Name: Ontwikkeling van een In vitro Modelsysteem voor het bestuderen van de interactie van Equus Caballus IgE met zijn receptor met hoge affiniteit FceRI (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Leer hoe je een in vitro assaysysteem ontwikkelt voor het meten van IgE-afhankelijke mediatorvrijlating met rat basofiele leukemiecellen. Deze methode ondersteunt allergieonderzoek en behandelingsontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Dr. Lynda Partridge voor het verstrekken van advies en laboratoriumfaciliteiten.

1) Voorbereiding van de Cell Line: <ol><li> Het ontwikkelen van de RBL-2H3.1 cellijn die paarden FceRI α: <ol><li> Met behulp van elementaire weefselkweek technieken voor monolaag cellijnen, transfecteren ouderlijke RBL-2H3.1 cellen met behulp van de pEE6 plasmide, het dragen van de paarden FcsRIa gen (GenBank: Y18204.1) 28. Voeg 2 ul -1 ug van het plasmide DNA 0,8 ml van cellen bij een dichtheid van 1,2 x 10 7 cellen ml-1. Electroporate de cellen bij 250 uF 960 V met een 0,4 cm electrocuvette onmiddellijk incubeer op ijs gedurende 10 min. </li><li> Selecteer de getransformeerde cellen met medium dat 0,4 g geneticine G418 sulfaat, vervolgens sorteren de overblijvende levende cellen door FACS door taggen met een fluorescerende IgE antilichaam. Gebruik de resulterende RBL-2H3.1 uiten equine FcsRIa cellijn voor het onderzoek 2, 3. </li></ol></li><li> Pre-test antilichaam sensibilisatie: <ol><li&gt; Oogst de RBL-2H3.1 uiten paarden FcsRIa cellen van een samenvloeiing petrischaal. Wassen dan resuspendeer de cellen in kweekmedium tot een celdichtheid van 5x10 5 cellen ml-1. </li><li> Voeg de IgE van belang de gesuspendeerde cellen tot een eindconcentratie van 1 ng ml -1, dan plaat 100 ul cellen op een 96 puts plaat bij kolommen 1-6 en incubeer bij 37 ° C + 5% CO2 + 90% relatieve vochtigheid gedurende 16 uur. Na de incubatietijd, en voor het uitvoeren van de release assay, controleer dan de putten onder een microscoop voor goed confluentie en cel therapietrouw. </li></ol></li></ol> 2) afgifte test: <ol><li> Het wassen van de cellen: <ol><li> Warm afgifte buffer (25 mM PIPES, 120 mM natriumchloride, 5 mM kaliumchloride, 0,04 mM magnesiumchloride en 1 mM calciumchloride) bij 37 ° C om voor zacht wassen van de cellen. </li><li> Was de cellen in door de plaat naar cel media verwijderen en toevoegen van 100 ul warm, 37 ° C, vrijlating buffer. Tweemaal herhalen. </li></ol></li><li> Antigen uitdaging: <ol><li> Bereid een seriële verdunning van het antigeen (NIP-HSA of DNP-HSA) van 0 ng ml -1, 0,1 ng ml -1, 1 ng ml -1, 10 ng ml-1, 100 ng ml -1, 1000 ng ml -1, 10.000 ng ml-1 in afgiftebuffer en verwarm bij 37 ° C. </li><li> Na de tweede cel wassen, gooi de media en vervangen door 100 ul van het antigeen oplossingen. Controleer of putten in dezelfde rij (A1-6 bijvoorbeeld) dezelfde antigeenconcentratie toegevoegd. </li><li> Het opzetten van een negatieve controle in rij A door het toevoegen van 0 ng ml-1-antigeen. Voeg toenemende antigeenconcentratie langs de rijen (BG) gevolgd door Triton x-buffer (5% Triton X-100) in rij H cellen lyseren van de cellen worden gebruikt als een positieve controle. Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten om de cellen zijn mediatoren vrij. </li></ol></li><li> Het opzetten van individuele welzijn controles: <ol><li> Na de incubatie, overdracht 50 pi celsupernatant aan de andere helft van de plaat (putjes A1-6 putjes A7-12, etc.). Gooi de resterende 50 pl supernatant en vervangen door 50 pi Triton-x buffer voor de meting van de hoeveelheid vrijgekomen mediatoren in elke well in kolom 7-12 laten als percentage van de totale mediatoren in de cellen in kolom 1-6 . </li></ol></li><li> Enzym substraat: </li><li> Voeg 50 ul van β-hexosaminidase substraat (50 mM 4-nitrofenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide bereid in DMSO verdund tot 2 mM toe te voegen aan citraatbuffer 0,2 M citroenzuur en 0,2 M natriumacetaat, pH 4,5) alle wells om de omzetting van het substraat 4-nitrofenol door β-hexosaminidase enzym vergemakkelijkt. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 2 uur. </li></ol><img alt="Figuur 2.4.1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52222/52222fig241.jpg" width = &quot;400&quot; /&gt; <ol start="5"><li> Het beëindigen van de reactie: <ol><li> Stop de reactie door de toevoeging van 150 pl Tris-buffer (1 M Tris-HCl, pH 9) aan elk putje en de hoge pH van de buffer stopt de reactie en wordt de 4-nitrofenol een gele kleur. </li></ol></li><li> Het lezen en analyseren van de resultaten: <ol><li> Lees de plaat met een plaat spectrofotometer bij 405 nm om de absorptie van de gele kleur te meten. Berekend het percentage vrijgegeven β-hexosaminidase met behulp van de volgende formule: </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 2.6.1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52222/52222fig261.jpg" width="100" /><ol start="2"><li> Pas deze formule aan elk putje, waarna een gemiddelde wordt genomen voor elke rij. A1 en A7 geven de plaats van de putjes in de plaat met 96 putjes. Maak een grafiek van percentage van β-hexosaminidase afgifte (die overeenkomt met de totale mediatorafgifte) against antigeenconcentratie 2, 3. </li></ol>

<ol><li>Taudou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Alpha+Chain+of+Human+Fc%CE%B5RI+in+Transfected+Rat+Basophilic+Leukemia+Cells%3A+Functional+Activation+after+Sensitization+with+Human+Mite-Specific+IgE%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE.</a> Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).</li>
<li>Sabban, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+of+an+in+Vitro+Model+System+for+Studying+the+Interaction+of+EquuscaballusIgE+with+Its+High-Affinity+Fc%CE%B5RI+Receptor%22">Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity FcεRI Receptor</a>. , The University of Sheffield. Sheffield. (2011).</li>
<li>Sabban, S., Ye, H., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+Vitro+Model+System+for+Studying+the+Interaction+of+EquuscaballusIgE+with+Its+High-Affinity+Receptor+Fc%CE%B5RI%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity Receptor FcεRI.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 153 (1-2), 6-10 (2013).</li>
<li>Wilson, A. P. M., Pullar, C. E., Camp, A. M., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE+mediates+stimulus+secretion+coupling+in+rat+basophilic+leukemia+cells+transfected+with+the+a+chain+of+the+human+high-affinity+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgE mediates stimulus secretion coupling in rat basophilic leukemia cells transfected with the a chain of the human high-affinity receptor.</a> Eur J Immunol. 23, 240-244 (1993).</li>
<li>Hunter, M. J., Vratimos, A. P., Housden, J. E. M., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+canine-human+Fc+IgE+chimeric+antibodies+for+the+determination+of+the+canine+IgE+domain+of+interaction+with+Fc%CE%B5RI%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22MolImmunol%22%5BJournal%5D)">Generation of canine-human Fc IgE chimeric antibodies for the determination of the canine IgE domain of interaction with FcεRIα.</a> MolImmunol. 45 (8), 2262-2268 (2008).</li>
<li>Rashid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Diagnostic+and+therapeutic+applications+of+rat+basophilic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MolImmunol%22%5BJournal%5D)">Review: Diagnostic and therapeutic applications of rat basophilic leukemia cells.</a> MolImmunol. 52 (3-4), 224-228 (2012).</li>
<li>Cohen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+in+antiquity%3A+the+Ebers+Papyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy+Proc%22%5BJournal%5D)">Asthma in antiquity: the Ebers Papyrus.</a> Allergy Proc. 13 (3), 147-154 (1992).</li>
<li>Dudler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+catalytic+activity%2C+IgE-independent+mast+cell+activation%2C+and+allergenicity+of+bee+venom+phospholipase+A2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A link between catalytic activity, IgE-independent mast cell activation, and allergenicity of bee venom phospholipase A2.</a> J. Immunol. 155, 2605-2613 (1995).</li>
<li>Machado, D. C., Horton, D., Harrop, R., Peachell, P. T., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+allergens+stimulate+the+release+of+mediators+of+the+allergic+response+from+cells+of+mast+cell+lineage+in+the+absence+of+sensitization+with+antigen-specific+IgE%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen-specific IgE.</a> Eur J Immunol. 26 (12), 2972-2980 (1996).</li>
<li>Smyth, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+molecular+basis+of+pro-allergenic+effects+of+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the molecular basis of pro-allergenic effects of cigarette smoke.</a> Environ Sci Technol. 34 (7), 1370-1374 (2000).</li>
<li>Okada, H., Kuhn, C., Feillet, H., Bach, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27hygiene+hypothesis%27+for+autoimmune+and+allergic+diseases%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22ClinExpImmunol%22%5BJournal%5D)">The 'hygiene hypothesis' for autoimmune and allergic diseases: an update.</a> ClinExpImmunol. 160 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Eder, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+environmental+and+genetic+factors+on+allergen-specific+immunoglobulin-E+levels+in+sera+from+Lipizzan+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Influence of environmental and genetic factors on allergen-specific immunoglobulin-E levels in sera from Lipizzan horses.</a> Equine Vet J. 33 (7), 714-720 (2001).</li>
<li>Cook, W. R., Rossdale, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+syndrome+of+%27Broken+Wind%27+in+the+horse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The syndrome of 'Broken Wind' in the horse.</a> Proceedings of the Royal Society of Medicine. 56, 972-977 (1963).</li>
<li>Eyre, P., Lewis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+systemic+anaphylaxis+in+the+horse%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Acute systemic anaphylaxis in the horse.</a> Br. J. Pharmacol. 48 (3), 426-437 (1973).</li>
<li>Bruggink, M. Global betting stable, but some countries suffer recession. , International Federation of Horseracing Authorities. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.horseracingintfed.com/Default.asp?section=Resources&area=0&story=664">http://www.horseracingintfed.com/Default.asp?section=Resources&area=0&story=664</a> (2009).</li>
<li>Wagner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE+in+horses%3A+occurrence+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">IgE in horses: occurrence in health and disease.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 132 (1), 21-23 (2009).</li>
<li>Hellberg, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+insect+bite+hypersensitivity%3A+immunoblot+analysis+of+IgE+and+IgG+subclass+responses+to+Culicoidesnubeculosus+salivary+gland+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Equine insect bite hypersensitivity: immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoidesnubeculosus salivary gland extract.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 113 (1-2), 99-112 (2006).</li>
<li>Schaffartzik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+insect+bite+hypersensitivity%3A+what+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Equine insect bite hypersensitivity: what do we know.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 147 (3-4), 113-126 (2012).</li>
<li>Künzle, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE-bearing+cells+in+bronchoalveolar+lavage+fluid+and+allergen-specific+IgE+levels+in+sera+from+RAO-affected+horses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+A+PhysiolPatholClin+Med%22%5BJournal%5D)">IgE-bearing cells in bronchoalveolar lavage fluid and allergen-specific IgE levels in sera from RAO-affected horses.</a> J Vet Med A PhysiolPatholClin Med. 54 (1), 40-47 (2007).</li>
<li>Tahon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+allergy+tests+compared+to+intradermal+testing+in+horses+with+recurrent+airway+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">In vitro allergy tests compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction.</a> Vet ImmunolImmunopathol. (1-2), 85-93 (2009).</li>
<li>Wagner, B., Radbruch, A., Rohwer, J., Leibold, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+anti-equine+IgE+antibodies+with+specificity+for+different+epitopes+on+the+immunoglobulin+heavy+chain+of+native+IgE%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the immunoglobulin heavy chain of native IgE.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 92 (1-2), 45-60 (2003).</li>
<li>Wilson, A. D., Harwood, L., Torsteinsdottir, S., Marti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+monoclonal+antibodies+specific+for+native+equine+IgE+and+their+application+to+monitor+total+serum+IgE+responses+in+Icelandic+and+non-Icelandic+horses+with+insect+bite+dermal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Production of monoclonal antibodies specific for native equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with insect bite dermal hypersensitivity.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 112 (3-4), 156-170 (2006).</li>
<li>McAleese, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+the+extra-cellular+part+of+the+alpha+chain+of+the+equine+high-affinity+IgE+receptor+and+its+use+in+the+detection+of+IgE%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of the extra-cellular part of the alpha chain of the equine high-affinity IgE receptor and its use in the detection of IgE.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 110 (1-2), 187-191 (2006).</li>
<li>Ledin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+therapeutic+antibody+responses+against+IgE+in+dogs%2C+an+animal+species+with+exceptionally+high+plasma+IgE+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels.</a> Vaccine. 24 (1), 66-74 (2006).</li>
<li>Siraganian, R. P., Hook, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+release+and+assay+methods+for+the+study+of+human+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Manual+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Histamine release and assay methods for the study of human allergy.</a> Manual of Clinical Immunology. , American Society for Microbiology. Washington, D. C. (1980).</li>
<li>Neuberger, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hapten-specific+chimaericIgE+antibody+with+human+physiological+effector+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hapten-specific chimaericIgE antibody with human physiological effector function.</a> Nature. 314 (6008), 268-270 (1985).</li>
<li>Bingham, B. R., Monk, P. N., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Protein+Phosphorylation+and+Ca2%2B+Mobilization+in+a+low+secreting+variant+of+the+rat+basophilic+leukemia+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Defective Protein Phosphorylation and Ca2+ Mobilization in a low secreting variant of the rat basophilic leukemia cell line.</a> The Journal of Biological Chemistry. 269 (30), 19300-19306 (1994).</li>
<li>McAleese, S. M., Halliwell, R. E., Miller, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+sequencing+of+the+horse+and+sheep+high-affinity+IgE+receptor+alpha+chain+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Cloning and sequencing of the horse and sheep high-affinity IgE receptor alpha chain cDNA.</a> Immunogenetics. 1 (51), 878-881 (2000).</li>
<li>Hongtu, Y. Study of the structure/function relationship in canine and human IgE as the basis for the development of rational therapeutic intervention strategies in allergic disease. , The University of Sheffield. (2010).</li>
<li>Sabban, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+pan-anti-allergy+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22JIBTVA%22%5BJournal%5D)">Towards a pan-anti-allergy vaccine.</a> JIBTVA. 2 (2), 15-27 (2013).</li>
<li>Moran, G., Burgos, R., Araya, O., Folch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+bioassay+to+detect+reaginic+antibodies+from+the+serum+of+horses+affected+with+recurrent+airway+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">In vitro bioassay to detect reaginic antibodies from the serum of horses affected with recurrent airway obstruction.</a> Vet Res Commun. 34, 91-99 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben in dit artikel.

Samengevat zijn de resultaten van dit onderzoek bleek dat wanneer RBL-2H3.1 cellen die paarden FcsRIa worden gesensibiliseerd met paarden IgE en uitgedaagd door een antigeen, ze geven een piek mediator release van 36,68% ± 4,88% van het totale bedrag van de mediator in de cellen, vergeleken met de RBL-2H3.1 oorspronkelijke cellen niet tot expressie paarden FcsRIa. Dus deze test biedt een nuttig instrument voor het onderzoeken en bestuderen van equine allergische reacties in vitro. H...

Allergie is gekend voor duizenden jaren. Een astma-behandeling werd beschreven in het Oude Egyptische medische tekst die bekend staat als de Ebers Papyrus (~ 1550 BCE) en besproken kruidenmiddelen om het 7 behandelen. Vandaag allergie geclassificeerd als type I overgevoeligheidsreactie, waarbij de T-helpercel type 2 (Th2) arm van het immuunsysteem stuurt de productie van immunoglobuline E (IgE) antilichamen in respons op omgevingsveranderingen antigenen genoemd allergenen. Dit zijn verschillende stoffen die gewoonlijk interactie met cellen in het immuunsysteem en stimuleert de synthese en secretie van pro-inflammatoire cytokines, zoals interleukine-4 en interleukine-13 8, 9 als er deeltjes in sigarettenrook of dieseldeeltjes IgE synthese verbeteren 10. De stijging van allergische manifestaties industrielanden de afgelopen 50 jaar is toegeschreven aan een combinatie van het effect vanmilieuverontreinigende stoffen en een trend naar een meer hygiënische omgeving, die samen de immuunrespons tegen een profiel overheerst TH 2 cytokines verschuiven, zoals de &quot;Hygiene Hypothesis &#39;11 voorgesteld. Zoals hierboven vermeld, mensen niet de enige zoogdieren getroffen door allergie. Met name paarden en honden kunnen ook klassieke allergische reacties ontwikkelen en een studie met 12 blijkt dat, bij mensen, paarden allergie wordt toegeschreven aan genetische en omgevingsfactoren. Bijgevolg dienen deze dieren goed model voor het bestuderen van de interactie tussen genetische en oorzaken van allergie, de progressie van sensibilisatie voor ziekte, en mogelijke interventiestrategieën nadat klinische verschijnselen worden in In 1887, Stömmer was de eerste persoon die de gelijkenis tussen mensen en paarden astma 13 beschrijven, het effect van histamine op de paarden cardiovasculaire systeem isvergelijkbaar met die van mensen 14. Paarden zijn ook de hoeksteen van de paardenrennen, dat is een waarde van US $ 72000000000 met een betting omzet van US $ 115.000.000.000 per jaar 15. De meeste hedendaagse renpaarden zijn afstammelingen van het kleine aantal Arabische paarden gefokt door Lady Anne Blunt van 1878 en later. Moderne renpaarden worden vaak inteelt te selecteren voor de prestaties vaardigheden. Ze zijn gevoelig voor genetische aandoeningen, waarvan hun gevoeligheid voor allergische reacties monteren. Ze hebben ook 1000 maal hoger serum IgE-gehaltes dan zelfs de meest zwaar allergische mensen 16. Paard allergische reacties zijn meestal manifesteert als insectenbeet overgevoeligheid (IBH) 17, 18. IBH resultaten in dermatitis als gevolg van beten vormen insecten in het geslacht Culicoides. Een andere vorm van paardachtigen allergische ziekte terugkerende luchtweg obstructies (RAO) Dit manifesteert zich in de longen en luchtwegen. Het wordt gekenmerkt door een piepende ademhaling en labORed ademhaling. RAO zich vaker voordoet in reactie op sporen vormen en hoge allergeen-specifieke IgE niveaus zijn opgenomen in paarden met RAO in een studie 19 hoewel andere onderzoek niet heeft bevestigd 20. Studies over paarden allergie stond de poging tot controle en neutraliseren paarden IgE door de ontwikkeling van anti-paarden IgE monoklonale antilichamen (mAbs) 21 22. Verder is de studie van 23 beschrijft de productie van de extracellulaire domeinen van α paarden hoge affiniteit Fc receptor chain (FceRIa) receptor in een poging het detecteren en kwantificeren equine serum IgE. Een verwante studie van Ledin 24 bespreekt een nieuwe aanpak gericht op het neutraliseren van serum IgE door priming het immuunsysteem met behulp van een zelf / niet-zelf immunogeen. Al deze studies echter miste een effectieve test om de veiligheid en werkzaamheid van de testprotocollen. In dit artikel hebben we nu zo&#39;n assay sys presenterenteem voor het bestuderen van diagnostische en therapeutische strategieën om de paarden systeem, waarbij β-hexosaminidase afgifte, als een indicator van cel mediator degranulatie werd beoordeeld op RBL-cellen die 2H3.1 paarden FceRIa relevant. Dit protocol is gebaseerd op eerdere publicaties 25, 4, 5, 2, 3 beschrijft de constructie van RBL-cellen getransfecteerd met het gen dat codeert voor het IgE bindende domein van de receptor met hoge affiniteit voor IgE van verschillende species. Het protocol wordt uitgelegd hoe een β-hexosaminidase afgifte assay uitgevoerd, waarvan de resultaten worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaardafwijking van drievoudige experimenten. De release assay werd voor het eerst ontwikkeld door Siraganian en Haak 25 tot mens allergie te bestuderen. Het lab groep onder leiding van Dr. Reuben Siraganian ontwikkelde ook het RBL cellijn. Deze RBL cellen werden ontwikkeld om de menselijke FcsRIa uiten en het protocol dat werd gepubliceerd door 4. Het laatste stukjevan de test kwam met de ontwikkeling van het plasmide pSV in het artikel van Neuberger 26 die de productie van IgE-antilichamen beschreven door kloneren zijn zware keten gen stroomafwaarts van een muis gen voor een variabel gebied IgE dat het hapteen 4-hydroxy-3 richt nitro-phenacetyl (NP), het resulterende chimere antilichaam volledig functioneel. De mogelijkheid om een ​​IgE ontwikkelen zij hetzelfde hapteen, maar ook klonen zijn receptor op het oppervlak van RBL-cellen resulteerde in de standaardisatie van de test waardoor het een bruikbaar protocol voor de degranulatie van basofiele cellen te meten. De test heeft wel voor- en nadelen. De voordelen van de test is de aanpasbaarheid te gebruiken in zoogdiercelsystemen, ons lab is dus gebruikt om te testen op de degranulatie van de mens, honden en paarden systemen, en dit kan worden bereikt door eenvoudig synthetiseren IgE het organisme en klonen zijn receptor op het oppervlak van de RBL-cellen. Anderzijds,de nadelen van de test is dat de RBL-cellen zeer gevoelig zijn voor thermische, mechanische en PH veranderingen, waardoor ze een variatie van degranulatie niveaus in dezelfde test. Het wordt dus sterk aangeraden dat de assays altijd worden herhaald in drievoud en vervolgens een gemiddelde wordt genomen van hen. Bovendien is de RBL cellen neigen te verschuiven naar een niet lossend fenotype als ze nog in weefselkweek langere tijden (&gt; 10 weken) 27, waardoor het onderhoud omslachtig. Zij zijn ook gevoelig voor infecties door mycoplasma bacteriën, die onzichtbaar zijn van een lichtmicroscoop en kan de morfologie van de cel niet gewijzigd, maar zouden hun degranulatie niveaus drastisch veranderen. Dus regelmatig mycoplasma tests nodig.

<table><tbody><tr><td>RBL-2H3.1 Expressing Equine Fc&epsilon;RI&alpha;</td><td>-</td><td>-</td><td>Geproduceerd in het lab</td></tr><tr><td>Equine IgE anti NIP-HSA</td><td>-</td><td>-</td><td>Geproduceerd in het lab</td></tr><tr><td>96 Well Plate</td><td>Sigma</td><td>CLS3595</td><td>-</td></tr><tr><td>Multi Channel Pipette</td><td>Anachem</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Galaxy R</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>4Hydroxy-5-iodo-3-nitrofenylacetaat</td><td>Cambridge Research Biochemicals</td><td>N-1070-1</td><td>NIP-OH werd geconjugeerd met Human Serum Albumin om NIP-HSA in het lab te maken</td></tr><tr><td>Dinitrofenyl Geconjugeerd aan Human Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A6661</td><td>Afgekort DNP-HSA</td></tr><tr><td>Plate Spectrofotometer</td><td>Anthos Labtec HT2</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pipes</td><td>Sigma</td><td>P1851</td><td>-</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>-</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>-</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>-</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>-</td></tr><tr><td>Triton x100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>-</td></tr><tr><td>4-nitrofenyl N-acetyl-&beta;-D-glucosamine</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>Stockoplossing genaamd &beta;-hexosamine substraat was 50mM bereid in DMSO</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>-</td></tr><tr><td>Citroenzuur</td><td>Sigma</td><td>251275</td><td>-</td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Sigma</td><td>S7670</td><td>-</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>-</td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een in vitro modelsysteem voor het bestuderen van de interactie van equus caballus ige met zijn receptor met hoge affiniteit fceri

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

De interactie van IgE met zijn hoog-affiniteit Fc-receptor (FcεRI) gevolgd door een antigeen uitdaging is de belangrijkste route in IgE-gemedieerde allergische reacties. Als gevolg van de hoge affiniteitsbinding tussen IgE en FcεRI, samen met de continue productie van IgE door B-cellen, blijven allergieën meestal levenslang bestaan, waarbij momenteel geen permanente remedie beschikbaar is. Paarden, vooral racepaarden, die vaak inteelt zijn, zijn een soort zoogdieren die zeer vatbaar zijn voor de ontwikkeling van overgevoeligheidsreacties, wat hun prestaties ernstig kan aantasten. Fysiologische reacties op allergische sensibilisatie bij paarden weerspiegelen die bij mensen en honden. In dit artikel beschrijven we de ontwikkeling van een in situ assay systeem voor de kwantitatieve beoordeling van de afgifte van bemiddelaars van de allergische respons met betrekking tot het paardensysteem. Hiervoor werd het gen dat codeert voor het equiene FcεRIα getransfecteerd en tot expressie gebracht op het oppervlak van parentale Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cellen. Het genproduct van de getransfecteerde equiene α-keten vormde een functioneel receptorcomplex met de endogene rat β- en γ-ketens 1. Het resulterende assay systeem maakte een beoordeling mogelijk van de hoeveelheid bemiddelaar afgescheiden vanuit equiene FcεRIα getransfecteerde RBL-2H3.1 cellen na sensibilisatie met equien IgE en antigeen uitdaging, waarbij β-hexosamine-dase afgifte als meetwaarde werd gebruikt 2, 3. De afgifte van bemiddelaars bereikte een piek van 36,68% ± 4,88% bij 100 ng ml-1 van antigeen. Deze assay werd aangepast van eerdere assays die werden gebruikt om menselijke en honden allergische reacties te bestuderen 4, 5. We hebben ook aangetoond dat dit type assay systeem meerdere toepassingen heeft voor de ontwikkeling van diagnostische hulpmiddelen en de veiligheidsbeoordeling van potentiële therapeutische interventiestrategieën bij allergische ziekten 6, 2, 3.

De ouderlijke RBL-2H3.1 cellen en die getransfecteerd met de paarden FcsRIa receptor gen werden voor het eerst gesensibiliseerd met muis IgE anti DNP-HSA en uitgedaagd met de DNP-HSA antigeen. Muis IgE bindt aan de endogene receptor in rat beide cellijnen en werkt dus als een controle om de levensvatbaarheid vrijlating van beide cellijnen te testen om mediators (Figuur 1 A) los. Dit is een belangrijke controle en dient regelmatig sinds na uitgebreid (&gt; 10 weken) passage worden uitgevoerd in celcultur...

De huidige studie beschrijft de ontwikkeling en toepassingen van een genetisch gemanipuleerd assaysysteem gebaseerd op de transfectie van rattenbasofiele leukemiecellen met het paarden FcεRIα-gen. Getransfecteerde cellen drukken een functioneel receptor uit waarbij de afgifte van mediatoren van de allergische respons kan worden geactiveerd door IgE en antigeen.

Ontwikkeling van een In vitro Modelsysteem voor het bestuderen van de interactie van Equus Caballus IgE met zijn receptor met hoge affiniteit FceRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de hoeveelheid IgE-afhankelijke mediatorafgifte van RAD-basofiele leukemiecellen te meten. De allergiesymptomen worden veroorzaakt door de afgifte van mediatoren zoals histamine. Nu, histamine is niet de enige mediator die wordt afgegeven door basofielen en mestcellen.Het totaal van alle mediatoren die door deze cellen worden afgegeven, resulteert in de tekenen en symptomen van onmiddellijke en vertraagde overgevoeligheid. Nu zijn mensen niet de enige organismen die last hebben van allergie, honden en paarden hebben het ook. Om het onderzoek verder te ontwikkelen en behandelingen tegen allergieën zoals vaccins te vinden, is een afgiftetest vereist om de hoeveelheid afgegeven mediatoren, indien aanwezig, uit de onderzoeksbehandeling te kwantificeren.Dit is de reden voor deze afgiftetest. De RBL-mediator afgiftetest voor het menselijk systeem werd voor het eerst ontwikkeld en gepubliceerd door Ian en Hook in 1986. Het werd later ontwikkeld voor het DOC-systeem en nu voor het paardensysteem.De aanpassingen zijn zo eenvoudig als het veranderen van de eiwitten van belang. Het cellijnnieuws was de Rat Baso leukemie of RBL twee H 3.1 cellijn die het paard hoge FNT ffc Serin R een receptoren alpha keten tot een celdichtheid van 500.000 cellen per milliliter expresseert. Voeg het IgE-antilichaam van belang toe aan een uiteindelijke concentratie van één nanogram per milliliter.Voeg 100 microliter van het mengsel toe aan een 96 bodemplaat en incubeer gedurende 16 uur bij 37 graden. Dit laat de cellen aan de welbedekte oppervlakte hechten en de antilichaam bindt aan zijn receptorwas. Twee keer het medium dat de resterende ongebonden antilichaam en dode cellen bevat met 100 microliter warme 37 graden afgiftepuffer.Gooi de buffer van de laatste was weg en vervang met 100 microliter van het antigeen van belang bij de concentratie van belang. Na 20 minuten incubatie bij 37 graden, breng 50 microliter van de SUP natin die de afgiftemediatoren bevat over naar een nieuw putje en vervang de resterende supernatant met 50 microliter Triton X buffer om de cellen te lysen en de resterende mediatoren in de cellen vrij te maken. Bij 50 microliter van 2 miljoen molaire bèta hx.Veel dagen substraat opgelost in citroenzuurbuffer. Na een tweede incubatie bij 37 graden, voeg 150 microliter trisbuffer toe aan elke put en maak de put geel. Meet de kleurabsorptie bij 405 nanometer Na 16 uur.Warm de afgiftepuffer, ook bekend als Ian Buffer, op bij 37 graden. Bereid ook de concentratiegradiënt van het antigeen in afgiftepuffer bij concentraties voor. Nul 0,1 1 10, 100, 1000 en 10.000 nanogram per milliliter.Vervolgens opwarmen bij 37 graden. Was de putjes door snel de schaal te klapperen om het medium te verwijderen en voeg voorzichtig 100 microliter warme afgiftepuffer toe naar de wanden van de putjes. Dit is om celstress door temperatuurverschil te verminderen, wat ervoor zorgt dat ze voortijdig mediatoren vrijgeven.De schaal moet twee keer worden gewassen. Gooi de laatste afgiftepuffer weg, was en voeg 100 microliter antigeen toe, beginnend met nul antigeenconcentratie in rij A voor de negatieve controle, en ga dan naar beneden over de concentratiegradiënt van rijen B tot G en tenslotte naar Triton X-sneden, buffer in rij H. Dat is voor de positieve controle. Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij 37 graden.Dit is het punt waar de cellen na de incubatieperiode mediatoren afgeven. Breng 50 microliter van de vloeistof in elke put over naar de respectieve put. Bij kolom zeven tot 12 volledig uitpeppen en gooi de resterende vloeistof weg bij posities één tot zes en vervang met 50 microliter Triton X-lysebuffer.Voeg 50 microliter van het voorbereide substraat toe aan alle 96 putjes van de schaal. Incubeer bij 37 graden gedurende twee uur. De bèta H, veel dagen converses substraat in vier nitrofenol.Na de incubatieperiode, stop de reactie door 150 microliter trisbuffer toe te voegen, waardoor de vier nitrofenol geel wordt. Lees de plaat met behulp van een plaatspectrofotometer bij 405 Nanometer. Na het meten van de absorptiegegevens, bereken de totale hoeveelheid mediatoren in de cellen in de puttenpositie A één door te vermenigvuldigen.Het bijbehorende putje op positie a zeven met twee en het resultaat toe te voegen aan de waarde op a een. Dit komt omdat tijdens het experiment we het supernatant hebben dat de afgiftemediatoren in tegenstand A een bevat, zoals we het in een nieuwe put in tegenstand hebben overgebracht. A zeven.Herhaal de berekeningen voor de rest van de putjes. Bereken het percentage afgiftemediatoren in de put tegenstand, A zeven van de berekende totale mediatoren in de cellen door de A zeven positiewaarde met twee te vermenigvuldigen. Nogmaals, omdat tijdens het experiment we het supernat hebben dat de Reese-mediatoren bevat.Zoals we het in een nieuwe put hebben overgebracht, vermenigvuldig dat product met 100 en deel dat product door de bijbehorende totale waarde van mediatoren in de cellen voor die positie. Dit geeft het percentage afgiftemediatoren voor de put. Herhaal de berekeningen voor de rest van de putjes, aangezien de zes putjes in elke rij worden uitgedaagd door dezelfde concentratie antigeen gemiddeld.Deze waarden en bereken de standaarddeviatie, plot deze waarden op een grafiek zoals volgt. De grafiek toont dat naarmate de antigeenconcentratie toeneemt, meer mediatoren worden afgegeven totdat deze piekt bij 100 nanogram per milliliter, waarna de mediatorafgifte afneemt met toenemende antigeenconcentratie. Het uiteindelijke experimentele resultaat zou er zo uit moeten zien als deze grafieken, zoals te zien is op grafiek B. De controle-afgiftetest in lichtblauw bevat geen IgE-antilichamen en

development-an-vitro-model-system-for-studying-interaction-equus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates FcγRIIIa-driven events initiated by therapeutic antibodies in human natural killer cells. The artificial stimulation platform facilitates the exploration of downstream effector functions, encompassing cytoskeletal rearrangement, degranulation, chemokine/cytokine production, and signaling pathways mediated by the FcγRIIIa and Fc portions of antibodies involved in binding.

An In Vitro Artificial Activation Assay for Studying Fc Receptor Activation by Antibodies

Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) is een gevestigde diermodel voor multiple sclerose. C57BL / 6 muizen worden geïmmuniseerd met myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), wat resulteert in een oplopende zwakke verlamming veroorzaakt door autoreactieve immuuncellen in het centrale zenuwstelsel. Protocollen voor de ziekte van inductie en toezicht zal worden besproken.

Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Geïnduceerde experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 muizen

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode die wordt gebruikt voor de detectie en kwantificering van EHV-2 DNA in ademhalingsvloeistoffen van paarden. Het validatieprotocol voor EHV-2 qRT-PCR omvat een drieledige procedure: ontwikkeling, karakterisering van de qRT-PCR-test alleen en karakterisering van de volledige analytische methode.

Ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode voor equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Een primaire kweek van runder corneale endotheelcellen werd gebruikt om het mechanisme van corneale endotheel-mesenchymale overgang te onderzoeken. Verder werd een rat hoornvliesendotheel cryoinjury model gebruikt om corneale endotheel-mesenchymale overgang in vivo te demonstreren.

In vitro en in vivo modellen voor de studie van het hoornvlies endotheel-mesenchymale transitie

In dit rapport presenteren we een protocol waarmee de onderzoeker een muismodel van intraoculaire uveïtis kan genereren. Meer algemeen aangeduid als experimentele auto-immune uveïtis (EAU), dit gevestigde model legt vele aspecten van de menselijke ziekte vast. Hierin zullen we beschrijven hoe de progressie van de ziekte kan worden geïnduceerd en gevolgd met behulp van verschillende uitlezingen.

Experimentele auto-immune uveïtis: een intraoculair inflammatoir muismodel

Om experimentele auto-immune encefalomyelitis, een diermodel van multiple sclerose, te induceren, worden muizen geïmmuniseerd met een water-in-olie-emulsie die een autoantigeen bevat en het adjuvans van Freund compleet maakt. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor de bereiding van deze emulsies, wordt hier een snel, eenvoudig en gestandaardiseerd homogenisatieprotocol voor emulsievoorbereiding gepresenteerd.

Een snelle, eenvoudige en gestandaardiseerde homogenisatiemethode om antigeen / adjuvante emulsies voor te bereiden voor het induceren van experimentele auto-immune encefalomyelitis

Enteroïden zijn in opkomst als een nieuw model voor het bestuderen van weefselfysiologie en pathofysiologie, medicijnontwikkeling en regeneratieve geneeskunde. Hier beschrijven we een 2D-enteroïde-afgeleid kweeksysteem van rundercellen dat co-kweek met relevante weefselceltypen mogelijk maakt. Dit model biedt een translationeel voordeel voor modellering van gastro-intestinaal onderzoek.

Generatie van een rundvee primair enteroïde-afgeleid tweedimensionaal monolaagkweeksysteem voor toepassingen in translationeel biomedisch onderzoek

Dit protocol schetst de gedetailleerde stappen van het pre-embedden van immuno-elektronenmicroscopie, met een focus op het verkennen van synaptische circuits en eiwitlokalisatie in het netvlies.

Onderzoek naar retinale circuits en moleculaire lokalisatie door pre-embedding immuno-elektronenmicroscopie

Enterische glia worden steeds meer erkend voor hun rol in intestinale homeostase en ziekteprocessen, inclusief postoperatieve complicaties. Paardenpatiënten die herstellen van een verkennende laparotomie in noodgevallen lijden aan een hoog risico op inflammatoire postoperatieve aandoeningen, wat het belang benadrukt van het opzetten van herhaalbare primaire celcultuur van paardendarmglia voor onderzoek.

Equine Enteric Glial Culture en toepassing op de studie van een neuraal inflammatoir mechanisme bij paardenkoliek

De studie toont de rol van de huid aan bij het moduleren van immuunresponsen bij muizen door middel van epicutane (EC) immunisatie. EC-immunisatie met een eiwitantigeen kan immuunresponsen bij contactovergevoeligheid onderdrukken of door de huid geïnduceerde onderdrukking omkeren in combinatie met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen. EC-immunisatie is veelbelovend als een effectieve, naaldvrije benadering van immunotherapie.

Muizenmodel van epicutaan geïnduceerde immunomodulatie

Leer hoe je een in vitro assaysysteem ontwikkelt voor het meten van IgE-afhankelijke mediatorvrijlating met rat basofiele leukemiecellen. Deze methode ondersteunt allergieonderzoek en behandelingsontwikkeling.

Ontwikkeling van een In vitro Modelsysteem voor het bestuderen van de interactie van Equus Caballus IgE met zijn receptor met hoge affiniteit FceRI (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van een In vitro Modelsysteem voor het bestuderen van de interactie van Equus Caballus IgE met zijn receptor met hoge affiniteit FceRI

Meer video's verkennen