Inducerende Myointimal Hyperplasie Versus atherosclerose in Muizen: Een inleiding van twee geldige Models

Het algemene doel van het volgende experiment is om twee valide diermodellen te introduceren die via verschillende mechanismen leiden tot vernauwing van de aorta. Het eerste model is balloncatheterisatie van de aorta om de ontwikkeling van myointimale hyperplasie te induceren. Eerst wordt de infrarenale abdominale aorta blootgelegd en afgeklemd.

Vervolgens wordt de aorta geopend met een transversale incisie en wordt de ballonkatheter ingebracht. Het endotheel van de aorta wordt daarna verwijderd met de opgeblazen katheter en de chirurgische ingreep wordt voltooid. Het tweede model is een dieetmanipulatie van transgene APOE-null muizen om atherosclerotische plaques te creëren.

Deze muizen worden onder standaardcondities gehouden en gedurende vier tot zes maanden gevoed met een westers dieet met een hoog lipidengehalte. Uiteindelijk laat histologische analyse van de chirurgisch geïnduceerde myo-intimale hyperplasie en het model voor dieetrestrictie zien dat deze resulteren in een verschillende vernauwing van het lumen. Vandaag tonen we u twee verschillende modellen om lumenvernauwing op te wekken: het muismodel waarbij een ballonkatheter wordt gebruikt om vaatschade te induceren en het model voor arteriosclerose.

Door gebruik te maken van transgene muizen met een westers dieet kan het ballonkathetermodel helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van stenose. Het transgene homozygote upper E mutant muismodel wordt gebruikt om de pathofysiologie van atherosclerose te bestuderen. Voor het model voor intimale hyperplasie worden C 57 black six J muizen gebruikt met een gewicht van ongeveer 25 gram.

Houd ze onder normale omstandigheden met een normaal dieet. Na het anesthetiseren van de muis met 2% isofluraan, trimt u het haar op de buik en dient u carprofen via een subcutane injectie toe voor analgesie. Desinfecteer vervolgens de huid afwisselend met Povidon-jodium en 80% ethanol in twee cycli.

Controleer nu op de afwezigheid van reflexen door middel van een teenknijp. Begin de operatie door de huid en spieren langs de linea alba te scheiden. Wikkel vervolgens de darmen in een met zoutoplossing bevochtigde handschoen en verwijder daarna zorgvuldig het vetweefsel om de abdominale aorta vrij te leggen.

Leg nu de infrarenale aorta vrij tot aan de bifurcatie. Let er hierbij op geen zijtakken te beschadigen. Klem nu de aorta af.

Plaats eerst een microsurgische klem op de proximale infrarenale aorta om de bloedstroom te stoppen. Plaats vervolgens een tweede distale klem naast de aortabifurcatie. Zodra de bloedstroom is onderbroken, wordt er een kleine incisie in de aorta gemaakt vlakbij de proximale klem.

Voer de katheter in richting de distale klem van de aorta om een endotheelschade aan te brengen. Denudeer de aorta door de katheterballon op te blazen en de katheter vervolgens voorzichtig en langzaam in de richting van de proximale klem terug te trekken. Herhaal deze handeling tweemaal, voor een totaal van drie aorta-inflaties.

Verwijder nu de katheter en sluit de incisie in de aorta met 10 au proline doorlopende hechtingen. Terwijl de hechtingen op hun plaats zitten, wordt de distale klem voorzichtig geopend indien er sprake is van bloedingen bij de AOR-autotomieplaats. Sluit de klem opnieuw, lokaliseer de bloeding en stop deze met aanvullende onderbroken hechtingen.

Wanneer er geen bloedingen optreden, wordt de proximale klem langzaam geopend. Een aortapuls moet zichtbaar zijn distaal van de incisie. Plaats nu de darmen in C twee.

Sluit vervolgens de buikwand, beginnend met de spierlaag, met zes doorlopende OTT-prolinehechtingen. Sluit daarna de huid met vijf OTT-hechtingen en plaats de muis terug in de kooi. Voeg gedurende de eerste drie postoperatieve dagen metrazol toe aan het drinkwater voor pijnbestrijding.

Houd het dier gedurende het herstel, dat ongeveer 28 dagen duurt, in de gaten. Voor het atherosclerosemodel worden vier weken oude A POE-deficiënte muizen gebruikt. Huisvest deze muizen onder standaardcondities met een westers dieet met een hoog vetgehalte gedurende vier tot zes maanden.

Houd dit dieet gedurende het hele experiment in stand. Onttrek zes uur voor het oogsten van de aorta de toegang tot voedsel. Bereid de muis vervolgens voor op de operatie zoals beschreven in de voorgaande sectie.

Begin de operatie door de borstkas te openen. Snijd vervolgens de apex van het hart af en perfuseer deze onder milde druk met drie milliliter 4% paraformaldehyde via de aortawortel om de aorta te fixeren. Maak daarna de aorta vrij van de wortel tot aan de bifurcatie.

Probeer zoveel mogelijk van het vetweefsel te verwijderen. Snijd vervolgens de aortaboog af en bewaar deze in 4%para formaldehyde. Verplaats nu het hart en de aortaboom naar een met silicone beklede schaal met PBS in de schaal.

Snijd één uiteinde van de aortaboom af en fixeer deze met fijne pinnen op de siliconenlaag. Open de aorta in de lengterichting en laat het aortaweefsel enkele minuten in PBS bij kamertemperatuur liggen. Spoel het weefsel vervolgens één keer met 50% ethanol en dompel het onder in een Sudan-bad.

Ten derde, de weefsels ongeveer 15 minuten inkleuren met de kleuringsoplossing. Spoel het weefsel na het kleuren snel enkele seconden met 50% ethanol om enkel het overtollige Sudan te verwijderen. Te lang spoelen zal te veel kleurstof verwijderen; spoel het weefsel onmiddellijk met gedestilleerd water en ga over tot beeldvorming. Voor het model van myointimale hyperplasie werden gedenudeerde muis aorta's geoogst, in paraffine ingebed en gekleurd met trichroom. De ratio's werden berekend op basis van de trichroomgekleurde coupes door de dikte van de intima en de media te meten.

Met behulp van computeranalyse gevolgd door de berekening van de ratio, werd de maximale plaque-dikte gemeten als de maximale intimadikte in het lumen via een computer morpho tree. Het percentage lumenobliteratie werd berekend als de ratio van het nieuwe binnenlumen ten opzichte van het oorspronkelijke lumen. Het plaque-oppervlak werd berekend door het nieuwe binnenlumen af te trekken van het oorspronkelijke lumen.

Dezelfde analyses werden uitgevoerd op met trichroom gekleurde dwarsdoorsneden van het atherosclerosemodel bij de aortaklep, de aortaboog en de descenderende aorta, uitsluitend voor het atherosclerosemodel. De descenderende aorta werd longitudinaal geopend en gekleurd met Sudanrood. Het plaque-oppervlak en het totale aortaoppervlak werden met behulp van een computer gemeten voor de analyse van beide modellen.

Andere methoden, zoals histopathologie en confocale immunofluorescentiemicroscopie, kunnen worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden over luminale obliteratie, morfologie en cellulariteit. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.