Ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode voor equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Het algemene doel van de qPCR-methode is om de virale lading van equine herpesvirus-2 in biologische monsters van paarden te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de diagnostiek van ademhalingsziekten bij paarden, kwantitatieve gegevens over nieuwe interpretatieve hulpmiddelen voor beoefenaars. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een gevoelige, specifieke en snelle methode is.

Een ander voordeel is de ontwikkeling volgens AFNOR norme NF U47-600, die de Franse vertegenwoordiger is in het internationale normalisatiecomité. Het demonstreren van de procedure zal Erika Hue zijn, een jonge onderzoeker uit mijn eenheid. Om nucleïnezuren uit een biologisch monster van ademhalingsvloeistoffen te extraheren, begint u onder een afzuigkap met het toevoegen van 140 microliters biologisch monster aan 560 microliters lysisoplossing en incubeert u gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg 560 microliters ethanol toe aan het monster en breng 630 microliters van de totale oplossing aan op een silicakolom en centrifugeer. Breng de resterende 630 microliters aan op de silicakolom en centrifugeer opnieuw. Nadat het monster op de kolom is aangebracht, gebruikt u 500 microliters van elk van de wasbuffers AW1 en AW2 om de kolom twee keer te wassen.

Vervolgens om de nucleïnezuren uit de kolom te elueren, voegt u 50 microliters elutiebuffer bij kamertemperatuur of AVE-buffer toe. Sluit het dopje en incubeer gedurende een minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens gedurende een minuut bij 6.000 gs.

Om het DNA te versterken, bereidt u na het titreren van de primers en sonde volgens het tekstprotocol 22,5 microliters reactiemengsel voor elke reactie voor door 12,5 microliters PCR-mastermix, 20 micromolar voorwaartse en achterwaartse primers, 10 micromolar van de sonde en voldoende ultra-zuiver water toe te voegen om 22,5 microliters te bereiken. Om besmetting te voorkomen, bereidt u de PCR-reactiemengsel altijd in een specifiek gebied voor. Verdeel 22,5 microliters van de juiste reactiemengsel in elk reactieputje van een 96-putjesplaat.

Neem negatieve controles op voor extractie en PCR om er zeker van te zijn dat geen van de reagentia besmet is met ongewenst DNA. Voeg vervolgens 2,5 microliters van het monster, de negatieve extractiecontrole, de negatieve PCR-controle of het positieve controlemonster toe aan de bijbehorende reactieputjes. Bedek vervolgens de plaat met een kleefstofplaatseal.

En centrifugeer gedurende 10 seconden bij 6.000 gs. Plaats de plaat in een real-time PCR-systeem. Selecteer vervolgens het sjabloon voor de testindeling en de PCR-programma-instellingen die hier worden getoond, en start de run.

Na het overbrengen van de ruwe gegevens van het real-time PCR-systeem naar een spreadsheet, stelt u de drempel in de amplificatieplots boven de basislijn en binnen het exponentiële groeigebied in om de drempelcyclus voor elk monster te verkrijgen. Plot elk puntstandaardset als een standaardcurve om lineariteit te verkrijgen. Bereken vervolgens het aantal kopieën voor de verschillende monsters op basis van de standaardcurve.

Om de detectielimiet van de qRT-PCR-resultaten te bepalen, doseert u 90 microliters ultra-zuiver water in zes buisjes. Om zes tienvoudige seriële verdunningen van het plasmide voor te bereiden om de afnamezone te bepalen, begint u met het overbrengen van 10 microliters van de werkverdunning van het plasmide naar het buisje met 90 microliters ultra-zuiver water. Vorm kort en centrifugeer het buisje.

Breng vervolgens 10 microliters van het buisje over naar het volgende buisje met water. Na het mengen en centrifugeren herhaalt u de overdracht totdat alle buisjes met water het plasmide hebben ontvangen. Na het amplificeren van het DNA in de zes tienvoudige seriële verdunningen zoals eerder in deze video beschreven, bepaalt u de afnamezone, die de laatste verdunning van het plasmide is die een positief signaal produceert en de eerste verdunning zonder detectie.

Om zes tweevoudige seriële verdunningen voor te bereiden, doseert u 25 microliters ultra-zuiver water in zes buisjes. Van de laatste verdunning van het plasmide die een positief signaal gaf van de tienvoudige verdunning, brengt u 25 microliters van het buisje over naar het eerste buisje met water. Vorm en centrifugeer voordat u de resterende vijf verdunning bereidt zoals zojuist is gedemonstreerd.

Versterk het DNA van de tweevoudige seriële verdunningen zoals eerder in deze video is beschreven. Na het amplificeren van het DNA van de drie onafhankelijke proeven Bereken het aantal positieve replica's uit 24 replica's voor elk niveau van plasmideconcentratie. Bepaal de LOD met een betrouwbaarheid van 95 procent of LOD 95 procent PCR, wat het niveau is dat resulteert in de detectie van 23 positieve replica's uit 24 replica's.

Om de LOD van de methode te bepalen, bereidt u vijf tweevoudige seriële verdunningen voor, beginnend met 25 microliters van de werkverdunning van het plasmide die vier keer meer geconcentreerd is dan de laatste concentratie van een tienvoudige verdunning die een positief signaal gaf. Het plasmide dat in de amplificatiestap wordt gebruikt, komt van een werkverdunning van het plasmide die in een specifiek gebied is bereid om besmetting te voorkomen. Dit is een kritieke stap.

Breng 5 microliters van elke verdunning van het plasmide over naar vier buisjes met 135 microliters van het negatieve bronmateriaal om vier replica's van de vijf positieve standaarden te verkrijgen. Voer de extractie uit van de vier replica's voor de vijf positieve standaarden en voer de amplificatieprocedure uit zoals eerder in deze video is beschreven. Tel het aantal positieve replica's uit acht replica's voor elk niveau van plasmideconcentratie.

Bepaal ten slotte de LOD-methode, wat het laatste niveau is waarop acht replica's van acht replica's positief zijn. De kwantitat