
De meeste van de huidige immunotherapieën, waaronder dendritische celgebaseerde vaccins en de adoptieve T-celoverdracht, zijn ontworpen om tumorgedifferentieerde antigenen aan te pakken. CSC's, die deze gedifferentieerde antigenen niet kunnen uitdrukken, kunnen daarom aan deze immunologische targeting ontsnappen. Daarentegen kan het CSC-vaccin dat specifiek is ontworpen om zich te richten op kankerstamcellen deze speciale populatie van de kankercellen vernietigen en zo de therapeutische werkzaamheid van het vaccin verbeteren door tumorrecidief en metastase te voorkomen.
In zowel gekweekte tumorcellen als vers geoogste tumoren identificeerden we CSC-verrijkte populatie door flowcytometrie op basis van hoge aldehydedehydrogenase-activiteit. DergelijkeALDH-hoge cellen kunnen worden geïsoleerd door stroomsortering om te worden gebruikt als een antigeenbron om DC te pulseren om CSC-TPDC's te genereren. Vergelijking met ALDH-hoge cellen geïsoleerd uit gekweekte tumorcellen versus van vers geoogste tumoren toonde geen significant verschil in termijn van de inductie van anti-CSC-immuniteit8. Deze resultaten onthulden het potentieel om CSC's te gebruiken die geïsoleerd zijn van gekweekte tumorcellen of van vers geoogste tumoren voor klinische toepassing.
Om klinisch relevant te zijn, moet een vaccin in een therapeutische setting worden onderzocht. Deze experimenten worden nu uitgevoerd in ons laboratorium.

Kankerstamcellen zijn relatief resistent tegen conventionele chemotherapie en radiotherapie1,2. Aan de andere kant kan deze populatie cellen de cellen zijn die verantwoordelijk zijn voor de terugval en progressie van kankers na traditionele kankertherapieën1-4. Vanwege het gebrek aan expressie van gedifferentieerde tumorantigenen op kankerstamcellen, kunnen kankerstamcellen ontsnappen aan de huidige immunologische interventies van therapie voor kanker, die meestal zijn ontworpen om de antigenen op de gedifferentieerde tumorcellen te richten. Daarom kan de ontwikkeling van nieuwe strategieën die specifiek gericht zijn op en vernietigen van de kankerstamcellen beloften bevatten om de therapeutische effectiviteit van de huidige kankerbehandeling te verhogen. Hiertoe hebben we met kankerstamcel (CSC) verrijkte populaties geïsoleerd uit twee dierlijke tumoren (melanoom D5 en plaveiselcelkanker SCC7) en gebruikten we ze als een antigeenbron om antigeen presenterende cellen (dendritische cellen, DC) te pulseren om het CSC-TPDC-vaccin voor te bereiden. Vervolgens evalueerden we de antitumorimmuniteit geïnduceerd door het CSC-TPDC-vaccin in respectievelijk de syngeneïsche immunocompetente gastheren, B6-muizen en C3H-muizen. De CSC-TPDC-geïnduceerde antitumor werkzaamheid werd vergeleken met het traditionele DC-vaccin gepulseerd met lysaat uit ongesorteerde heterogene tumorcellen (H-TPDC), die eerder is gebruikt door onze groep5,6, evenals door andere onderzoekers7, zowel in preklinische studies als in klinische studies.

<table><tbody><tr><td>ALDHEFLOUR KIT</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-4</td><td>Pepro Tech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>Murine GM-CSF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Mouse GM-CSF ELISA KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>555167</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>BD OptEIA TMB Substrated Reagent Set</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>336834</td><td></td></tr><tr><td>Kcjunior</td><td>Bio-Tek Instruments</td><td>176058</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van een nieuw dendritisch celvaccin met melanoom en plaveiselkankerstamcellen

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identificeerden kankerstamcel (CSC)-verrijkte populaties van murien melanoom D5 syngeneïsche tot C57BL/6 muizen en de plaveiselkanker SCC7 syngeneic tot C3H muizen met ALDEFLUOR/ALDH als marker, en testten hun immunogeniciteit met behulp van het cellysaat als een bron van antigenen om dendritische cellen (DC's) te pulseren. DC's gepulseerd met ALDHhoge CSC lysaten veroorzaakten significant hogere beschermende antitumor immuniteit dan DC's gepulseerd met de lysaten van ongesorteerde hele tumorcellysaten in beide modellen en in een longmetastase instelling en een s.c. tumorgroeiinstelling, respectievelijk. Dit fenomeen was te wijten aan CSC vaccin-geïnduceerde humorale en cellulaire anti-CSC reacties. Met name splenocyten geïsoleerd van de gastheer onderworpen aan CSC-DC-vaccin produceerden significant hogere hoeveelheid IFNγ en GM-CSF dan splenocyten geïsoleerd van de gastheer die werd blootgesteld aan ongesorteerd tumorcellysaat gepulseerd-DC-vaccin. Deze resultaten ondersteunen de inspanningen om een autologe CSC-gebaseerde therapeutische vaccin te ontwikkelen voor klinisch gebruik in een adjuvante setting.

ALDEFLUOR/ALDH is gebruikt als een enkele marker om stamcellen te isoleren in meerdere maligniteiten8-11. We identificeerden met kankerstamcel verrijkte populaties in twee tumormodellen D5 en SCC7 door ALDEFLUOR als marker te gebruiken. We ontdekten ALDEFLUOR+ cellen in murien melanoom B16-D5 en plaveiselcelkanker SCC7. We ontdekten dat ALDEFLUOR+ cellen ongeveer 0,5% en 5,2% bijdragen in gekweekte D5- en SCC7-tumorcellijnen (figuur 1). Vers geoogste tumorcellen van gevestigde tumoren zijn geanalyseerd om het bestaan van ALDEFLUOR+ cellen te bevestigen. Zoals ook blijkt uit figuur 1,waren er respectievelijk 2,5% en 4,2% van de ALDEFLUOR+ cellen van in vivo gevestigde D5- en SCC7-tumoren. De tumorigeniciteit en het zelfvernieuwingsvermogen van deze gesorteerde D5- en SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH-hoge populaties werden geëvalueerd in de syngeneïsche immunocompetente gastheer, de C57BL/6- en C3H-muizen, respectievelijk8.
We hebben heterogene ongesorteerde tumorcellysaat gebruikt om DC's (H-TPDC) te pulseren, zowel in dierstudies als in klinische studies5,6. Om de immunogeniciteit van CSC's te onderzoeken, hebben we ALDHhoge CSC en gepulseerd DC geïsoleerd met het lysaat van de CSC's om CSC-TPDC te genereren (figuur 2) en H-TPDC gebruikt als een conventionele kankervaccincontrole om te testen of CSC-TPDC enig gunstig effect heeft bij het voorkomen van tumorgroei.
We evalueerden de immunogeniciteit van CSC's door beschermende antitumorimmuniteit geïnduceerd door CSC-TPDC te onderzoeken. In het D5-model werden naïeve immunocompetente muizen gevaccineerd s.c met CSC-TPDC of H-TPDC (bij hetzelfde lysaat: DC-verhouding). Controlegroepen kregen zoutoplossing (PBS). Een week na het laatste vaccin werden de muizen intraveneus uitgedaagd met ongesorteerde D5-tumorcellen(i.v.m.),en de longen werden 3 weken later geoogst om longmetastasen op te sommen. Zoals blijkt uit tabel 1, ontwikkelden muizen die met de H-TPDC werden behandeld, in vergelijking met de PBS-groep minder longmetastasen. Belangrijk is dat muizen die met CSC-TPDC werden behandeld significant minder longmetastasen hadden dan H-TPDC-vaccingroep in beide uitgevoerde experimenten. In het SCC7-model werden normale C3H-dieren gevaccineerd s.c met respectievelijk SCC7 CSC-TPDC of H-TPDC op de rechterflank, gevolgd door een uitdaging met ongesorteerde SCC7-tumorcellen s.c in de linkerflank. In vergelijking met de PBS-groep veroorzaakte H-TPDC een bescheiden antitumorimmuniteit tegen tumorgroei. Er was echter een significante remming van tumorgroei bij muizen die werden behandeld met CSC-TPDC in vergelijking met zowel de controlegroep als de H-TPDC-groep (p<0,05, figuur 3). Deze resultaten geven aan dat CSC's kunnen worden gebruikt als een effectievere antigeenbron om DC's te laden dan traditionele ongesorteerde tumorcellen bij het induceren van beschermende immuniteit tegen de uitdaging van tumorcellen.
Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de waargenomen CSC-geïnduceerde beschermende antitumorimmuniteit verder te begrijpen, hebben we de milt geoogst van de dieren die aan het einde van de experimenten aan DC-vaccinaties werden onderworpen. De miltcellen werden vervolgens geactiveerd door anti-CD3/CD28/IL-2 of anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40. Vervolgens werden de kweeksupernatanten verzameld om de expressie van cytokinen en antilichamen te detecteren.  De miltcellen van de met D5 CSC-TPDC of SCC7 CSC-TPDC gevaccineerde dieren hadden significant hogere producties van IFNγ en GM-CSF (figuur 4). Bovendien was er significant (p<0,05) hogere IgG-productie door LPS/anti-CD40 geactiveerde miltcellen verzameld bij de dieren die waren gevaccineerd met D5 CSC-TPDC of SCC7 CSC-TPDC in vergelijking met D5 H-TPDC of SCC7 H-TPDC. Deze antilichamen bleken zich te binden aan respectievelijk D5 - en SCC7-CSC 's , en een dergelijke binding zou kunnen leiden tot de CSC-lysis in aanwezigheid van complement8.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> Figuur 1. ALDHFLUOR+/ALDHhoge populaties werden gedetecteerd in gekweekte evenals nieuw geoogste verse murine D5 melanoom en SCC7 plaveiselceltumoren. Tumorcellen behandeld met 50 mmol/L DEAB, een specifieke ALDH-remmer, werden gebruikt als negatieve controle.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> Figuur 2. Generatie van dendritische celgebaseerde kankerstamcelvaccins. Voor de bereiding van CSC-TPDC en H-TPDC werden beenmerg-afgeleide dendritische cellen gepulseerd met respectievelijk ALDHhoge of ongesorteerde tumorcellysaten.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> Figuur 3. CSC lysaat gepulseerd DC (CSC-TPDC) vaccin kan een effectievere beschermende antitumor immuniteit induceren in de s.c. SCC7 tumor model. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> Figuur 4. Krachtigere systemische cellulaire reacties in immunocompetente gastheer gevaccineerd met CSC-TPDC.  Splenocyten werden geoogst van de dieren die werden onderworpen aan H-TPDC- of CSC-TPDC-vaccinatie en werden geactiveerd zoals aangegeven. De kweeksupernatanten werden vervolgens verzameld voor cytokinedetectie met behulp van ELISA.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>

Geëvalueerd in syngeneïsche immunocompetente gastheren, toonde het op kankerstamcel (CSC) gebaseerde dendritische cel (DC) vaccin een significant hogere antitumorimmuniteit aan dan traditionele DC-vaccins gepulseerd met heterogene bulktumorcellen.

Generatie van een nieuw dendritisch celvaccin met melanoom en plaveiselkankerstamcellen

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Het algemene doel van deze procedure is het evalueren van de antitumorimmuniteit van een kankerstamcel- of CSC-gebaseerd dendritisch cel- of DC-vaccin in een immuuncompetente gastheer. Dit wordt bereikt door eerst alor-positieve aldehyde-dehydrogenase- of ALDH-high CSC's te isoleren uit heterogene tumorcellen. In de tweede stap worden CSC-dc's geïsoleerd en vervolgens gepulst met lysaat voor het vaccin.Vervolgens wordt het CSC-lysaat Pulses DC- of TP DC-vaccin toegediend aan normale syngene syngene immunocompetente gastheren. Daarna wordt in de laatste stap de beschermende anti-tumorwerkzaamheid van het C-S-C-T-P-D-C-vaccin beoordeeld. Ten slotte kan ELISpot worden uitgevoerd om de door het C-S-C-T-P-D-C-vaccin geïnduceerde anti-CSC-immuniteit door t-cellen en antilichamen van de gastheer te evalueren.Dit project brengt twee van de meest boeiende gebieden van kankeronderzoek samen: het gebied van kankerstamcellen en het gebied van tumorimmunotherapie. Ons laboratorium behoorde tot de eersten die kankerstamcellen in solide tumoren ontdekten. Dit zijn de zaden van de kanker die zowel de groei als de metastase aansturen.Vandaag ziet u een nieuwe benadering waarbij immunotherapie wordt gebruikt om specifiek deze kankerstamcellen te targeten. We maken gebruik van een specifieke marker genaamd aldehyde dehydrogenase, die kan worden gedetecteerd met de Alde fluoro assay. U ziet artsen Lin Liu en Huon Tau samenwerken met Dr. Chow Lee.We hopen dat we door deze kankerstamcellen te targeten, de uitkomst voor patiënten met vele soorten kanker zullen verbeteren. Begin met het suspenderen van de relevante tumorcellen in alor-assaybuffer bij een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Draag vervolgens alle tumorcellen, behalve drie milliliter, over naar elk van de monsterbuisjes en label vier polystyreen controlebuisjes van 12 bij 75 millimeter als volgt: ongekleurd, alor, ALOR plus DEAB en 7-AAD. Doseer één milliliter van de celsuspensie in de ongekleurde en de 7-AAD buisjes en twee milliliter in de aldefloor-buis.Voeg vervolgens vijf µL DEAB toe aan de ALOR plus DEAB-buis. Plaats de buizen op ijs en meng vervolgens 10 µL geactiveerd alor-substraat in de alor-buis. Draag onmiddellijk één mL van de substraatoplossing over naar de ALOR plus DEAB-buis, en voeg vervolgens twee µL geactiveerd alor-substraat per 1 miljoen cellen toe aan elk van de monsterbuizen.Incubeer alle buisjes 30 minuten in een waterbad van 37 °C en voeg vervolgens vijf µL 7-AAD toe aan het 7-AAD-buisje en één µL 7-AAD per 1 miljoen cellen aan elk monsterbuisje. Bewaar deze buisjes 10 minuten bij 4 °C. Centrifugeer alle buisjes vijf minuten bij 250 ×g bij kamertemperatuur en resuspendeer de pellets in Aldefluor-assaybuffer voor fluorescence-activated cell sorting.Gebruik de alde Fluor plus DEAB-cellen als negatieve controle en de met zeven A a D gekleurde cellen als levensvatbaarheidscontrole om de sorteerpoorten in te stellen. Stel op basis van deze controles een poort in om de alor-positieve A LDH, high D vijf- en SCC zeven-cellen te onderscheiden. Gebruik dit vervolgens om de monstercellen te sorteren in alor-positieve A LDH, high D vijf- en SCC zeven-populaties.Om de dendritische cellen te genereren, isoleert u eerst de femur- en tibiabeenderen van een C 57 black six en een C3 H muis. Steriliseer de beenderen gedurende één minuut bij kamertemperatuur in 75% ethanol en was ze vervolgens in HBSS. Snijd daarna de uiteinden van de beenderen af en gebruik een spuit van 10 milliliter uitgerust met een naald van 21 gauge om het beenmerg in een Petrischaal te spoelen; aspireer en doseer de cellen enkele keren om een enkelcel-suspensie te creëren en centrifugeer vervolgens de cellen.Incubeer het pellet in vijf milliliter rode bloedcel-lysisbuffer gedurende één minuut in een waterbad van 37 °C. Pas na het tellen van de cellen het volume aan naar 1 × 10⁶ cellen per milliliter in kweekmedium aangevuld met G-M-C-S-F en IL-4. Kweek de cellen vervolgens bij 37 °C en 5% CO2, waarbij het medium en de cytokinen na drie dagen worden ververst.Oogst op dag vijf de onrijpe dendritische cellen. Resuspendeer na het centrifugeren van de cellen de pellets in vijf milliliter kweekmedium en breng de celsuspensie vervolgens voorzichtig over op vers bereid isolatiemedium. Verzamel na het opnieuw centrifugeren van de cellen de dc's tussen de lagen kweekmedium en isolatiemedium.Pas na het tellen van de cellen het volume aan naar een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter in kweekmedium, aangevuld met G-M-C-S-F en IL-4. Maak nu de tumorlysaten door de gesorteerde cellen viermaal bloot te stellen aan snelle vries-dooi-cycli, gevolgd door centrifugatie om het membraandeel van de lysaten te verzamelen. Pulseer vervolgens de DCS met het lysaat van de gesorteerde autologe ALDH-hoge cellen om de CSC TPC's voor te bereiden.Om de H-T-P-D-C-puls voor te bereiden, injecteer dan voor de vaccinatie van de experimentele recipiënte dieren subcutaan 1 × 10⁶ van de gepulseerde dcs met onge Modelleerd heterogeen tumorcellysaat, gesuspendeerd in 100 µL PBS, in de linkerflank van elke muis. Dien na vaccinatie intraveneus 1 × 10⁵ heterogene D5-tumorcellen in 100 µL PBS toe om de C57BL/6 recipiënte muizen uit te dagen. Voor het SCC7-model worden de C3H recipiënte muizen subcutaan uitgedaagd met 1 × 10⁶ onge Modelleerde SCC7-tumorcellen in 100 µL PBS aan de tegenovergestelde zijde van het DC-vaccin.Maak een suspensie van enkelvoudige cellen van de milten van de ontvangende C3 H-muizen. Activeer vervolgens de splenische T- en B-cellen met geïmmobiliseerde anti-CD3 en anti-CD28 monoklonale antilichamen in kweekmedium aangevuld met de juiste stimulus. Verzamel na vier dagen de supernatanten en coat vervolgens ELISA-platen met antilichamen tegen interferon-gamma, GM-CSF of IgG gedurende één nacht bij 4 °C. Blokkeer de volgende dag de plaat voor aspecifieke binding, breng de standaarden en de zojuist verzamelde supernatanten aan en incubeer de platen vervolgens bij kamertemperatuur. Voeg na het wassen gedurende één uur het HRP-detectieantilichaam toe en voeg daarna het TMB-substraat toe.Meet tot slot de absorbentie op een ELISA-plaatlezer bij 450 nanometer binnen 30 minuten na het stopzetten van de reactie. Alor is gebruikt als marker om stamcellen te isoleren in meerdere maligniteiten, waaronder de twee met kankerstamcellen verrijkte populaties D vijf en SCC zeven; specifiek zoals aangetoond in deze dot plots, dragen alor-positieve cellen ongeveer 0,5% en 5,2% bij van de gecultiveerde D vijf en SCC zeven tumorcellijnen respectievelijk. Er is ook vastgesteld dat vers geoogste tumorcellen 2,5% en 4,2% alor-positieve cellen bevatten uit respectievelijk in vivo gevestigde D vijf en SCC zeven tumoren.Tumorcellen behandeld met de D-E-A-B-A specifieke A LDH-remmer werden gebruikt als negatieve controle. De immunogeniciteit van kankerstamcellen werd geëvalueerd door de beschermende antitumorimmuniteit te onderzoeken die werd geïnduceerd door CSC TPC's met behulp van het zojuist gedemonstreerde vaccinatiemodel. Zoals in deze tabel wordt getoond, ontwikkelden muizen behandeld met H TPC's minder longmetastasen dan muizen die alleen met PBS waren behandeld.Belangrijk is dat muizen die behandeld waren met CSC-TPC's nog minder longmetastasen hadden dan dieren die alleen met H-T-P-D-C of PBS waren behandeld. In het SCC seven-model werden normale C3 H-dieren gevaccineerd zoals zojuist gedemonstreerd, vergeleken met de controlegroep. H-TPC's induceerden een bescheiden anti-tumorimmuniteit, terwijl CSC-TPC's een significante remming van de tumorgroei induceerden. Deze resultaten geven aan dat CSC's mogelijk kunnen worden gebruikt als een effectievere antigenbron voor het laden van DC's dan traditionele ongesorteerde tumorcellen voor het induceren van protectieve immuniteit tegen de challenge met tumorcellen.Om de mechanismen ten grondslag aan de waargenomen door CSC geïnduceerde beschermende antitumorimmuniteit verder te begrijpen, werden lymfocyten van DC-gevaccineerde dieren geactiveerd en werd hun cytokinproductie gemeten via ELISA; zoals zojuist aangetoond was de cytokinproductie significant hoger bij de lymfocyten die waren geoogst van dieren gevaccineerd met D5 CSC TPCs of SCC7 CSC TPCs, vergeleken met die van dieren gevaccineerd met D5 HTPCs of SCC7 HTCs. Vandaag heeft u gezien hoe de Alamar Blue-assay wordt gebruikt om kankerstamcellen te isoleren.Deze kankerstamcellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor de ontwikkeling van immunotherapieën met gebruik van dendritische cellen. Wij hopen dat deze immunotherapieën, of ze nu alleen of in combinatie met bestaande therapieën worden ingezet, de prognose voor patiënten met vele soorten kanker zullen verbeteren.

generation-novel-dendritic-cell-vaccine-using-melanoma-squamous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a cell-based tumor vaccination assay. A mouse, intradermally injected with B16-F10 melanoma cells for tumor formation, is vaccinated with B16-F10 cells secreting Flt3L cytokine near the developed tumor. The secreted Flt3L from the vaccine promotes the maturation and proliferation of dendritic cells that then present tumor antigens to T cells in lymph nodes, triggering a targeted anti-tumor immune response.

Tumor Implantation and Injection of a Tumor Vaccine in a Mouse Model

De meest gebruikte methode voor het genereren van grote aantallen autologe dendritische cellen (DCs) voor gebruik bij tumor immunotherapie beschreven. De methode maakt gebruik van IL-4 en GM-CSF om DCs te onderscheiden van monocyten. De onrijpe DCs worden gestimuleerd om te rijpen en daarna beladen met antigenen voordat ze geïnjecteerd terug in de patiënt.

Voorbereiding van de Tumor antigenen opgeladen Mature dendritische cellen voor immunotherapie

Dit artikel beschrijft de bereiding van vers verkregen melanoomweefsel in primaire celculturen en hoe verontreinigingen van erytrocyten en fibroblasten uit de tumorcellen. Tot slot beschrijven we hoe...

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

Het doel van dit protocol is om het protocol te laten zien voor het herprogrammeren van in melanoom geïnfiltreerde tumorlymfocyten in geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

De transimmunisatie (TI) apparaat of plaat en aanverwante protocollen zijn ontwikkeld om de belangrijkste kenmerken van extracorporele fotochemo therapie (ECP) te repliceren, in een experimentele setting, waardoor voor de productie van fysiologisch geactiveerd, tunable dendritische cellen (DCs) voor kanker immunotherapie.

Nieuw protocol voor het genereren van fysiologische immunogeen dendritische cellen

Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van functionele tumor antigen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide CD8αβ+ enkele positieve T-cellen met behulp van OP9/dll1-co-cultuur systeem.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

Het protocol presenteert een kankerimmunotherapiemodel met behulp van celgebaseerde tumorvaccinatie met Flt3L-tot expressie brengend B16-F10 melanoom. Dit protocol demonstreert de procedures, waaronder de voorbereiding van gekweekte tumorcellen, tumorimplantatie, celbestraling, meting van tumorgroei, isolatie van intratumorale immuuncellen en flowcytometrie-analyse.

Experimenteel melanoom immunotherapiemodel met behulp van tumorvaccinatie met een hematopoëtisch cytokine

Er wordt een uniek, uitgebreid protocol gepresenteerd voor het genereren van gedesialyleerde humane monocyt-afgeleide dendritische cellen (mo-DC's) uit geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) met behulp van een sialidasebehandeling. Verder worden methoden beschreven om de fenotypische en functionele karakterisering van mo-DC's te beoordelen en te evalueren hoe behandeling met sialidase het rijpingsniveau van mo-DC's verbetert.

Generatie van monocyt-afgeleide dendritische cellen met verschillende gesialyleerde fenotypes

Dit protocol beschrijft de in vivo herprogrammering van muizenkankercellen tot type 1 dendritische-achtige cellen binnen de tumormicro-omgeving door middel van geforceerde expressie van de transcriptiefactoren PU.1, IRF8 en BATF3.

Kanteerbare in vivo herprogrammering van tumorcellen tot type 1 conventionele dendritische celachtige cellen

Leer hoe een dendritische celvaccin met kankerstamcellen uit melanoom en plaveiselkanker een sterkere antitumorimmuniteit opwekt dan traditionele vaccins. Deze methode biedt nieuwe mogelijkheden voor kankerimmunotherapie.

Generatie van een nieuw dendritisch celvaccin met melanoom en plaveiselkankerstamcellen

Meer video's verkennen