Ontwikkeling van een In vitro Modelsysteem voor het bestuderen van de interactie van Equus Caballus IgE met zijn receptor met hoge affiniteit FceRI

Het algemene doel van het volgende experiment is om de hoeveelheid IgE-afhankelijke mediatorafgifte van RAD-basofiele leukemiecellen te meten. De allergiesymptomen worden veroorzaakt door de afgifte van mediatoren zoals histamine. Nu, histamine is niet de enige mediator die wordt afgegeven door basofielen en mestcellen.

Het totaal van alle mediatoren die door deze cellen worden afgegeven, resulteert in de tekenen en symptomen van onmiddellijke en vertraagde overgevoeligheid. Nu zijn mensen niet de enige organismen die last hebben van allergie, honden en paarden hebben het ook. Om het onderzoek verder te ontwikkelen en behandelingen tegen allergieën zoals vaccins te vinden, is een afgiftetest vereist om de hoeveelheid afgegeven mediatoren, indien aanwezig, uit de onderzoeksbehandeling te kwantificeren.

Dit is de reden voor deze afgiftetest. De RBL-mediator afgiftetest voor het menselijk systeem werd voor het eerst ontwikkeld en gepubliceerd door Ian en Hook in 1986. Het werd later ontwikkeld voor het DOC-systeem en nu voor het paardensysteem.

De aanpassingen zijn zo eenvoudig als het veranderen van de eiwitten van belang. Het cellijnnieuws was de Rat Baso leukemie of RBL twee H 3.1 cellijn die het paard hoge FNT ffc Serin R een receptoren alpha keten tot een celdichtheid van 500.000 cellen per milliliter expresseert. Voeg het IgE-antilichaam van belang toe aan een uiteindelijke concentratie van één nanogram per milliliter.

Voeg 100 microliter van het mengsel toe aan een 96 bodemplaat en incubeer gedurende 16 uur bij 37 graden. Dit laat de cellen aan de welbedekte oppervlakte hechten en de antilichaam bindt aan zijn receptorwas. Twee keer het medium dat de resterende ongebonden antilichaam en dode cellen bevat met 100 microliter warme 37 graden afgiftepuffer.

Gooi de buffer van de laatste was weg en vervang met 100 microliter van het antigeen van belang bij de concentratie van belang. Na 20 minuten incubatie bij 37 graden, breng 50 microliter van de SUP natin die de afgiftemediatoren bevat over naar een nieuw putje en vervang de resterende supernatant met 50 microliter Triton X buffer om de cellen te lysen en de resterende mediatoren in de cellen vrij te maken. Bij 50 microliter van 2 miljoen molaire bèta hx.

Veel dagen substraat opgelost in citroenzuurbuffer. Na een tweede incubatie bij 37 graden, voeg 150 microliter trisbuffer toe aan elke put en maak de put geel. Meet de kleurabsorptie bij 405 nanometer Na 16 uur.

Warm de afgiftepuffer, ook bekend als Ian Buffer, op bij 37 graden. Bereid ook de concentratiegradiënt van het antigeen in afgiftepuffer bij concentraties voor. Nul 0,1 1 10, 100, 1000 en 10.000 nanogram per milliliter.

Vervolgens opwarmen bij 37 graden. Was de putjes door snel de schaal te klapperen om het medium te verwijderen en voeg voorzichtig 100 microliter warme afgiftepuffer toe naar de wanden van de putjes. Dit is om celstress door temperatuurverschil te verminderen, wat ervoor zorgt dat ze voortijdig mediatoren vrijgeven.

De schaal moet twee keer worden gewassen. Gooi de laatste afgiftepuffer weg, was en voeg 100 microliter antigeen toe, beginnend met nul antigeenconcentratie in rij A voor de negatieve controle, en ga dan naar beneden over de concentratiegradiënt van rijen B tot G en tenslotte naar Triton X-sneden, buffer in rij H. Dat is voor de positieve controle. Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij 37 graden.

Dit is het punt waar de cellen na de incubatieperiode mediatoren afgeven. Breng 50 microliter van de vloeistof in elke put over naar de respectieve put. Bij kolom zeven tot 12 volledig uitpeppen en gooi de resterende vloeistof weg bij posities één tot zes en vervang met 50 microliter Triton X-lysebuffer.

Voeg 50 microliter van het voorbereide substraat toe aan alle 96 putjes van de schaal. Incubeer bij 37 graden gedurende twee uur. De bèta H, veel dagen converses substraat in vier nitrofenol.

Na de incubatieperiode, stop de reactie door 150 microliter trisbuffer toe te voegen, waardoor de vier nitrofenol geel wordt. Lees de plaat met behulp van een plaatspectrofotometer bij 405 Nanometer. Na het meten van de absorptiegegevens, bereken de totale hoeveelheid mediatoren in de cellen in de puttenpositie A één door te vermenigvuldigen.

Het bijbehorende putje op positie a zeven met twee en het resultaat toe te voegen aan de waarde op a een. Dit komt omdat tijdens het experiment we het supernatant hebben dat de afgiftemediatoren in tegenstand A een bevat, zoals we het in een nieuwe put in tegenstand hebben overgebracht. A zeven.

Herhaal de berekeningen voor de rest van de putjes. Bereken het percentage afgiftemediatoren in de put tegenstand, A zeven van de berekende totale mediatoren in de cellen door de A zeven positiewaarde met twee te vermenigvuldigen. Nogmaals, omdat tijdens het experiment we het supernat hebben dat de Reese-mediatoren bevat.

Zoals we het in een nieuwe put hebben overgebracht, vermenigvuldig dat product met 100 en deel dat product door de bijbehorende totale waarde van mediatoren in de cellen voor die positie. Dit geeft het percentage afgiftemediatoren voor de put. Herhaal de berekeningen voor de rest van de putjes, aangezien de zes putjes in elke rij worden uitgedaagd door dezelfde concentratie antigeen gemiddeld.

Deze waarden en bereken de standaarddeviatie, plot deze waarden op een grafiek zoals volgt. De grafiek toont dat naarmate de antigeenconcentratie toeneemt, meer mediatoren worden afgegeven totdat deze piekt bij 100 nanogram per milliliter, waarna de mediatorafgifte afneemt met toenemende antigeenconcentratie. Het uiteindelijke experimentele resultaat zou er zo uit moeten zien als deze grafieken, zoals te zien is op grafiek B. De controle-afgiftetest in lichtblauw bevat geen IgE-antilichamen en