Name: Ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode voor equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer een gevalideerde qPCR-methode voor het detecteren en kwantificeren van equid herpesvirus-2 in ademhalingsvloeistoffen van paarden. Deze techniek biedt gevoelige, specifieke en snelle diagnostische resultaten voor dierenartsen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Sophie Castagnet en Nadia Doubli-Bounoua bedanken voor hun technische ondersteuning. Dit werk ontving financiële steun van de Generale Raad van Calvados en de goedkeuring van de regio Basse-Normandie en de Franse regering (CPER 2007-2013; project R25 p3). De auteurs willen de deskundigen van de AFNOR-groep bedanken, en in het bijzonder Jean-Philippe Buffereau en Eric Dubois.

<ol><li>Brault, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+of+foals+to+natural+infection+with+equid+herpesvirus-2+and+its+association+with+febrile+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Immunol.Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness.</a> Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).</li>
<li>Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+gammaherpesviruses%3A+pathogenesis%2C+epidemiology+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.J%22%5BJournal%5D)">Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis.</a> Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).</li>
<li>Hue, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+of+equid+gammaherpesviruses+%28EHV-2%2C+EHV-5%29+in+nasal+swabs+using+an+accredited+standardised+quantitative+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method.</a> J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).</li>
<li>Diallo, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+real-time+PCR+for+the+detection+and+differentiation+of+equid+herpesvirus+1+%28EHV-1%29+and+equid+herpesvirus+4+%28EHV-4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4).</a> Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).</li>
<li>Williams, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+multinodular+pulmonary+fibrosis%3A+a+newly+recognized+herpesvirus-associated+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Pathol%22%5BJournal%5D)">Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease.</a> Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).</li>
<li>Mullis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+enzymatic+amplification+of+DNA+in+vitro%3A+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Symp.Quant.Biol%22%5BJournal%5D)">Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.</a> Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).</li>
<li>EPA Office of Water (4607). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EPA-815-B-04-001.+Quality+Assurance%2FQuality+Control+Guidance+for+Laboratories+Performing+PCR+Analyses+on+Environmental+Samples%22">EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples</a>. , (2004).</li>
<li>Telford, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+herpesviruses+2+and+5+are+gamma-herpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses.</a> Virology. 195 (2), 492-499 (1993).</li>
<li>Fortier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+equid+herpesvirus-5+in+respiratory+liquids%3A+A+retrospective+study+of+785+samples+taken+in+2006-2007%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.J%22%5BJournal%5D)">Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007.</a> Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).</li>
<li>Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+heterogeneity+and+variation+in+viral+load+during+equid+herpesvirus-2+infection+of+foals%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals.</a> Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).</li>
<li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NFU+47-600-1.+Animal+health+analysis+methods-PCR-Part+1%3A+Requirements+and+recommandations+for+the+implementation+of+veterinary+PCR%22">NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR</a>. , (2015).</li>
<li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NFU+47-600-2.+Animal+health+analysis+methods-PCR-Part+2%3A+Requirements+and+recommendations+for+the+development+and+the+validation+of+veterinary+PCR%22">NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR</a>. , (2015).</li>
<li>ISO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EN+ISO-CEI+17025.+General+requirements+for+the+competence+of+testing+and+calibration+laboratories%22">EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories</a>. , (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+Diagnostic+Tests+and+Vaccines+for+Terrestrial+Animals+2010.+Chapter1.1.1.4%2F+5.+Principles+and+Methods+of+Validation+of+Diagnostic+Assay+for+Infectious+Diseases%22">Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases</a>. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).</li>
<li>Apaza, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+genogrouping+of+noroviruses+from+children%27s+stools+by+Taqman+One-step+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR.</a> J Vis.Exp. (65), e3232(2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis.Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>NCBI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BLAST+Homepage+and+Selected+Search+Pages.+Introducing+the+BLAST+homepage+and+form+elements%2Ffunctions+of+selected+search+pages%22">BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages</a>. , (2015).</li>
<li>Greiner, M., Gardner, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+diagnostic+tests+in+veterinary+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.Vet+Med%22%5BJournal%5D)">Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies.</a> Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).</li>
<li>Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-laboratory+validation+of+chronic+bee+paralysis+virus+quantitation+using+an+accredited+standardised+real-time+quantitative+RT-PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method.</a> J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Sinds de jaren 2000, heeft real-time PCR werd vervangen gouden standaard technieken (celkweek en bacteriën cultuur methoden) in een toenemend aantal laboratoria. Uitvoering van de techniek is relatief eenvoudig. Echter validatie van laboratoriummethoden is essentieel voor moleculaire detectie en kwantificering van ziekteverwekkers voor nauwkeurige, reproduceerbare en betrouwbare gegevens. Aangezien de extractiestap is de belangrijkste bron van verlies van een biologisch materiaal, kan worden beschouwd als de belangrijkste bron van onjuiste kwantificatie tussen één protocol en andere. Als zodanig is het creëren van een standaardcurve van plasmide DNA in qRT-PCR, vooral in de literatuur, geeft het virale genoom load maar geen rekening met de extractiestap. Beschrijving van een de novo strategie voor een hele werkwijze validatieproces in de AFNOR norm NF U47-600-2 betekent een aanzienlijke vooruitgang op dit gebied. Zoals weergegeven indit papier voor EHV-2 bij paarden, of anderen in bijen 21, verstrekking van duidelijke onderscheid tussen de ontwikkelingsstap en validatiestap met karakterisering van de PCR en karakterisering van de gehele werkwijze. Een beperking in dit interessante aanpak is dat elke verandering in het protocol zal resulteren in de verplichting om het volledige proces dat zeer kostbaar kunnen zijn opnieuw te valideren. Deze beperking is ook uit het feit dat de grenzen voor kwantificering afhankelijk van de bron waaruit het virus geëxtraheerd (bijvoorbeeld respiratoire vloeistoffen, organen, bloed of urine). In feite is elke matrix geeft verschillende specificiteiten in hun fysico-chemische eigenschappen en het is belangrijk om zelfstandig definiëren elke verschillende matrijs voor virale detectie en kwantificering door qRT-PCR. Aldus kan het virale genoom hoeveelheid van elk biologisch monster nauwkeuriger bij de winning worden gekwantificeerd. De kwalificatie wordt ook rekening gehouden met de thermocycler model en wanneer het gebruik van een reeds goed gekarakteriseerde methode (bijvoorbeeld de EHV-2 qPCR methode beschreven in dit document) vereist een nieuw type machine in de bovenliggende laboratorium of een ander laboratorium, moet men de prestaties van dat instrument bevestigen. De bevestiging van de prestaties van een qPCR assay is een voorwaarde voor alle tests te brengen in een laboratorium. Dit wordt normaliter bereikt door het analyseren van een monster met bekende eigenschappen. Een dergelijke controle is een voorwaarde en beschouwd verplicht op verzoek van de NF 47-600-1 AFNOR norm met het oog op de uitvoering van de qPCR (LOD, LOQ efficiency) en de robuustheid van de hele methode (LOD, LOQ) te valideren. Niet alleen tijdens de ontwikkeling en karakterisering stappen, maar ook bij gebruik in onderzoek of voor diagnostische doeleinden, kunnen de risicofactoren worden geïdentificeerd en goed gecontroleerd om standaardisatie van het protocol te waarborgen. Van bijzonder belang is een adequate opleiding van het personeel, hooggekwalificeerd personeel, de kwaliteitscontrole van de verbruiksgoederengebruikt en de opslag, de controle van de directe omgevingscondities en bewustzijn metrologische omstandigheden die de uitvoering van de wetenschappelijke instrumenten die bij de assay kunnen beïnvloeden. Gebruik van referentiemonsters voor vergelijkingen tussen laboratoria kan ook helpen bij de controle van de onzekerheden. Op deze wijze kan vergelijking van gegevens tussen laboratoria worden vergemakkelijkt. Inderdaad, tussen laboratoria ringonderzoeken zijn essentieel om te evalueren en te bevestigen de reproduceerbaarheid van de methode. Virale genoom belasting resultaten worden uitgedrukt in internationale eenheden (IE) van de geanalyseerde biologische matrix (IU: kopieën / ml voor fluïda of kopieën / g weefsel) zijn gemakkelijker te gebruiken om de resultaten te vergelijken tussen verschillende laboratoria. Alle resultaten boven de LOQ worden uitgedrukt kopieën / ml en gevolg tussen de LOD en LOQ wordt genomen als een niet-kwantificeerbare positief resultaat. Presentatie kwantificationele gegevens van het genoom op deze wijze voldoet nauwkeuriger het process analyses (amplificatie van het genoom). In feite, in celcultuur experimenten expressie van de virale belasting met TCID50 (mediane weefselkweek infectieuze dosis) afhankelijk van de aard van de cellen en virusstammen. Elke stam lijn bezit zijn unieke infectie kinetiek en een aantal virussen zoals EHV-2 kan enkele dagen duren voordat de eerste cytopathogeen effect is duidelijk. Tot slot moet deze nieuwe methode van karakterisering van qRT-PCR de harmonisatie van de presentatie van gegevens en interpretatie tussen laboratoria te vergemakkelijken. Dit zal zeer nuttig zijn voor potentiële toepassingen van qRT-PCR in de toekomst als de instelling van een drempelwaarde voor verklaring van de ziektestatus plaats van alleen de aanwezigheid of afwezigheid van het pathogeen.

Paardachtige herpesvirus-2 (EHV-2) is betrokken bij een respiratoir syndroom, met potentiële klinische manifestaties zoals loopneus, faryngitis en gezwollen lymfeknopen 1-3. Dit virus wordt ook vermoed wordt geassocieerd met slechte prestaties paarden, wat kan leiden tot een significante en negatieve economische gevolgen voor de paardenindustrie 2. Tot nu toe de gouden standaard voor gamma-EHV (γ-EHV) detectie was celkweekwerkwijze. De eerste ongemak van deze procedure was het ontbreken van discriminatie tussen EHV-2 en andere γ-EHV&#39;s (bijvoorbeeld EHV-5). De tweede ongemak was de trage ontwikkeling van het cytopathische proces, dat duurt 12-28 dagen te manifesteren 4,5. Ontwikkeling van een gevalideerd en genormaliseerd kwantitatieve Real-time PCR (qRT-PCR) methode helpt om snel detecteren virus, onderscheid maken tussen EHV-2 en EHV-5 en de relatie tussen het virale genoom belasting en de ziekte door de kwantificering aspect bestuderen. Polymerase kettingreactie (PCR) werd beschreven voor het eerst in 1986 door Mullis 6 en gaat de nieuwe gouden standaard in de meeste gebieden van biologische diagnose (mens, milieu en dier) worden. Deze methode, die is gebaseerd op de amplificatie van een deel van het genoom van pathogenen, biedt vele voordelen: specificiteit, gevoeligheid en snelheid. Bovendien is het risico op besmetting amplicon verdween sinds de komst van qRT-PCR en kwaliteitsborging 7. Toch is de erkenning van PCR als een nieuwe gouden standaard methode noodzakelijk meer dan alleen betere prestaties gegevens, maar ook de demonstratie van de controle van de ontwikkeling en validatie stappen van de gehele methode zonder verslechtering van de prestaties in de tijd. De eerste moleculaire instrumenten die worden gebruikt voor de detectie van EHV-2 waren tijd consuming en betrokken niet-specifieke amplificatie met geneste PCR, gevolgd door sequentiebepaling 8. De beoogde genen voor herpesvirussen waren desoxyribonucleïnezuur (DNA) polymerase en DNA verpakking 9. Echter, geneste PCR vormt een groot risico op besmetting door amplicons. Sindsdien zijn conventionele PCR proeven ontworpen om de interleukine 10-achtig gen of glycoproteïne-gen, herzien in 2009 2 amplificeren. Recenter werden real-time PCR beschreven kenmerken voor de kwantificering van EHV-2 10 maar geen gegevens meegedeeld betreffende de waarmerking van de gehele werkwijze de extractiewerkwijze. In dit protocol wordt de ontwikkeling en validatie procedures beschreven voor een kwantitatieve PCR-methode voor de detectie en kwantificering van EHV-2 DNA in equine luchtwegen vloeistoffen volgens de Association française de normalisatie (AFNOR) norm NF U47-600 3,11,12, die de Franse vertegenwoordigerde internationale normalisatie commissie. Deze norm beschrijft de &quot;Eisen en aanbevelingen voor de implementatie, ontwikkeling en validatie van de veterinaire PCR in diergezondheid analysemethode&quot; 11,12, volgens de NF EN ISO / IEC 17025, 2005 13 en OIE (World Organisation for Animal Health) . aanbevelingen, 2010 14 het EHV-2 qRT-PCR valideringsprotocol omvat een driedelig procedure: (a) de ontwikkeling van de qRT-PCR assay, (b) karakterisering van qRT-PCR staan ​​(c) karakterisering van het gehele analysemethode (van extractie van nucleïnezuren uit het biologische monster aan PCR-analyse). De karakterisering van de qRT-PCR-test en van de gehele analysemethode onder meer de definitie van twee limieten: de detectiegrens (LOD) en de bepaalbaarheidsgrens (LOQ). De LOD 95% PCR vertegenwoordigt het laagste aantal nucleïnezuur kopieën per volume-eenheid die in 95% van alle cas kan worden gedetecteerdes. De LOQ 95% PCR vertegenwoordigt het laagste hoeveelheid nucleïnezuur kopieën dat kan worden bepaald met inachtneming van de onzekerheden. Dit qRT-PCR methode maakt de nauwkeurige detectie en snelle kwantificering van EHV-2 respiratoire vloeistoffen. Voorts kan de werkwijze in andere laboratoria worden toegepast op een standaardprocedure en als algemene model voor de ontwikkeling van andere nieuwe qRT-PCR assays waarborgen.

<table><tbody><tr><td>AB-1900 natural color ABgene 96 well plate&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive film qPCR Absolute&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16629</td><td>Kleeffolie gebruikt voor het afdichten van de plaat voor de qRT-PCR-run</td></tr><tr><td>0.5 ml microtubes, skirted, caps</td><td>Dutsher</td><td>039258</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 98%</td><td>Sodipro</td><td>SAF322941000</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Eurofins</td><td>Op bestelling</td><td></td></tr><tr><td>Probe</td><td>Life Technologies</td><td>Op bestelling</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid</td><td>Eurofins</td><td>Op bestelling</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp&nbsp; RNA viral Mini Kit (bevattend: QIAamp Mini kolom, AVL&nbsp; buffer,&nbsp; AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collectiebuizen)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>AVL buffer: 5 min voorverwarmen bij 72 &deg;C</td></tr><tr><td>Sequencing by Sanger method</td><td>Eurofins</td><td>Op bestelling</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4364340</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA buffer oplossing</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296653A</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td><td>Thermoscientific</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR systemen</td><td>Life Technologies</td><td>4376600</td><td>voorverwarmen 15 min&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve pcr-methode voor equid herpesvirus-2 diagnostics in respiratory fluids

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Het protocol beschrijft een kwantitatieve RT-PCR-methode voor de detectie en kwantificering van EHV-2 in ademhalingsvloeistoffen van paarden volgens de NF U47-600-norm. Na de ontwikkeling en eerste validatiestap, werden twee verschillende karakteriseringsstappen uitgevoerd volgens de AFNOR-norm: (a) karakterisering van de qRT-PCR-test alleen en (b) karakterisering van de volledige analytische methode. De validatie van de volledige analytische methode omvatte de weergave van alle stappen tussen de extractie van nucleïnezuren en de uiteindelijke PCR-analyse.
Validatie van de hele methode is erg belangrijk voor virusdetectie door qRT-PCR om een nauwkeurige bepaling van de virale genoomlading te krijgen. Omdat de extractiestap de primaire bron is van verlies van biologisch materiaal, kan deze worden beschouwd als de belangrijkste bron van fout bij kwantificering tussen het ene protocol en het andere. Om deze reden beveelt de AFNOR-norm NF-U-47-600 aan om het bereik van plasmide-dilutie voor de extractiestap op te nemen. Bovendien zijn de kwantificeringslimieten afhankelijk van de bron waaruit het virus wordt geëxtraheerd. Resultaten van virale genoomlading, uitgedrukt in internationale eenheden (IE), zijn gemakkelijker te gebruiken om resultaten tussen verschillende laboratoria te vergelijken.
Deze nieuwe methode van karakterisering van qRT-PCR zou de harmonisatie van gegevenspresentatie en -interpretatie tussen laboratoria moeten vergemakkelijken.

De kwantitatieve RT-PCR-werkwijze, zoals hierboven beschreven, werd toegepast voor het detecteren en kwantificeren paardachtige herpesvirus-2 respiratoire vloeistoffen. Figuur 1 illustreert een schematische workflow grafiek voor de ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve RT-PCR werkwijze volgens de AFNOR-norm NF U47-600. Specificiteit van de primers en probes gevalideerd gedurende de stap-voor-stap ontwikkeling van de PCR. Slechts EHV-2 stammen werden geamplificeerd in dit systeem. Vervolgens werd de prestatie van de qRT-PCR moesten worden gekarakteriseerd. Ten eerste de LOD PCR, een schatting 6 tienvoudige seriële verdunning werd uitgevoerd om de vermindering zone (figuur 2) vast. In dit voorbeeld werden 6 tienvoudige seriële verdunningen tussen 10 en 10 -5 -10 (tussen 26.000 en 0,26 kopieën / 2,5 gl monster) aan de LOD PCR schatten. Het abattement zone lies tussen verdunningen van 10 -9 tot 10 -10 (tussen 2,6 en 0,26 kopieën / 2,5 ul monster). De LOD PCR waarde in dit geval bepalen werden 6 tweevoudige seriële verdunningen van het plasmide in de bestrijding zone tussen 5,2 en 0,16 kopieën / 2,5 gl monster. De LOD PCR waarde was 2,6 kopieën / 2,5 pl monster. De lineariteit bereik en LOQ PCR te bepalen werd de LOD PCR waarde gebruikt om het bereik van 6 tienvoudige seriële verdunningen starten tussen 2,6 (LOD PCR) en 260.000 kopieën / 2,5 gl monster. Figuur 3 illustreert een lineaire regressie voor EHV2 qRT-PCR van de ene proef. De prestaties van lineaire regressie (figuur 4) zijn bevestigd in viervoud volgens de in tabel 3 beschreven berekeningen. De berekeningen worden uitgevoerd om de lineariteit te definiëren volgens de criteria absolute Bias i value ≤0.25 log 10, ongeacht het niveau i van plasmide belasting. In dit geval, het bereik van de lineariteit lag tussen 2,6 en 260.000 kopieën / 2,5 pl monster. De LOQ PCR is de laagste concentratie van het lineaire bereik (dat wil zeggen, 2,6 kopieën / 2,5 gl monster in dit geval). U LIN werd bepaald 0,12 log 10 in het traject 2.6-260,000 kopieën / 2,5 pl DNA. Na ontwikkeling (figuur 1, blauw) en karakterisering van de qRT-PCR (Figuur 1, geel), de AFNOR NF U47-600 norm beveelt karakterisering van de gehele analysemethode van DNA-extractie tot qRT-PCR (Figuur 1, oranje). De diagnostische gevoeligheid en specificiteit werden berekend zoals beschreven in Tabel 4. De kwantitatieve prestaties van de qRT-PCR geheel analysemethode geëvalueerd en gevalideerd met een nauwkeurigheid profiel ( <strong&gt; Figuur 5). Dit protocol, dat gebruikt state-of-the-art moleculaire technologie, konden we detecteren en kwantificeren van de EHV-2 virale genoom lading in 172 neusuitstrijk verkregen uit paarden met ademhalingsproblemen en / of klinisch vermoeden van infectie. De incidentie van EHV-2 uit veld (biologische) monsters was 50% (86/172) in deze populatie. De kwantitatieve analyses toonden dat virale genoom veel EHV-2 waren significant hoger bij jonge paarden en de verdeling van virale genoom lading af met de leeftijd (figuur 6). In deze studie, de hoogste EHV-2 virale genoom load (1,9 x 10 11 kopieën / ml) werd gedetecteerd in veulens (figuur 6). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig1.jpg" /> Figuur 1: Workflow grafiek voor de ontwikkeling (blauw), de karakterisering van de kwantitatieve RT-PCR(geel) en de karakterisering van de gehele analysemethode van DNA-extractie tot qRT-PCR (oranje) volgens de norm AFNOR NF U47-600-2. De workflow diagram hervat de verschillende stappen voor de ontwikkeling, de karakterisering van de kwantitatieve RT -PCR en de karakterisering van de gehele analysemethode van DNA-extractie tot qRT-PCR. Voor elke stap, de workflow grafiek geeft het aantal benodigde runs, verdunningen te voeren en het aantal benodigde analisten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 2" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig2.jpg" /> Figuur 2: Bepaling van de vermindering zone met representatieve resultaten van real-time PCR curves verkregen met 6 tienvoudige seriële verdunningen van plasmide. Om de bestrijding zone te schatten, 6 tienvoudige seriëleverdunningen worden uitgevoerd tussen 10 -5 (26.000 kopieën / 2,5 gl monster) en 10 -10 (0,26 exemplaren / 2,5 gl monster). Het abattement zone ligt tussen verdunningen van 10 -9 (2,6 kopieën / 2,5 ul monster) en 10 -10 (0,26 kopieën / 2,5 ul monster). In dit geval, 6 twee-voudige seriële verdunningen van plasmide werden gemaakt in deze vermindering zone aan de LOD 95% PCR te bepalen, tussen 5,2 en 0,16 kopieën / 2,5 pl monster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig3.jpg" /> Figuur 3:. Lineaire regressie EHV2 qRT-PCR De lineariteit van kwantitatieve testen is het vermogen om resultaten die evenredig is met de concentratie van het doelwit aanwezig is in een bepaald bereik te genereren. Dit kan worden gemodelleerd doorlineaire regressie (y = ax + b) tussen de instrumentele respons (cyclus drempel of Ct) en de logaritme van de hoeveelheid van het doel (aantal doel kopieën / 2,5 ul monster). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig4.jpg" /> Figuur 4:. Uitvoering van lineaire regressie van EHV-2 qPCR gemiddelde voorspanning geven het gemiddelde verschil tussen de gemeten hoeveelheid plasmide ( <img alt="fig4-1" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-1.jpg" /> ) En de theoretische plasmide hoeveelheid (x &#39;i) voor elk plasmide niveau. Verticale balken geven de lineariteit onzekerheid (U Lini) gegeven door de formule <img alt="fig4-2" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-2.jpg" /> waarbij SD&#39;i is de standaarddeviatie o<html> f gemeten plasmide hoeveelheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig5.jpg" /> Figuur 5:. Accuracy profielen op basis van de validatie resultaten van het EHV-2 qRT-PCR-methode De groene lijn (cirkels) vertegenwoordigt de juistheid van de gegevens (systematische fout of bias). De aanvaardbaarheid grenzen worden bepaald op ± 0,75 Log 10 door het laboratorium (stippellijnen). De onderste en bovenste nauwkeurigheid limieten werden bepaald voor elk plasmide belasting niveau van de gemiddelde vertekening ± tweemaal de standaarddeviatie van de betrouwbaarheid van de gegevens (rode lijnen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 1 &quot;&gt; <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig6.jpg" /> Figuur 6:. Kwantificering van de virale genoom veel EHV-2 naar leeftijd Het virale genoom lastverdeling EHV-2 gedetecteerd in neusuitstrijk monsters vertegenwoordigen bij verschillende leeftijdsgroepen. De horizontale lijnen geven de gemiddelde waarden voor de standaarddeviatie (m = maanden). * Significant verschillend van ANOVA met Newman-Keuls post-hoc-test (p &lt;0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> target-gen </td><td colspan="3"> Primers, probe en plasmide sequenties (5&#39;-3 &#39;) </td><td> nucleotidepositie </td><td> Grootte van het product (nucleotiden) </td><td colspan="2"><strong&gt; Thermische fietsen voorwaarden </td><td> Referenties </td></tr><tr><td rowspan="4"> EHV2 gB (HQ247755.1) </td><td colspan="3"> Forward: GTGGCCAGCGGGGTGTTC </td><td> 2113-2130 </td><td rowspan="4"> 78 </td><td> 95 ° C 5 min </td><td></td><td rowspan="4"> 11 </td></tr><tr><td colspan="3"> Keerzijde: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA </td><td> 2189-2170 </td><td> 95 ° C 15 sec </td><td rowspan="2"> 45 cycli </td></tr><tr><td colspan="3"> Probe: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB </td><td> 2132-2157 </td><td> 60 ° C 1 min </td></tr><tr><td colspan="3"> Plasmid: ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG </td><td> 2081-2381 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1:. Sequenties van primers, probes en positieve synthetische DNA-controles die in dit protocol De sequentie van plasmide (positieve synthetisch DNA) komt overeen met posities nucleotide 2081-2381 van EHV2gB sequentie (HQ247755.1). Het ontwerp van primers en probes die in dit protocol werd verkregen door specifieke software. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> ZIEKTEVERWEKKERS </td><td rowspan="2"> Referentie (oorsprong) </td><td rowspan="2"> Aantal stammen </td><td> RESULTATEN </td></tr><tr><td> EHV-2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-2 </td><td> VR701 (ATCC) </td><td rowoverspanning = &quot;2&quot;&gt; 20 </td><td rowspan="2"> Positief </td></tr><tr><td> 20 monsters (FDL collectie) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-5 </td><td> KD05 (DK) </td><td rowspan="2"> 20 </td><td rowspan="2"> Negatief </td></tr><tr><td> 20 monsters (FDL collectie) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-3 </td><td> VR352 (ATCC) </td><td rowspan="2"> 2 </td><td rowspan="2"> Negatief </td></tr><tr><td> T934 WSV (DK) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-1 </td><td> Kentucky stam Ky A (ATCC) </td><td rowspan="2"> 3 </td><td rowspan="2"> Negatief </td></tr><tr><td> 2 monsters (FDL collectie) </td></tr><tr><td> EHV-4 </td><td> VR2230 (ATCC) </td><td> 1 </td><td> Negatief </td></tr><tr><td> Stompzinnige herpesvirus AHV5 </td><td> FDL Collection </td><td> 1 </td><td> Negatief </td></tr><tr><td rowspan="2"> Paardeninfluenza Virus </td><td> A / equine / Jouars / 4/2006 (H3N8) </td><td rowspan="2"> 1 </td><td rowspan="2"> Negatief </td></tr><tr><td> (Accession Number JX091752) </td></tr><tr><td> Equine Arteritis Virus </td><td> VR796 (ATCC) </td><td> 2 </td><td> Negatief </td></tr><tr><td> Rhodococcus equi </td><td> FDL Collection </td><td> 1 </td><td> Negatief </td></tr><tr><td> Streptococcus equi subsp. zooepidemicus </td><td> FDL Collection </td><td> 1 </td><td> Negatief </td></tr><tr><td> Streptococcus equi subsp. equi </td><td> FDL Collection </td><td> 1 </td><td> Negatief </td></tr><tr><td> Coxiella burnetii </td><td> ADI-142-100 (Adiagene) </td><td> 1 </td><td> Negatief </td></tr><tr><td> Chlamydophila abortus </td><td> ADI-211-50 (Adiagene) </td><td> 1 </td><td> Negatief </td></tr><tr><td> Klebsiella pneumoniae </td><td> FDL Collection </td><td> 1 </td><td> Negatief </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Analytische specificiteit van qRT-PCR voor EHV-2. <img alt="tabel 3" src="/files/ftp_upload/53672/53672table3.jpg" /> Tabel 3: Berekening van de vooringenomenheid en lineariteit onzekerheid (overgenomen van NF U47-600-2 12). Voor elke proef, de prestaties van lineaire regressie (y = ax + b) worden gevalideerd met de tafel waarbij y de cyclus drempelwaarde gelijk, a is verkregen de helling,. X het plasmide niveau en b het snijpunt i het plasmide level (i varieert van 1 tot k levels), k het aantal plasmide niveaus gebruikt (bijvoorbeeld k = 6 in tzijn tafel), j het ​​proces (j varieert van 1 tot I studies), I het aantal pogingen, die ligt tussen 3 en 6 onderzoeken (bijvoorbeeld I = 4 in deze tabel) x i de geschatte plasmide hoeveelheid van elk. i plasmide-niveau. x &#39;i is de theoretische hoeveelheid plasmide verkregen met vergelijking x&#39; i = log 10 (x i) voor elke i plasmide niveau. Tijdens elke proef j, de cyclus drempelwaarde gelijk voor elke i plasmide level wordt berekend met de lineaire regressie y i, j = een j x i, j + b j. <img alt="table3-1" src="/files/ftp_upload/53672/table3-1.jpg" /> is de gemeten hoeveelheid plasmide tijdens het proces j. Bias i </<html> sub&gt; is het verschil waargenomen tussen de gemeten hoeveelheid plasmide en de theoretische plasmide hoeveelheid voor elke proef en elk plasmide niveau. <img alt="table3-2" src="/files/ftp_upload/53672/table3-2.jpg" /> de gemiddelde waarde van <img alt="table3-3" src="/files/ftp_upload/53672/table3-3.jpg" /> door elke i plasmide niveau; SD &#39;i is de standaarddeviatie van de gemeten hoeveelheid <img alt="table3-4" src="/files/ftp_upload/53672/table3-4.jpg" /> voor elke i plasmide niveau Mean vertekening is het gemiddelde van Bias i; U Lini is de lineariteit onzekerheid die voor elke i plasmide niveau berekend op basis van SD&#39;i en betekenen vooringenomenheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672table3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 1 &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;fo: keep-met-next.within-page =&quot; always &quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> Real-status van het monster </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Positief </td><td> Negatief </td></tr><tr><td rowspan="3"> Resultaten verkregen met gehele werkwijze </td><td> Positief </td><td> RP (echte positief) </td><td> FP (vals positief) </td></tr><tr><td> Negatief </td><td> FN (vals negatief) </td><td> RN (echte negatieve) </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> RP + FN </td><td> FP + RN </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Se = RP / (RP + FN) </td><td> Sp = RN / (RN + FP) </td></tr></tbody></table> Tabel 4:. Berekening van diagnostische gevoeligheid (Se) en specificiteit (Sp) van de gehele werkwijze A Schwartz tabel werd gebruikt voor de berekening confidlingen interval 95% gevoeligheid en specificiteit van de gehele werkwijze zoals beschreven in NF U47-600-2.

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode die wordt gebruikt voor de detectie en kwantificering van EHV-2 DNA in ademhalingsvloeistoffen van paarden. Het validatieprotocol voor EHV-2 qRT-PCR omvat een drieledige procedure: ontwikkeling, karakterisering van de qRT-PCR-test alleen en karakterisering van de volledige analytische methode.

Ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode voor equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Het algemene doel van de qPCR-methode is het evalueren van de virale load van equine herpesvirus-2 in biologische monsters van paarden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van diagnostiek van luchtwegaandoeningen bij paarden en het leveren van kwantitatieve gegevens voor nieuwe interpretatiehulpmiddelen voor praktijkbeoefenaars. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een sensitieve, specifieke en snelle methode is.Een ander voordeel is de ontwikkeling volgens de AFNOR-norm NF U47-600, waarbij AFNOR de Franse vertegenwoordiger is in het internationale normalisatiecomité. De procedure wordt gedemonstreerd door Erika Hue, een jonge onderzoeker uit mijn unit. Om nucleïnezuren uit een biologisch monster van respiratoire vloeistoffen te extraheren, begint u onder een zuurkast met het toevoegen van 140 µL biologisch monster aan 560 µL lyssolution en incubeert u dit gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Voeg 560 µL ethanol toe aan het monster, breng 630 µL van de totale oplossing aan op een silicacolom en centrifugeer. Breng de resterende 630 µL aan op de silicacolom en centrifugeer opnieuw. Nadat het monster op de kolom is aangebracht, wordt de kolom twee keer gewassen met telkens 500 µL van de wasbuffers AW1 en AW2.Voeg vervolgens 50 µL elutiebuffer of AVE-buffer op kamertemperatuur toe om de nucleïnezuren uit de kolom te elueren. Sluit de dop en incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer daarna één minuut bij 6.000 ×g.Om het DNA te amplificeren, bereidt u na het titreren van de primers en de probe volgens het tekstprotocol 22,5 µL reactiemengsel voor per reactie door 12,5 µL PCR-mastermix, 20 µM forward- en reverse-primers, 10 µM van de probe en voldoende ultrapuur water toe te voegen om een totaalvolume van 22,5 µL te bereiken. Bereid het PCR-reactiemengsel altijd in een specifieke zone om contaminatie te voorkomen. Pipetteer 22,5 µL van het betreffende reactiemengsel in elke reactieput van een 96-wells plaat.Voeg negatieve controles toe voor de extractie en PCR om er zeker van te zijn dat geen van de reagentia besmet is met ongewenst DNA. Voeg vervolgens 2,5 µL van het monster, de negatieve extractiecontrole, de negatieve PCR-controle of het positieve controlemonster toe aan de overeenkomstige reactieputjes. Gebruik daarna een adhesieve plaatafdichting om de plaat af te sluiten.Centrifuge vervolgens bij 6.000 gs gedurende 10 seconden. Plaats de plaat in een real-time PCR-systeem. Selecteer vervolgens het sjabloon voor de indeling van de assay en de PCR-programma-instellingen zoals hier getoond, en start de run.Nadat de ruwe gegevens van het real-time PCR-systeem naar een spreadsheet zijn overgezet, stelt u de drempelwaarde in de amplificatieplots in boven de basislijn en binnen het gebied van exponentiële groei om de drempelcyclus voor elk monster te bepalen. Zet elke set standaardpunten uit als een standaardcurve om de lineariteit vast te stellen. Bereken vervolgens het kopie-aantal voor de verschillende monsters op basis van de standaardcurve.Om de detectielimiet van de qRT-PCR-resultaten te bepalen, worden 90 µL ultrapuur water in zes buisjes gedoseerd. Om zes tienvoudige seriële verdunningen van het plasmide te maken om de afnamezone te targeten, wordt gestart met het overbrengen van 10 µL van de plasmide-werkverdunning naar het buisje met 90 µL ultrapuur water. Het buisje wordt kortstondig gevortext en gecentrifugeerd.Breng vervolgens 10 µL van de buis over naar de volgende buis met water. Herhaal de overdracht na vortexen en centrifugeren totdat alle buizen met water het plasmide hebben ontvangen. Bepaal, nadat het DNA in de zes tienvoudige seriële verdunningen is geamplificeerd zoals eerder in deze video beschreven, de afnamezone, wat de laatste verdunning van het plasmide is die een positief signaal geeft en de eerste verdunning zonder detectie.Om zes tweevoudige seriële verdunningen voor te bereiden, verdeelt u 25 µL ultrapuur water over zes buisjes. Neem de laatste verdunning van het plasmide die een positief signaal gaf bij de tienvoudige verdunningen en breng 25 µL vanuit dit buisje over naar het eerste buisje met water. Vortex en centrifugeer voordat u de overige vijf verdunningen voorbereidt zoals zojuist gedemonstreerd.Amplificeer het DNA uit de tweevoudige seriële verdunningen zoals eerder in deze video beschreven. Bereken na het amplificeren van het DNA uit de drie onafhankelijke proeven het aantal positieve replica's van de 24 replica's voor elk niveau van plasmidconcentratie. Bepaal de LOD met een betrouwbaarheid van 95 procent of LOD 95 procent PCR, wat het niveau is dat resulteert in de detectie van 23 positieve replica's van de 24 replica's.Om de LOD van de methode te bepalen, worden vijf tweevoudige seriële verdunningen gemaakt, beginnend met 25 µL van de werkverdunning van het plasmide. Deze werkverdunning is vier keer zo geconcentreerd als de laatste concentratie van een tienvoudige verdunning die een positief signaal gaf. Het plasmide dat in de amplificatiestap wordt gebruikt, is afkomstig van een plasmide-werkverdunning die in een specifiek gebied is bereid om contaminatie te voorkomen. Dit is een kritische stap.Breng 5 µL van elke verdunning van het plasmide over naar vier buisjes met 135 µL van het negatieve bronmateriaal om vier replica's van de vijf positieve standaarden te verkrijgen. Voer de extractie uit voor de vier replica's van de vijf positieve standaarden en voer de amplificatieprocedure uit zoals eerder in deze video beschreven. Tel het aantal positieve replica's van de acht replica's voor elk niveau van de plasmideconcentratie.Bepaal ten slotte de LOD-methode, wat het laatste niveau is waarbij acht van de acht herhalingen positief zijn. De in deze video beschreven kwantitatieve RT-PCR-methode detecteert en kwantificeert equid herpesvirus-2 in respiratoire vloeistoffen. In dit experiment werden tienvoudige seriële verdunningen gemaakt om de afnamezone te schatten, welke ligt tussen de verdunningen 10⁻⁹ en 10⁻¹⁰.De LOD PCR-waarde werd bepaald met een nieuwe tweevoudige seriële verdunning in de afnamezone. Om het lineariteitsbereik en de LOQ PCR te bepalen, werd de LOD PCR-waarde gebruikt als startpunt voor een reeks van zes tienvoudige seriële verdunningen tussen 2,6, de LOD PCR-waarde, en 260.000 kopieën per 2.5 µL monster. De LOQ PCR is de laagste concentratie binnen het lineariteitsbereik.De karakterisering van de volledige methode is de validatie van alle stappen die nodig zijn om qRT-PCR-gegevens te verkrijgen, vanaf de extractie van DNA uit het respiratoire monster tot aan de amplificatie en kwantificatie van het target. De kwantitatieve prestaties van de volledige analytische qRT-PCR-methode werden geëvalueerd en gevalideerd met een nauwkeurigheidsprofiel dat in deze grafiek wordt weergegeven. De virale genoomlasten van EHV2 in 172 neusswabmonsters van paarden met respiratoire aandoeningen werden gekwantificeerd zoals hier getoond.De virale genoomhoeveelheden waren hoger bij jonge paarden, waarbij de hoogste hoeveelheid werd vastgesteld op 1,9 × 10¹¹ kopieën per milliliter. Eenmaal beheerst kan deze techniek in minder dan twee uur per amplificatiestap worden uitgevoerd, en het totaal van de validatiestappen kan in minder dan vier weken worden voltooid mits dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het risico op contaminatie moet worden vermeden, met name bij het werken met een plasmidenoplossing.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals sequenering, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals genoomidentificatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de extractie en amplificatie van DNA uitvoert en hoe u hun PCR-reserves karakteriseert. Vergeet niet dat het werken met biologische monsters zoals pathogenen uiterst gevaarlijk kan zijn.Bij het uitvoeren van deze procedure moeten altijd bepaalde voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het werken in een zuurkast en in een gebied met een aangepast veiligheidsniveau.

development-validation-quantitative-pcr-method-for-equid-herpesvirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De studie beschrijft een kosteneffectieve methode voor de identificatie van de bron van fecale / urine besmetting of verontreiniging door nitraten in het water met behulp van qPCR voor de specifieke kwantificering van de mens / varkens / rund DNA-virussen, adenovirussen en polyomavirussen, voorgesteld als MST tools.

Kosteneffectieve methode voor Microbiële Source Tracking Met behulp van specifieke menselijke en dierlijke virussen

Deze studie beschrijft diagnose van aviaire influenza bij wilde vogels met behulp van een draagbare RRT-PCR-systeem. De methode maakt gebruik van gevriesdroogde reagentia om het scherm wilde vogels in een niet-laboratorium setting, typisch voor een uitbraak scenario. Het gebruik van moleculaire technieken biedt nauwkeurige en gevoelige alternatieven voor een snelle diagnose.

Een snelle diagnose van aviaire influenza virus bij wilde vogels: Het gebruik van een Portable RRT-PCR en gevriesdroogd reagentia in het veld

This video demonstrates a quantitative method for detecting viral infection using real-time reverse transcription PCR. The reverse transcription step converts the RNA to cDNA, which is then amplified via PCR cycles. The presence of viral RNA in the sample is confirmed by analyzing the amplification and dissociation curves of DNA obtained from the PCR.

Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR for Diagnosing Viral Infections

De afgelopen 15 jaar hebben honden-adenovirus type 2 (CAV2)-afgeleide vectoren hun efficiëntie bewezen om cellen in vitro en in vivo te transduceren en worden ze veel gebruikt voor vaccinatie en gentherapie. Hier beschrijven we een procedure om CAV2-vectoren te construeren, produceren en zuiveren, wat leidt tot virale suspensies met een hoog titer.

Productie en zuivering van niet-Replicatieve Canine adenovirus type 2 afgeleide vectoren

High-throughput testen van DNA en RNA gebaseerde pathogenen op nanoschaal PCR wordt omschreven met een syndromale honden en paarden luchtwegen PCR panel.

High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR

Deze studie beschrijft een hoog debiet, imaging gebaseerde micro-neutralisatie test om te bepalen van de titer van neutraliserende antilichamen specifiek voor respiratoir syncytieel virus (RSV). Deze bepaling-indeling is getest op verschillende monster typen.

Een verbeterde en hoge doorvoer respiratoir syncytieel Virus (RSV) Micro-neutralisatie Assay

Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

Een pan-Lyssavirus geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie is ontwikkeld om specifiek te detecteren alle bekende lyssaviruses. Validatie met behulp van rabiës hersenen monsters van verschillende diersoorten bleek dat deze methode een gevoeligheid en specificiteit gelijkwaardig is aan de gouden standaard fluorescerende antilichaam test en kan worden gebruikt voor routine hondsdolheid diagnose heeft.

Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses

We presenteren een compleet protocol voor postmortem diagnose van dierlijke hondsdolheid onder veldomstandigheden met behulp van een snelle immunochromatografische diagnostische test (RIDT), van hersenbiopsie bemonstering tot uiteindelijke interpretatie. We beschrijven ook verdere toepassingen met behulp van het apparaat voor moleculaire analyse en virale genotypering.

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromagrafische Diagnostische Test voor Resource-Limited Settings met verdere moleculaire toepassingen

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en validatie van goede laboratoriumpraktijken in de conforme detectie van adeno-geassocieerde virale vectoren in menselijke tranen door druppel digitale polymerasekettingreactie ter ondersteuning van de klinische ontwikkeling van gentherapievectoren.

Een valideerbare druppel digitale polymerasekettingreactietest voor de detectie van adeno-geassocieerde virale vectoren in biosheddingstudies van tranen

Leer een gevalideerde qPCR-methode voor het detecteren en kwantificeren van equid herpesvirus-2 in ademhalingsvloeistoffen van paarden. Deze techniek biedt gevoelige, specifieke en snelle diagnostische resultaten voor dierenartsen.

Ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode voor equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Meer video's verkennen