Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van grote aantallen geïnfecteerde zebravissenembryo's voor high-throughput compound-testing om geneesmiddelenonderzoek mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst een groot kweekvat te gebruiken om in één keer grote aantallen synchrone zebravisseneieren te verkrijgen. Vervolgens worden de eieren uitgelijnd in een aros-grid en worden de dooiers geïnfecteerd met bacteriën met behulp van een geautomatiseerde micro-injector.

Wanneer de infectie zich door de embryo's heeft verspreid, worden deze via flowcytometrie voor grote deeltjes voorgesorteerd voordat ze met geneesmiddelen worden behandeld. Ten slotte worden de bacteriële belastingsniveaus in geïnfecteerde embryo's geanalyseerd na behandeling met de verbinding. Uiteindelijk vindt er een analyse met hoge resolutie plaats via confocale microscopie van de wervels.

Geautomatiseerde screening en bemonstering van grote deeltjes worden gebruikt om in meer detail de effecten van verbindingen op de infectie aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande technieken, zoals handmatige injecties of PIX-scananalyse, is dat we hiermee een grote hoeveelheid homogeen beïnvloede embryo's kunnen genereren, die we op een high-throughput manier kunnen analyseren. Om het S epiderm-inoculum voor te bereiden, isoleert u verschillende individuele kolonies van een plaat met de S epiderm-stam O 47, die een M cherry-expressievector bevat afgeleid van A PW VW 180 9, en inoculeert u deze.

25 milliliter LB aangevuld met 10 microgram per milliliter chloramphenicol incuberen gedurende de nacht bij 37 °C tot de mid-log fase. Centrifugeer de volgende dag 1 milliliter van de cultuur bij 12.000 ×g gedurende één minuut en gebruik 1 milliliter steriele PBS met 0,3% v/v Tween 80 om het pellet drie keer te wassen. Meet de optische dichtheid bij OD 600 en gebruik 2% w/v polyvinylpyrrolidon 40 of PVP 40 in PBS om de bacteriële suspensie te verdunnen tot een OD 600 gelijk aan 0,3 of 1 × 10⁸ CFU per milliliter.

Om een inoculum van M. meum voor te bereiden, isoleert u enkele individuele kolonies van M. meum stam M of E 11 die de PS MT 3M cherry-vector stabiel tot expressie brengt vanaf een Middlebrook 7H10-plaat. Belucht en inoculeer 10 mL Middlebrook 7H9-bouillon met 10% volume/volume Middlebrook ADC-verrijkingsmedium, aangevuld met 50 µg/mL hygromycine. Incubeer dit gedurende de nacht bij 28 °C. Centrifugeer de volgende dag 1 mL van de cultuur bij 12.000 ×g gedurende één minuut en gebruik 1 mL steriele PBS met 0,3% volume/volume Tween 80 om de pellet drie keer te wassen.

Meet de OD 600 van de bacteriële suspensie en verdun deze met 2% gewicht per volume PVP 40 in PBS tot een OD 600 van 0,3 of 0,3 × 10⁸ CFUs per milliliter. Om zebravis-eieren te verkrijgen, plaatst u de avond vóór de verzameling maximaal 50 vrouwelijke zebravisjes in de onderste kamer van een groot kweekvat en 70 mannetjes in het bovenste gedeelte van het vat. Verwijder de volgende ochtend de scheidingswand uit het vat. Verzamel de eieren na ongeveer één uur via de eieropvanger onderaan het kweekvat in een buis van 50 milliliter gevuld met eierwater.

Nadat de injectieplaten zijn voorbereid volgens het tekstprotocol in de bedieningssoftware van de geautomatiseerde micro-injector, klikt u op 'calibrate stage' en vervolgens op '10 24 Well grid'. Plaats de aros-plaat in de micro-injector en kalibreer de plaat door op het scherm op de middenpositie van de well te klikken. Ga daarna naar het naaldmenu en klik op 'calibrate needle holder'.

Vul met een micro-laadpunt een injectienaald met een diameter van 10 micron met ofwel 10 microliters PVP 40 bevattend 100 CFU's per nanoliter S epiderm, 30 CFU's per nanoliter erum, of enkel PVP 40 voor mock-injecties. Plaats de naald in de geautomatiseerde micro-injector en kalibreer de XY-positie door de naald te laten zakken of te bewegen en op het scherm te klikken op de positie van de naald. Kalibreer vervolgens de Z-positie van de naald door op het scherm te klikken op de positie van de naaldpunt. Gebruik daarna een plastic transferpipet om de eitjes over het aros-grid te verdelen en verwijder eventueel overtollig ei-water.

Plaats vervolgens het agros-rooster gevuld met eieren in de automatische micro-injector in het injectiemenu, stel de injectiedruk in op 200 hPa, de injectietijd op 0,2 seconden en de compensatiedruk op 15 hPa, wat overeenkomt met één nanoliter in het Femtojet-instellingenmenu. Klik op 'inject all' en injecteer de gehele plaat embryo's. Verzamel de eieren door ze in een Petrischaal te wassen en incubeer ze bij 28 °C.

Zodra de flowcytometer voor grote deeltjes is ingesteld, gaat u naar het PMT-menu en stelt u het rode kanaal in op 650 volt en de groene en gele kanalen op nul volt. Stel vervolgens in het drempelwaardenmenu het signaal voor de optische dichtheidsdrempel in op 50, wat overeenkomt met 975 millivolt, en het minimum voor de vluchttijd op 800, wat overeenkomt met 320 microseconden. Om de invloed van debris te verminderen, plaatst u de embryo's in de bekerglas voor monsters en voert u in het sorteermenu 70 in om het maximum van 70 embryo's per plaat te sorteren.

Plaats een lege petrischaal onder de sorteerder en klik op handmatige sortering. Wanneer de petrischaal vol is, slaat u de gegevens op door op opslaan te klikken. Indien analyse met een hoge resolutie of beeldvorming vereist is, kunnen embryo's individueel worden gesorteerd in de wells van een 96-wellplaat.

Plaats de embryo's in de monsterbeker en definieer maximaal één embryo per put dat gesorteerd moet worden. Plaats vervolgens een lege 96-wells plaat in de linker plaathouder en klik op 'fill plate'. Wanneer de plaat is gevuld, slaat u de gegevens op door op 'store' te klikken om met erum de met medicijnen behandelde embryo's drie dagen na injectie te analyseren.

Behandel één groep embryo's met een relevante verbinding in oplosmiddel en een tweede groep uitsluitend met oplosmiddel. Plaats de behandelde embryo's op vier en vijf dagen na bevruchting in de monsterbeker van de flowcytometer en stel de sortering in op 70 embryo's per plaat nadat de embryo's in trica zijn geanestheseerd en het geautomatiseerde screeningssysteem voor vertebraten en de grote partikelsampler zijn ingesteld. Selecteer via het tekstprotocol uit het menu voor de instelling van de detectie van beeldobjecten de referentiebeelden die overeenkomen met de leeftijd van de embryo's in het menu voor het automatisch opslaan van beelden, en selecteer het aantal te maken foto's en de te gebruiken oriëntatie.

Plaats een 96-wellplaat gevuld met embryo's in de linker plaat houder van de large particle sampler en klik op run plate. Wanneer een embryo correct is gepositioneerd, gebruik dan een 10 x droge objectief zonder correctie om de kop en de staart afzonderlijk te fotograferen. Gebruik vervolgens software voor beeldbewerking om de beelden samen te voegen om vast te stellen welk ontwikkelingsstadium het meest geschikt is voor eierdooierinfectie.

Injecties met dermitis en een marum werden uitgevoerd in alle verschillende stadia tussen het stadium van één en 512 cellen. Zoals hier te zien is, gaven injecties met 100 CFU dermitis, uitgevoerd tussen het stadium van 16 en 128 cellen, het beste infectiepatroon. De bacteriën prolifereerden gedurende drie dagen in de dooier en verspreidden zich vanaf drie dagen na infectie naar het lichaam.

Kwantificering van de bacteriële last met een hoge doorvoersnelheid werd uitgevoerd door fluorescentie-intensiteitsanalyse met behulp van de flowcytometer voor grote deeltjes. Zoals hier wordt getoond, komt de hoeveelheid levende bacteriën in het embryo zeer nauw overeen met het gemeten fluorescentiesignaal. Deze figuur demonstreert dat het optimale ontwikkelingsstadium voor injectie van 30 CFU's van aminum tussen het 16- en 128-celstadium ligt voor de E 11-stam en tussen het 16- en 64-celstadium.

Bij embryo's die waren geïnjecteerd met de meer virulente EM-stam in deze stadia, was bacteriële groei in de eikel en verspreiding van de bacteriën door het embryo zichtbaar. Na een voorbehandeling van met emerin geïnfecteerde embryo's met verschillende concentraties rifampicine werd een dosisafhankelijke vermindering van de mycobacteriële infectie aangetoond. Gebruik van het geneesmiddel bij een dosis van 200 micromolar demonstreerde dat het de bacteriële progressie van M mein E 11 effectief stopte, vanaf 24 uur na de behandeling na de ontwikkeling ervan.

Deze technieken hebben de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van verbindingstests en geneesmiddelenontwikkeling, die zoeken naar nieuwe behandelingen voor infectieziekten zoals tuberculose of infecties geassocieerd met biomaterialen.