Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren Staphylococcus epidermidis En Mycobacterium marinum Infectie als een model voor Drug Discovery
June 26th, 2014
Deze video artikel beschrijft de high throughput pijpleiding die is met succes tot infectie en analyseren van grote aantallen zebravis embryo's die een nieuw krachtig hulpmiddel voor beproeving en drug discovery met geheel gewerveld organisme.
Het algemene doel van deze procedure is om grote aantallen geïnfecteerde zebravis-embryo's te genereren voor high-throughput compound-testen om medicijnontdekking mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst een groot kweekvat te gebruiken om grote aantallen synchrone zebravis-eieren in een enkele gebeurtenis te verkrijgen. Vervolgens worden de eieren uitgelijnd in een aros-raster en geïnfecteerd met bacteriën in het dooier met behulp van een geautomatiseerde micro-injector.
Wanneer de infectie zich door de embryo's heeft verspreid, worden ze voorgesorteerd door flow cytometry met grote deeltjes voordat ze met geneesmiddelen worden behandeld. Ten slotte worden de bacteriële belastingsniveaus in geïnfecteerde embryo's geanalyseerd na behandeling met verbindingen. Uiteindelijk vertebra met hoge resolutie analyse door confocale microscopie.
Geautomatiseerd screenen en bemonstering van grote deeltjes worden gebruikt om met meer detail de effecten van verbindingen op de infectie te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande technieken zoals handmatige injecties of PIX-scananalyse is dat we ermee een groot aantal homogeen aangetaste embryo's kunnen genereren, die we op high-throughput wijze kunnen analyseren. Om S epiderm-inoculum voor te bereiden, isoleer verschillende individuele koloniën van een plaat van S epiderm-stam, O 47 met A PW VW 180 9-afgeleid M cherry-expressievector en inoculeer.
25 milliliter LB aangevuld met 10 microgram per milliliter. Chloramfenicol incuberen overnacht bij 37 graden Celsius tot de volgende dag in de midlock-fase, centrifugeer één milliliter van de cultuur bij 12.000 GS gedurende één minuut en gebruik één milliliter steriele PBS met 0,3% volume per volume tussen 80 om het pellet drie keer te wassen. Meet de optische dichtheid bij OD 600 en gebruik 2% gewicht per volume, polyvinylperone 40 of PVP 40 in PBS om de bacteriesuspensie te verdunnen tot een OD 600 gelijk aan 0,3 of één keer 10 tot de achtste CFU's per milliliter.
Om aminum-inoculum voor te bereiden, isoleer verschillende individuele koloniën van M Meum-stam M of E 11 stabiel de PS MT 3M cherry-vector tot expressie brengend uit een Middlebrook zeven H 10 geaereerd en inoculeer 10 milliliter Middlebrook zeven H negen-bouillon bevattend 10% volume per volume. Middlebrook A DC-verrijking aangevuld met 50 microgram per milliliter hygromycine overnacht incuberen bij 28 graden Celsius de volgende dag. Centrifugeer één milliliter van de cultuur bij 12.000 GS gedurende één minuut en gebruik één milliliter steriele PBS met 0,3% volume per volume tussen 80 om het pellet drie keer te wassen.
Meet de OD 600 van de bacteriesuspensie en met 2% gewicht per volume. PVP 40 in PBS verdund tot een OD 600 van 0,3 of 0,3 keer 10 tot de achtste CFU's per milliliter om zebravis-eieren te verkrijgen. Plaats de avond voor de verzameling maximaal 50 vrouwelijke zebravissen in de onderste kamer van een groot kweekvat en 70 mannetjes in de bovenste helft van het vat. Verwijder de volgende ochtend de scheider van het vat. Na ongeveer een uur door de eierverzamelaar aan de onderkant van het kweekvat, verzamel de eieren in een 50 milliliter buis gevuld met eierwater.
Na het voorbereiden van injectieplaten, volgens het tekstprotocol op de geautomatiseerde micro-injector-besturingssoftware, klik op kalibreer podium, klik vervolgens op 10 24. Well raster en plaats de aros-plaat in de micro-injector, kalibreer de plaat door op het scherm te klikken op de centrumpositie van het putje. Ga vervolgens naar het naaldmenu en klik op kalibreer naaldhouder.
Gebruik een micro-loadertip om een injectienaad met een diameter van 10 micron te vullen met 10 microliter PVP 40 bevattend 100 CFU's per nanoliter van S epiderm, 30 CFU's per nanoliter van erum of PVP 40 alleen voor mock-injecties, plaats de naald in de geautomatiseerde micro-injector en kalibreer de XY-positie door de naald omlaag te laten zakken of te verplaatsen en op het scherm te klikken op de positie van de naald. Kalibreer vervolgens de Z-positie van de naald door op het scherm te klikken op de positie van het uiteinde van de naald. Gebruik vervolgens een plastic transferpipet om de eieren over het aros-raster te verdelen en verwijder eventueel overtollig eierwater.
Plaats vervolgens het met eieren gevulde agros-raster in de geautomatiseerde micro-injector in het injectiemenu, stel de injectiedrukinstelling in op 200 hectaar pascal, de injectietijd op 0,2 seconden en de compensatiedruk op 15 Hector Pascals, wat overeenkomt met één nanoliter in het Femto jet-instellingenmenu. Klik op alles injecteren en injecteer de hele plaat met embryo's na injectie. Verzamel de eieren door ze in een petrischaaltje te wassen en incubeer ze bij 28 graden Celsius.
Zodra de flowcytometer met grote deeltjes is ingesteld, ga naar het PMT-menu en stel het rode kanaal in op 650 volt en de groene en gele kanalen op nul volt. Stel vervolgens binnen het drempelmenu de optische dichtheidsdrempelsignaal in op 50, overeenkomend met 975 millivolt en de tijd-van-vlucht-minimum op 800, overeenkomend met 320 microseconden. Om de invloed van puin te verminderen, plaats de embryo's in de monstercup en in het sorteermenu om het maximum van 70 embryo's per plaat te sorteren door 70 in te voeren.
Plaats een lege petrischaal onder de sorter en klik op handmatig sorteren. Wanneer de petrischaal gevuld is, sla de gegevens op door op opslaan te klikken. Als hoge resolutieanalyse of beeldvorming vereist is, kunnen embryo's afzonderlijk worden gesorteerd in putjes van een 96-wellsplaat.
Plaats de embryo's in de monstercup en definieer het maximum van één embryo per putje om te sorteren. Plaats vervolgens een lege 96-wellsplaat in de linkerplaathouder en klik op plaat vullen. Wanneer de plaat gevuld is, sla de gegevens op door op opslaan te klikken om geneesmiddelbehandelde embryo's drie dagen na injectie met erum te analyseren.
Behandel één groep
Overzicht
Dit video-artikel beschrijft een hoogdoorvoerpijplijn die is opgezet om grote aantallen zebravisembryo's te infecteren en te analyseren, waardoor een krachtig hulpmiddel wordt geboden voor compound-testen en medicijnontdekking.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Medicijnontdekking
- Infectiebiologie
Achtergrond
- Zebravisembryo's worden gebruikt als modelorganisme voor het bestuderen van infecties.
- Hoge doorvoermethoden maken de analyse van grote steekproeven mogelijk.
- Geautomatiseerde technieken verbeteren de efficiëntie en consistentie in experimenten.
- Medicijntesten op geïnfecteerde embryo's kunnen de werkzaamheid van verbindingen onthullen.
Doel van het onderzoek
- Om grote aantallen geïnfecteerde zebravisembryo's te genereren voor testen.
- Om de effecten van verbindingen op bacteriële infecties te analyseren.
- Om medicijnontdekkingsprocessen te verbeteren met behulp van een gewerveld model.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een groot kweekvat voor synchrone eiercollectie.
- Geautomatiseerde micro-injectie van bacteriën in het dooier van zebravis.
- Grote deeltjes flowcytometrie voor embryosortering.
- Confocale microscopie voor hoogwaardige analyse van infecties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle infectie van embryo's maakt hoogdoorvoeranalyse mogelijk.
- Geautomatiseerde methoden leveren homogeen aangetaste embryo's op.
- Effecten van medicijnbehandeling kunnen kwantitatief worden beoordeeld.
- Beeldvorming met hoge resolutie onthult gedetailleerde interacties tussen verbindingen en infecties.
Conclusies
- De opgezette pijplijn verbetert de medicijnontdekkingsinsspanningen aanzienlijk.
- Geautomatiseerde technieken leveren betrouwbare en reproduceerbare resultaten op.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende compound-testscenario's.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This high throughput zebrafish infection model bridges the gap between cell-based assays and mammalian in vivo validation, enabling early-stage compound screening with whole-animal physiological relevance. By generating large numbers of synchronously infected embryos, the method supports predictive confidence in target validation and reduces late-stage attrition in anti-infective drug discovery pipelines. The scalable workflow accommodates diverse bacterial pathogens and compound libraries, enhancing translational continuity from hit identification to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a whole-animal infection context, clarifying pathogen-host interactions and target essentiality.
- Operational Value: Supports biological de-risking through homogeneous, synchronized infection models that reduce variability in phenotypic screening outcomes.
- Predictive Value: Facilitates early go/no-go decisions by quantifying compound effects on bacterial burden in vivo, improving portfolio triage efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for preparing validated biological systems amenable to downstream compound evaluation.
- Operational Value: Employs automated microinjection and large particle flow cytometry to ensure assay consistency, scalability, and high sample throughput.
- Screening Readiness: Generates quantitative fluorescence-based readouts of bacterial burden, enabling reliable dose-response analysis and hit confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by modeling Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infections, which reflect biomaterial-associated and tuberculosis-related pathologies.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking early efficacy signals to known antimicrobial mechanisms, such as rifampicin dose-dependent inhibition.
- Mechanistic De-risking: Enables use of transgenic zebrafish lines to decipher compound mode of action, strengthening target confidence before mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for anti-infective programs requiring whole-animal validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time monitoring of infection dynamics and compound interference in a vertebrate host.
- Screening: Delivers assay readiness through automated embryo alignment, precise yolk injection, and presorting via flow cytometry to ensure uniform starting conditions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements via fluorescence intensity analysis, allowing objective comparison of bacterial burden across treatment groups.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through dose-response profiling of known antibiotics, establishing predictive biomarkers of efficacy.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening diverse compound libraries against multiple pathogens, reducing reliance on bespoke assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of infection modulation in vivo.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability through automated workflows and synchronized embryo production.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in anti-infective programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative in vivo efficacy data from high throughput screens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection techniques, and flow cytometry operation.
- Dependent on automated microinjectors, large particle flow cytometers, and fluorescence detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of infection protocols, compound preparation, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations for different bacterial strains, transgenic lines, and infection readouts based on pathogen virulence and host response.
- Practical limitations include embryo viability constraints post-infection and the need for optimization of bacterial inoculum titers for consistent phenotype penetration.
