Generatie van een nieuw dendritisch celvaccin met melanoom en plaveiselkankerstamcellen

Het algemene doel van deze procedure is het evalueren van de antitumorimmuniteit van een kankerstamcel- of CSC-gebaseerd dendritisch cel- of DC-vaccin in een immuuncompetente gastheer. Dit wordt bereikt door eerst alor-positieve aldehyde-dehydrogenase- of ALDH-high CSC's te isoleren uit heterogene tumorcellen. In de tweede stap worden CSC-dc's geïsoleerd en vervolgens gepulst met lysaat voor het vaccin.

Vervolgens wordt het CSC-lysaat Pulses DC- of TP DC-vaccin toegediend aan normale syngene syngene immunocompetente gastheren. Daarna wordt in de laatste stap de beschermende anti-tumorwerkzaamheid van het C-S-C-T-P-D-C-vaccin beoordeeld. Ten slotte kan ELISpot worden uitgevoerd om de door het C-S-C-T-P-D-C-vaccin geïnduceerde anti-CSC-immuniteit door t-cellen en antilichamen van de gastheer te evalueren.

Dit project brengt twee van de meest boeiende gebieden van kankeronderzoek samen: het gebied van kankerstamcellen en het gebied van tumorimmunotherapie. Ons laboratorium behoorde tot de eersten die kankerstamcellen in solide tumoren ontdekten. Dit zijn de zaden van de kanker die zowel de groei als de metastase aansturen.

Vandaag ziet u een nieuwe benadering waarbij immunotherapie wordt gebruikt om specifiek deze kankerstamcellen te targeten. We maken gebruik van een specifieke marker genaamd aldehyde dehydrogenase, die kan worden gedetecteerd met de Alde fluoro assay. U ziet artsen Lin Liu en Huon Tau samenwerken met Dr. Chow Lee.

We hopen dat we door deze kankerstamcellen te targeten, de uitkomst voor patiënten met vele soorten kanker zullen verbeteren. Begin met het suspenderen van de relevante tumorcellen in alor-assaybuffer bij een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Draag vervolgens alle tumorcellen, behalve drie milliliter, over naar elk van de monsterbuisjes en label vier polystyreen controlebuisjes van 12 bij 75 millimeter als volgt: ongekleurd, alor, ALOR plus DEAB en 7-AAD. Doseer één milliliter van de celsuspensie in de ongekleurde en de 7-AAD buisjes en twee milliliter in de aldefloor-buis.

Voeg vervolgens vijf µL DEAB toe aan de ALOR plus DEAB-buis. Plaats de buizen op ijs en meng vervolgens 10 µL geactiveerd alor-substraat in de alor-buis. Draag onmiddellijk één mL van de substraatoplossing over naar de ALOR plus DEAB-buis, en voeg vervolgens twee µL geactiveerd alor-substraat per 1 miljoen cellen toe aan elk van de monsterbuizen.

Incubeer alle buisjes 30 minuten in een waterbad van 37 °C en voeg vervolgens vijf µL 7-AAD toe aan het 7-AAD-buisje en één µL 7-AAD per 1 miljoen cellen aan elk monsterbuisje. Bewaar deze buisjes 10 minuten bij 4 °C. Centrifugeer alle buisjes vijf minuten bij 250 ×g bij kamertemperatuur en resuspendeer de pellets in Aldefluor-assaybuffer voor fluorescence-activated cell sorting.

Gebruik de alde Fluor plus DEAB-cellen als negatieve controle en de met zeven A a D gekleurde cellen als levensvatbaarheidscontrole om de sorteerpoorten in te stellen. Stel op basis van deze controles een poort in om de alor-positieve A LDH, high D vijf- en SCC zeven-cellen te onderscheiden. Gebruik dit vervolgens om de monstercellen te sorteren in alor-positieve A LDH, high D vijf- en SCC zeven-populaties.

Om de dendritische cellen te genereren, isoleert u eerst de femur- en tibiabeenderen van een C 57 black six en een C3 H muis. Steriliseer de beenderen gedurende één minuut bij kamertemperatuur in 75% ethanol en was ze vervolgens in HBSS. Snijd daarna de uiteinden van de beenderen af en gebruik een spuit van 10 milliliter uitgerust met een naald van 21 gauge om het beenmerg in een Petrischaal te spoelen; aspireer en doseer de cellen enkele keren om een enkelcel-suspensie te creëren en centrifugeer vervolgens de cellen.

Incubeer het pellet in vijf milliliter rode bloedcel-lysisbuffer gedurende één minuut in een waterbad van 37 °C. Pas na het tellen van de cellen het volume aan naar 1 × 10⁶ cellen per milliliter in kweekmedium aangevuld met G-M-C-S-F en IL-4. Kweek de cellen vervolgens bij 37 °C en 5% CO2, waarbij het medium en de cytokinen na drie dagen worden ververst.

Oogst op dag vijf de onrijpe dendritische cellen. Resuspendeer na het centrifugeren van de cellen de pellets in vijf milliliter kweekmedium en breng de celsuspensie vervolgens voorzichtig over op vers bereid isolatiemedium. Verzamel na het opnieuw centrifugeren van de cellen de dc's tussen de lagen kweekmedium en isolatiemedium.

Pas na het tellen van de cellen het volume aan naar een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter in kweekmedium, aangevuld met G-M-C-S-F en IL-4. Maak nu de tumorlysaten door de gesorteerde cellen viermaal bloot te stellen aan snelle vries-dooi-cycli, gevolgd door centrifugatie om het membraandeel van de lysaten te verzamelen. Pulseer vervolgens de DCS met het lysaat van de gesorteerde autologe ALDH-hoge cellen om de CSC TPC's voor te bereiden.

Om de H-T-P-D-C-puls voor te bereiden, injecteer dan voor de vaccinatie van de experimentele recipiënte dieren subcutaan 1 × 10⁶ van de gepulseerde dcs met onge Modelleerd heterogeen tumorcellysaat, gesuspendeerd in 100 µL PBS, in de linkerflank van elke muis. Dien na vaccinatie intraveneus 1 × 10⁵ heterogene D5-tumorcellen in 100 µL PBS toe om de C57BL/6 recipiënte muizen uit te dagen. Voor het SCC7-model worden de C3H recipiënte muizen subcutaan uitgedaagd met 1 × 10⁶ onge Modelleerde SCC7-tumorcellen in 100 µL PBS aan de tegenovergestelde zijde van het DC-vaccin.

Maak een suspensie van enkelvoudige cellen van de milten van de ontvangende C3 H-muizen. Activeer vervolgens de splenische T- en B-cellen met geïmmobiliseerde anti-CD3 en anti-CD28 monoklonale antilichamen in kweekmedium aangevuld met de juiste stimulus. Verzamel na vier dagen de supernatanten en coat vervolgens ELISA-platen met antilichamen tegen interferon-gamma, GM-CSF of IgG gedurende één nacht bij 4 °C. Blokkeer de volgende dag de plaat voor aspecifieke binding, breng de standaarden en de zojuist verzamelde supernatanten aan en incubeer de platen vervolgens bij kamertemperatuur. Voeg na het wassen gedurende één uur het HRP-detectieantilichaam toe en voeg daarna het TMB-substraat toe.

Meet tot slot de absorbentie op een ELISA-plaatlezer bij 450 nanometer binnen 30 minuten na het stopzetten van de reactie. Alor is gebruikt als marker om stamcellen te isoleren in meerdere maligniteiten, waaronder de twee met kankerstamcellen verrijkte populaties D vijf en SCC zeven; specifiek zoals aangetoond in deze dot plots, dragen alor-positieve cellen ongeveer 0,5% en 5,2% bij van de gecultiveerde D vijf en SCC zeven tumorcellijnen respectievelijk. Er is ook vastgesteld dat vers geoogste tumorcellen 2,5% en 4,2% alor-positieve cellen bevatten uit respectievelijk in vivo gevestigde D vijf en SCC zeven tumoren.

Tumorcellen behandeld met de D-E-A-B-A specifieke A LDH-remmer werden gebruikt als negatieve controle. De immunogeniciteit van kankerstamcellen werd geëvalueerd door de beschermende antitumorimmuniteit te onderzoeken die werd geïnduceerd door CSC TPC's met behulp van het zojuist gedemonstreerde vaccinatiemodel. Zoals in deze tabel wordt getoond, ontwikkelden muizen behandeld met H TPC's minder longmetastasen dan muizen die alleen met PBS waren behandeld.

Belangrijk is dat muizen die behandeld waren met CSC-TPC's nog minder longmetastasen hadden dan dieren die alleen met H-T-P-D-C of PBS waren behandeld. In het SCC seven-model werden normale C3 H-dieren gevaccineerd zoals zojuist gedemonstreerd, vergeleken met de controlegroep. H-TPC's induceerden een bescheiden anti-tumorimmuniteit, terwijl CSC-TPC's een significante remming van de tumorgroei induceerden. Deze resultaten geven aan dat CSC's mogelijk kunnen worden gebruikt als een effectievere antigenbron voor het laden van DC's dan traditionele ongesorteerde tumorcellen voor het induceren van protectieve immuniteit tegen de challenge met tumorcellen.

Om de mechanismen ten grondslag aan de waargenomen door CSC geïnduceerde beschermende antitumorimmuniteit verder te begrijpen, werden lymfocyten van DC-gevaccineerde dieren geactiveerd en werd hun cytokinproductie gemeten via ELISA; zoals zojuist aangetoond was de cytokinproductie significant hoger bij de lymfocyten die waren geoogst van dieren gevaccineerd met D5 CSC TPCs of SCC7 CSC TPCs, vergeleken met die van dieren gevaccineerd met D5 HTPCs of SCC7 HTCs. Vandaag heeft u gezien hoe de Alamar Blue-assay wordt gebruikt om kankerstamcellen te isoleren.

Deze kankerstamcellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor de ontwikkeling van immunotherapieën met gebruik van dendritische cellen. Wij hopen dat deze immunotherapieën, of ze nu alleen of in combinatie met bestaande therapieën worden ingezet, de prognose voor patiënten met vele soorten kanker zullen verbeteren.