Name: Inductie van Eiwit van de verwijdering door In Utero Electroporatie tekorten Definieer in neuronale migratie in transgene modellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Leer hoe in utero-elektroporatie neurale ontwikkeling en migratie analyseert in transgene muismodellen. Deze methode maakt gerichte genmanipulatie mogelijk voor gedetailleerd fenotype-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn Pierre Mattar en Freda Miller dankbaar voor hun hulp bij de in utero elektroporatie en aan Noel Ghanem en Bensun Fong voor het maken van diagrammen. We danken Linda Jui en Jason G. MacLaurin voor uitstekende technische assistentie. De apparatuur werd ondersteund door het Centre for Stroke Recovery.
Dit werk werd ondersteund door een beurs van HSFO en OGS aan D.S.S. en een CIHR-subsidie aan R.S.S.

OPMERKING: Alle experimenten werden goedgekeurd door de Universiteit van Ottawa&#39;s Animal Care ethische commissie, die de Richtlijnen van de Canadese Raad over Animal Care. 1. Pre-operatieve voorbereiding en Materialen <ol><li> Plasmide Voorbereiding: <ol><li> Bereid plasmiden met de Qiagen Megaprep volgens het protocol van de fabrikant. Innoculate ten minste 400 ml van LB bouillon met getransformeerde bacteriën om een ​​hoge opbrengst DNA waarborgen en incubeer overnacht. </li><li> Resuspendeer plasmide 100-200 ul TE tot een eindconcentratie van ten minste 5 ug / ul. Aliquot DNA en bewaar bij -20 ° C. Als de concentratie te laag is, niet neerslaan en resuspendeer om verontreiniging kan toevoegen. Begin opnieuw met een nieuwe opstelling. </li><li> Voor de operatie, verdun een enkel plasmide (Cre-GFP bijvoorbeeld) 2 ug / ul in steriel water met 1 pl van een 0,1% (w / v) snel groen kleurstof per 10 of 20 gl van verdunde plasmidenoplossing. Als GFPen het gen van belang worden mede te geëlektroporeerd op afzonderlijke plasmiden, injecteren de GFP plasmide en het plasmide dat het gen van belang in een verhouding van 1: 4 tot de waarschijnlijkheid maximaliseren, dat alle cellen gemerkt met GFP gelijktijdig worden geëlektroporeerd met zowel plasmiden. </li></ol></li><li> Trek glazen microcapillair buizen (1 mm buitendiameter - hierna naalden) met een standaard naald trekker, met een enkele stap trek bij 62 ° C. </li><li> Autoclaaf een chirurgische dat het volgende bevat: naald houders, wond oprolmechanisme, tang, schaar voor een operatie, schaar voor naalden, nietmachine, nietjes, gaas, wond covers, operatiedoeken (Figuur 1A, B; Materialen tabel). </li><li> Verzamel andere benodigde gereedschappen: Electroporatie, Femtojet Microinjecter, Tweezertrodes (5 of 7 mm), zoutoplossing, hechtdraad, 5 ml spuit (Materials tabel). </li></ol> 2. Bereid Muis voor Heelkunde <ol><li> Voor pijnbestrijding, injecteren een timed-pregnant muis met buprenorfine (0,05 mg / kg lichaamsgewicht) één uur voor de operatie. Breng dit protocol om muizen overal getimed uit embryonale dag 12,5 (E12.5) naar E17.5. </li><li> Gebruik microloader pipet tips om een ​​back-load getrokken naalden met het plasmide oplossing. Heeft helemaal niet invullen in de punt van de naald nog, omdat dit zal leiden tot de naald verstopt raken. </li><li> Verdoven muis met behulp van 2-5% isofluraan gas met 1 l / min O 2. Eenmaal immobiel, plaatsen in gezichtsmasker en zalf voor de ogen om uitdroging te voorkomen. Injecteer met 1 ml zoutoplossing (0,9% NaCl) subcutaan in de rug. OPMERKING: Bij het werken met isofluraan gas, gebruik dan een gas scavenger om overtollig gas te heroveren en voorkomen dat het ontsnappen in de kamer. </li><li> Scheren buik. Was achterlijf met Chlorohexadine schrobben, spoelen met water, en een laatste prep oplossing van chlorohexadine en 70% ethanol toe te passen. Cover muis met steriel laken of gaas om bont te dekken, maar laat de buik bloot (figuur 1C, D). </li></ol>In utero Elektroporatie <ol><li> Een insnijding in de huid over de buik van de onderste spenen. Trek de huid van het onderliggende spierlaag van scheuren het bindweefsel, snijd door het peritoneum in de buikholte langs de linea alba. Plaats de wond oprolmechanisme aan de wondranden uit elkaar te trekken. </li><li> Verwijder de baarmoeder uit de buikholte en leg het uit zoals afgebeeld (figuur 1E). <ol><li> Wanneer verschillende pups worden geïnjecteerd met verschillende plasmiden (bijvoorbeeld GFP versus GFP met het gen van belang), tel de pups aan elke kant en beslissen welke en hoeveel te injecteren elk plasmide. Vervang een zijde van de baarmoeder terug in de buik om de embryo warm en smeren. Onmiddellijk bevochtig de blootgestelde baarmoeder met een zoutoplossing (bij voorkeur verwarmd tot lichaamstemperatuur). </li><li> Als een injectie alle pups met hetzelfde plasmide (bijvoorbeeld bij het injecteren Cre-GFP in transgene embryo) only verwijder één hoorn van de baarmoeder op een moment. </li></ol></li><li> Zet een geladen naald in de greep hoofd van de injectie staf en knip voorzichtig de tip met een paar kleine chirurgische schaar of fijne pincet. Snijd de tip zodat de naald blijft zo lang mogelijk terwijl u toch vloeistof door (figuur 1Ji-iv) te passeren. <ol><li> Pas lengte van injectie (in seconden) en inspuitdruk op de microinjector zodat een kleine toch gemakkelijk toegankelijk druppel 0,1-0,2 pl wordt op het punt van de naald wanneer de voet peddel drukt. Houd het volume van deze druppel zo consistent mogelijk tussen verschillende naalden. OPMERKING: deze stap is cruciaal voor de overleving van embryo&#39;s (zie bespreking). </li><li> Gebruik de volgende injectie parameters voor de Femtojet: injecteren druk (pi) = 250-300 hPa; injectie tijd (ti) = 0,8-1,2 sec; compensatie druk = 10-50 hPa. Indien nodig, aan te passen deze parameters om de variatie tussen de naalden tegemoet te komen. </li></ol></li><li> Sverkiezen een embryo en zachtjes plaats het op zijn rug, hoofd naar boven gekanteld (Figuur 1F). LET OP: Dit kan betekenen dat het draaien of verschuiven van het embryo; wees voorzichtig niet te veel druk toe te passen en te voorkomen breuk van de vruchtzak, terwijl het manipuleren van het embryo. </li><li> Zodra het embryo is op zijn plaats, zoek het ventrikel, die presenteert als een halve maan vormige schaduw parallel aan de sagittale sinus. Raak de punt van de naald naar de baarmoeder boven de ventrikel onder een kleine hoek en begeleiden de naald door de baarmoederwand. De hoeveelheid druk hangt af van de scherpte van de naald. Steek de naald door de cortex in de ventrikel. OPMERKING: Hoewel er zelden extra detecteerbaar weerstand, het hoofd van de embryo&#39;s is vaak iets weggeduwd en vervolgens terugdeinst als de naald door de cortex in de ventrikel. </li><li> Pomp de voet peddel om het plasmide oplossing te injecteren. Blijven pompen tot een groene omgeving zichtbaar is en voldoet aan deboogvorm van het ventrikel (figuur 1G). Bij jonge embryo (E12.5 tot E14.5) de kleurstof vaak diffunderen in de contralaterale ventrikel. Opmerking: Het aantal pompen afhankelijk van de diameter van de naald, de leeftijd van het embryo (en de resulterende grootte van de ventrikel) en het gewenste injectievolume. Houd het volume geïnjecteerd zo consistent mogelijk tussen embryo&#39;s. </li><li> Injecteer drie of vier embryo. Houd alle blootgestelde embryo vochtig met zoutoplossing hele procedure. </li><li> Ga terug naar de eerste embryo geïnjecteerd en plaats de schoepen zodanig dat de positieve elektrode van de plasmide in het gewenste gebied van de hersenen (Figuur 1H) zal trekken. Hoek de negatieve elektrode zodat het kortste pad tussen de elektroden gaat direct door de structuur gericht voor elektroporatie (figuur 2). </li><li> Zodra de peddels op hun plaats zitten, gelden de schok. Afhankelijk van de leeftijd en de grootte van de embryo&#39;s, gebruik 5 pulsen van 35-50 V (zie Tstaat 1). Gebruik de volgende elektroporatie parameters: puls lengte van 5 msec met een puls interval van 950 msec. Herhaal alle geïnjecteerde embryo. </li><li> Snij het puntje van nieuwe vooraf geladen naald als in stap 3.3 als de laatste naald waarschijnlijk gedroogd en verstopte tijdens stap 3.9. Injecteer de volgende set van drie of vier embryo&#39;s met ofwel hetzelfde plasmide of een ander plasmide en dan gelden de schok als in stap 3.9. Wanneer alle pups in een kant van de baarmoeder worden geïnjecteerd, verwijder de tweede zijde van de baarmoeder uit buik van het vrouwtje en vervang vervolgens het ingevulde zijkant om het warm te houden. </li><li> Terug beide zijden van de baarmoeder naar de vrouwelijke voorzichtig om het oppervlak vochtig te houden met zoutoplossing en niet te veel druk te voorkomen van trauma aan het vruchtwater zakken toepassen. Hechten de spierlaag gesloten met behulp van een eenvoudige continue steek. Staple de huid gesloten. Als nietjes niet beschikbaar zijn, hechten de huid met een eenvoudige onderbroken steek. (Figuur 1I) </li><li> Terwijl suturing, geleidelijk turn down de isofluraan om anesthesie de zwangere vrouwtje te verlichten. OPMERKING: Dit zal versnellen opwinding van de dam na de operatie is voltooid; houden de vrouwelijke verdoofd zo kort mogelijke tijd zal embryo overleving verbeteren. Totale operatie tijd, vanaf wanneer het vrouwtje voor het eerst wordt verdoofd, moet ongeveer 30 minuten zijn. </li></ol> 4. Nazorg <ol><li> Plaats de gehecht vrouw in een couveuse of op een verwarming pad om te herstellen van de anesthesie. Haar bed op schone beddengoed en plaats een standaard recovery gel in de kooi te behouden hydratatie. Voor pijn na een operatie, geeft de vrouwelijke drie doses buprenorfine (0,05 mg / kg lichaamsgewicht) 8 uur intervallen na de operatie, vervolgens vier extra doses 12 uur intervallen. </li></ol> 5. Oogsten Brains OPMERKING: Hersenen kunnen worden geoogst op elke leeftijd tot volwassenheid. Geldt het volgendevoor het verzamelen van hersenen voor de geboorte. Merk op dat zodra pups worden geboren, de bestelling binnen de baarmoeder is verloren, dus ofwel elke pup in het nest moet worden geïnjecteerd met hetzelfde plasmide, of een andere methode voor het differentiëren tussen controle en experimentele dieren moeten worden bedacht. <ol><li> Bereid koud (4 ° C), gefiltreerd 4% paraformaldehyde (PFA) voorafgaand aan euthanasie vrouw. </li><li> Euthanaseren vrouwelijke met een intraperitoneale injectie van een dodelijke dosis van natrium pentobarbital (100 mg / kg lichaamsgewicht) en opengesneden buik. Trek de beide zijden van de baarmoeder en de lay-out als bij pups aanvankelijk werden geïnjecteerd. <ol><li> In het geval waar alle pups kreeg dezelfde plasmide, bijvoorbeeld bij het injecteren Cre in een transgeen nest embryo volgorde is niet belangrijk, dus uitgesneden uit de baarmoeder van de vrouwelijke en plaats in PBS. </li><li> Als pups werden geïnjecteerd met verschillende plasmiden, zorg ervoor dat elke pup te lokaliseren, en merkt elke dode pups, en te bepalen welke werden geïnjecteerd met controle en ExperimenTal plasmiden vóór het verwijderen van de baarmoeder van de vrouw. Wees voorzichtig om bij te houden welke pup behoort tot die groep na de baarmoeder is in PBS. </li></ol></li><li> Verwijder elke pup afzonderlijk, onthoofden met een scherpe schaar of een scheermesje en plaats de kop in PBS. Bij transgene muizen, verzamel weefselmonsters voor genotypering en houdt elke kop afzonderlijke, zoals bij een 12-wells plaat. </li><li> Onder een ontleden scope, verwijder de hersenen uit de schedel, en let niet te nick de cortex of scheur de middellijn. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop, controleren om te zien of de hersenen hebben een GFP + patch, die aangeeft dat zij met succes werden geëlectroporeerd. </li><li> Fix hersenen door onderdompeling in PFA bij 4 ° C gedurende de nacht. OPMERKING: Controleer hersenen voor de expressie van GFP voorafgaand aan de fixatie sinds PFA lest vaak het signaal. </li><li> Cryoprotect hersenen door onderdompeling in 20% sucrose gedurende ten minste drie dagen vóór het invriezen. Gebruik een sucrose gradiënt 10%, 15% en 20% (24 uur bij elke oplossing) to voorkomen weefselschade door osmotische druk. Bewaar bevroren hersenen bij -80 ° C en gesneden op een cryostaat 10-14 urn dikke secties. </li></ol> 6. Co-kleuring met anti-GFP Opmerking: Als antigeenterugtrekking noodzakelijk om samen vlek met anti-GFP, is het belangrijk om een ​​zachte antigen retrieval protocol dat het GFP-signaal niet in gevaar gebruikt. Sommige antigen retrieval protocollen te hard om te gebruiken in samenhang met GFP kleuring (zelfs met een antilichaam tegen GFP). Een basis citroenzuur voorbehandeling vóór het aanbrengen van het primaire antilichaam succesvol meeste epitopen 24. <ol><li> Voeg een 0,01 M oplossing van citroenzuur in DDH 2 O. pH 6 met een gekalibreerde pH-meter. </li><li> Hitte citroenzuur in kleuring kamer in de magnetron of waterbad tot citroenzuur bereikt 75-80 ° C. Zet dia&#39;s in kleuring kamer voor 10-15 min. Handhaaf de temperatuur zo stabiel mogelijk. </li><li> Was objectglaasjes in PBS3x gedurende 3 min bij kamertemperatuur. Breng de primaire antilichaam en ga verder met immuunkleuring volgens een standaard protocol. </li><li> Valideer Cre gemedieerde excisie door co-labeling voor GFP en het gen van belang te bevestigen neerslaan (figuur 3A). </li></ol>

<ol><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways+controlling+the+sequential+steps+of+cortical+projection+neuron+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).</li>
<li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamics of neuronal migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).</li>
<li>McClellan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+requirement+for+Rb%2FE2F3+in+neuronal+migration%3A+evidence+for+cell+cycle-independent+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).</li>
<li>Nguyen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P27kip1+Independently+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Migration+in+the+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex.</a> Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).</li>
<li>Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pocket+proteins+pRb+and+p107+are+required+for+cortical+lamination+independent+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis.</a> Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).</li>
<li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Reelin+and+Notch+signaling+regulates+neuronal+migration+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex.</a> Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).</li>
<li>Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+defects+in+the+Loa+dynein+mutant+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li>
<li>Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli3+is+required+for+maintenance+and+fate+specification+of+cortical+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors.</a> J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).</li>
<li>Heng, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin+2+controls+cortical+neuron+migration+through+regulation+of+Rnd2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2.</a> Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).</li>
<li>Alfano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COUP-TFI+promotes+radial+migration+and+proper+morphology+of+callosal+projection+neurons+by+repressing+Rnd2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression.</a> Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).</li>
<li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system%3A+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+into+multiple+CNS+territories+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).</li>
<li>Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+exogenous+LIN28+contributes+to+proliferation+and+survival+of+mouse+primary+cortical+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro.</a> Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li>
<li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li>
<li>Miyagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sox-2+regulatory+regions+display+their+activities+in+two+distinct+types+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 Forthcoming.</li>
<li>Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+promoter+analysis+in+developing+mouse+brain+and+genetic+labeling+of+young+neurons+by+doublecortin-DsRed-express%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express.</a> J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, Suppl 1. 120-125 (2009).</li>
<li>Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((targeting+in+mice%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">targeting in mice: a review.</a> Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).</li>
<li>Ferguson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-autonomous+requirement+for+the+cell+cycle+regulatory+protein%2C+Rb%2C+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration.</a> EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).</li>
<li>Lagace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+contribution+of+nestin-expressing+stem+cells+to+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis.</a> J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).</li>
<li>Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+is+essential+for+survival+of+postmitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons.</a> J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).</li>
<li>Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+E2F-1+mediates+the+autoregulation+of+RB+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 Forthcoming.</li>
<li>Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Twee van de belangrijkste uitdagingen bij het ​​uitvoeren van in de baarmoeder elektroporaties zijn 1) het voorkomen van embryo letaliteit en 2) het verminderen van variabiliteit tussen elektroporaties. Een van de belangrijkste factoren bij het voorkomen letaliteit is naald kwaliteit, zoals stompe naalden meer schade toebrengen aan het embryo. Bij het ​​snijden van de naald, houdt de punt zo lang mogelijk terwijl nog steeds zichtbaar druppel 0.1-0.2 ul vloeistof verschijnen na een pomp van de voet peddel <stron...

Radial migratie is een centraal proces om vroege corticale ontwikkeling. Het hangt van verschillende cel autonome factoren, zoals de juiste mitotische uitgang en neuronale differentiatie, celpolariteit, regulatie van het cytoskelet dynamiek en expressie van transmembraan receptoren, evenals niet-cell autonome factoren, zoals de vorming van de radiale gliale steiger en secretie van trekkende begeleiding moleculen 1-3. Aangezien verstoring van elk van deze mechanismen neuronale migratie beïnvloeden in een transgeen muismodel 4-8, bepalen de onderliggende oorzaak van een defect in migratie kan een complexe en moeilijk proces. In utero elektroporatie (IUE) kan worden gebruikt in aanvulling en vereenvoudigen interpretatie van het fenotype van een genetische knock-out systeem en daarmee toe te lichten belangrijke mechanismen die nodig zijn voor radiale migratie 7,9-11. In de baarmoeder elektroporatie (IUE) is het proces waarbij een plasmide carryi<html> ng zowel een gen van interesse en een reporter wordt geïnjecteerd in de ventrikel in de hersenen van een muis of rat embryo en vervolgens getrokken in de epitheelcellen van de ventrikel met gebruikmaking van een elektrische stroom 14/12. Hierdoor kan de onderzoeker het effect van omhoog of omlaag regulatie van een gen van interesse in de ontwikkeling en functie van geëlektroporeerd neuronen te analyseren. Volgende IUE, kunnen de hersenen worden verwerkt voor immunohistochemie 7,9-11, elektrofysiologie 15 of celkweek 16,17. Het grote voordeel van IUE is die zorgt voor zeer specifieke manipulatie van genexpressie. Bovendien kan IUE worden gebruikt om een specifiek gebied van de ontwikkelende hersenen richten via een gerichte stroom (figuur 2). IUE kan ook worden gebruikt om een bepaald celtype door injectie van plasmiden dragen genen onder controle van verschillende promotors of plasmide activatie doelsystemen (tetracycline geïnduceerde genexpressie een voorbeeld) 10,18-21. jove_content &quot;&gt; IUE kan worden gebruikt in combinatie met het Cre-Lox-gemedieerde gen-excisie systeem 7-9,11,22. Een plasmide dat een gen coderend voor het bericht voor het Cre eiwit worden geëlektroporeerd in een embryo homozygoot voor het floxed allel ( waarbij het ​​gen of specifieke DNA-gebieden worden geflankeerd door twee loxP plaatsen voor Cre gemedieerde DNA-recombinatie). Cre dan recombinatie van het gen van interesse te induceren specifiek geëlektroporeerde neurale precursoren, het genereren van een knock-out van het floxed allele.The effect van proteïne knockdown op neurale migratie en ontwikkeling in individuele neuronen kunnen vervolgens onderzocht worden. Elektroporatie van Cre recombinatie veroorzaakt slechts een kleine populatie van aangetaste cellen, waardoor de ondersteunende omgeving intact. Daarentegen weefselspecifieke expressie van Cre onder controle van een celtype specifieke promotor, treedt op in het hele weefsel, zodat zowel migreren neuroblasts en de omgeving zou kunnen worden beïnvloed. Zo juxtaposition van deze twee benaderingen kan bepalen of een bepaalde migratie gebrek is te wijten aan autonoom of cel non-autonome mechanismen cel. Defecte migratie in zowel experimentele systemen suggereert dat de waargenomen fenotype resultaten uit een cel autonoom mechanisme; normale migratie elektroporatie van Cre met defecte migratie in een weefsel-specifieke Cre model geeft aan dat het gen van interesse optreedt via een niet-cel-autonome mechanisme. IUE kan ook worden gebruikt om de redding experimenten uit te voeren door electroporating potentiële interactie van genen in knock-out dieren 7,9,10. Zo kan een onderzoeker proberen een migratie fenotype in een transgene model redden door electroporating een stroomafwaarts doel en het bepalen of de migratie defect gecorrigeerd in de geëlektroporeerd neuronen. Dit heeft het bijkomende voordeel dat een succesvolle rescue aan dat normale migratie kan worden hersteld door het manipuleren eiwitexpressie in een spefieke neuron, terwijl de omgeving nog deficiënt het doelgen. Nogmaals, deze benadering meer tijd en kosten effectiever dan kruisen of transgene lijnen met het extra voordeel van het bepalen of de defecte mechanisme cel autonoom. IUE kan worden gebruikt voor het volgen migrerende neuronen door elektroporatie van een reporter plasmide in knockout embryo&#39;s (Figuur 4C). Aangezien alleen de neuronen langs het ventrikel op het moment van chirurgie geëlektroporeerd 17 kan IUE worden gebruikt om de neuronen geboren op een bepaald tijdstip met het voordeel van visualisatie van hun morfologie in vivo volgen. Tenslotte is het mogelijk om IUE om hersengebieden richten zoals de mediale en dorsale telencephalon, hippocampus of ganglien verhevenheid (figuur 2). Dit geeft onderzoekers de bevoegdheid om genfunctie te onderzoeken in een bepaald gebied onafhankelijk van complicaties resultaating van proteïne knockdown in naburige structuren. Retinoblastoomeiwit (pRb), p107 en p130 bestaat uit de zak eiwit familie en zijn goed ingeburgerd regulatoren van de celcyclus exit. Echter, er is steeds meer bewijs dat deze eiwitten celcyclus onafhankelijke aspecten van de ontwikkeling van het zenuwstelsel te reguleren ook. Zoals we eerder hebben laten zien, pRb en p107 spelen een cruciale rol in zowel de tangentiële 4,23 en radiale migratie 6. Hier tonen we de rol van pocket eiwit familieleden pRb en p107 op neurale migratie 6 het gebruik van in utero elektroporatie van Cre illustreren in een transgeen model. Samengevat, IUE biedt een krachtige manier van analyseren cel autonome effecten van gendeletie (of overexpressie). In combinatie met weefsel-specifieke knock-out modellen, kan IUE aanvullende informatie over de mechanismen die de neurale migratie bieden.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Square Wave Electroporator</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td>Alleen Electroporator – koop kabels apart (45-0204)</td></tr><tr><td>1250FS Footswitch voor ECM 830</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td>Voetpeddel is noodzakelijk voor hands-free elektroporatie</td></tr><tr><td>Tweezertrodes</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0489 (5mm)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 45-0488 (7mm)</td><td>Platinumtang stijlelektroden</td></tr><tr><td>Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td>Microinjector</td></tr><tr><td>Griphead 0</td><td>Eppendorf</td><td>920007414</td><td>Houdt de getrokken naald vast</td></tr><tr><td>Universal Capillary Holder</td><td>Eppendorf</td><td>920007392</td><td>Verbindt griphead met buis</td></tr><tr><td>Injection Tube</td><td>Eppendorf</td><td>920007431</td><td>Verbindt capillairhouder met Femtojet</td></tr><tr><td>Foot Control</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td>Voetpeddel voor hands-free injectie</td></tr><tr><td>Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Tips voor het laden van de getrokken capillaire buisjes</td></tr><tr><td>Plasmid Mega Kit</td><td>Qiagen</td><td>12181</td><td>5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Niet-toxische kleurstof</td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Schaartjes</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td>Voor het trimmen van de naalden</td></tr><tr><td>Bonn Strabismus Schaartjes</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Recht</td></tr><tr><td>Colibri Retractors</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Stapler</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-07</td><td>Voor 7mm clips</td></tr><tr><td>Castroviejo Needle Holder</td><td>Medical Tools</td><td>SNH-6737</td><td>Rechts, met vergrendeling</td></tr><tr><td>Needle Puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Voor het trekken van microcapillairen</td></tr><tr><td>Microcapillaries</td><td>Drummond</td><td>1-000-800</td><td>0,4 mm binnendiameter glazen capillaire buisjes</td></tr></tbody></table>

inductie van eiwit van de verwijdering door in utero electroporatie tekorten definieer in neuronale migratie in transgene modellen

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetische verwijderen met behulp van het Cre-Lox-systeem in transgene muis lijnen is een krachtig instrument dat wordt gebruikt om de functies van eiwitten te bestuderen. Behoudens specifieke Cre modellen, verwijdering van een eiwit gedurende een weefsel of cel populatie leidt vaak tot complexe fenotypes als gevolg van meerdere interactie mechanismen. Bepalen of een fenotype resultaten van verstoring van een cel autonoom mechanisme heid die de betreffende cel, of van een niet-cel autonoom mechanisme wat uit aantasting van de omgeving van die cel, moeilijk duidelijk. Inzicht in eiwitfunctie verwerven in een in vivo context in utero elektroporatie (IUE) maakt gen deletie in een kleine subset van cellen in de ontwikkelingslanden cortex of een andere geselecteerde hersengebied. IUE kan worden gebruikt om specifieke hersengebieden, waaronder de dorsale telencephalon, mediale telencephalon, hippocampus of ganglion verhevenheid richten. Dit vergemakkelijkt observatie of de gevolgen van cel autonome gen deletie in het kader van een gezond milieu. Het doel van dit protocol te tonen hoe IUE kan worden gebruikt om een ​​defect in radiale migratie analyseren een floxed transgene muis lijn, met de nadruk op het onderscheid tussen de cel zelfstandige en niet-cel-autonome effecten van eiwit deletie. Door vergelijking van het fenotype gevolg van gen deletie in het gehele cortex versus IUE gemedieerde gen deletie in een beperkte celpopulatie inzicht in eiwitfunctie hersenontwikkeling kan worden verkregen dan met behulp van technieken afzonderlijk.

Verschillende hersengebieden kunnen worden getarget voor elektroporatie door de oriëntatie van de pedelelektroden boven de kop van het embryo te variëren (Figuur 2). Voor alle delen van de voorhersenen wordt het plasmide in het laterale ventrikel geïnjecteerd (de achterhersenen kunnen worden getarget door injectie in het vierde ventrikel). Plaats de elektroden in het algemeen zodanig dat de rechte lijn tussen hen door het gebied van interesse loopt, waarbij het DNA naar de positieve elektrode wordt getro...

Neuronmigratie wordt gereguleerd door talrijke cel-autonome en niet-cel-autonome factoren. Dit protocol laat zien hoe in utero elektroporatie kan worden gebruikt om te bepalen of een fenotype in een transgene muis het gevolg is van verstoring van een intrinsiek celmechanisme of belemmering van de interactie tussen de neuron en zijn omgeving.

Inductie van Eiwit van de verwijdering door In Utero Electroporatie tekorten Definieer in neuronale migratie in transgene modellen

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om defecten in neurale ontwikkeling en migratie te analyseren in transgene muismodellen met behulp van in utero elektroporatie van verschillende regio's van de embryonale voorhersenen. Dit wordt bereikt door een plasmide met genen voor Cree en een reporter-eiwit zoals GFP in de ventrikel van een embryonaal brein te injecteren en een elektrische stroom op het hoofd toe te passen om dat plasmide in de celwand van de ventrikel te trekken. Als tweede stap worden de embryo's teruggeplaatst in de buikholte van de moeder om de embryo's te laten ontwikkelen terwijl crease tot expressie wordt gebracht en genen-excisie specifiek in de geëlektropoerde neuronen mediëert.Vervolgens worden embryo's verzameld en de hersenen worden gefixeerd voor analyse om de effecten van CRE-gemedieerde genen-excisie en daaropvolgende eiwitknockdown in de geëlektropoerde neuronen te bepalen. Er worden resultaten verkregen die laten zien hoe excisie van het gen van belang de neurale ontwikkeling en migratie op een celspecifieke manier reguleert met behulp van immunohistochemie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals w

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In utero elektroporatie is een waardevolle methode voor het transfecteren neuronale stamcellen in vivo. Afhankelijk van de plaatsing van de elektroden en de ontwikkeling meetpunt van elektroporatie, kunnen bepaalde subsets van corticale cellen worden gericht. Gerichte cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in vivo of in vitro voor de effecten van genetische manipulatie.

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Dit protocol beschrijft in detail hoe specifiek te transfecteren verschillende regio's in het centrale zenuwstelsel van C57BL/6 via in utero elektroporatie. Inbegrepen in dit protocol zijn gedetailleerde instructies voor transfecties van regio's die zich ontwikkelen tot de cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, laterale septumkern en striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie in de C57BL / 6 muis

Nodulair heterotopia van de Periventricular (PNH) is de meest voorkomende vorm van misvorming van corticale ontwikkeling (MCD) in volwassenheid maar haar genetische basis blijft onbekend in meest sporadische gevallen. Onlangs hebben we een strategie nieuwe kandidaat om genen te identificeren voor MCDs en direct bevestigen hun oorzakelijke rol in vivo.

Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen

Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

Cel-autonome functies van genen in de hersenen kunnen worden bestudeerd door het induceren van verlies of winst van functie in dunbevolkte van cellen. Hier beschrijven we in utero electroporation om te Cre recombinase leveren in dunbevolkte corticale neuronen met floxed genen te ontwikkelen om te leiden tot verlies van functie in vivo.

Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.

Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten

In dit protocol beschrijven we hoe de vruchtwaterholte van de muis op E7.5 kan worden geïnjecteerd met lentivirus, wat leidt tot uniforme transductie van de gehele neurale plaat, met minimale schadelijke effecten op overleving of embryonale ontwikkeling.

Murine Neural Plate Targeting door In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) op Embryonale Dag 7.5

Leer hoe in utero-elektroporatie neurale ontwikkeling en migratie analyseert in transgene muismodellen. Deze methode maakt gerichte genmanipulatie mogelijk voor gedetailleerd fenotype-onderzoek.

Inductie van Eiwit van de verwijdering door In Utero Electroporatie tekorten Definieer in neuronale migratie in transgene modellen (Video) | JoVE Journal

Inductie van Eiwit van de verwijdering door In Utero Electroporatie tekorten Definieer in neuronale migratie in transgene modellen

Meer video's verkennen