Ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode voor equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Het algemene doel van de qPCR-methode is het evalueren van de virale load van equine herpesvirus-2 in biologische monsters van paarden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van diagnostiek van luchtwegaandoeningen bij paarden en het leveren van kwantitatieve gegevens voor nieuwe interpretatiehulpmiddelen voor praktijkbeoefenaars. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een sensitieve, specifieke en snelle methode is.

Een ander voordeel is de ontwikkeling volgens de AFNOR-norm NF U47-600, waarbij AFNOR de Franse vertegenwoordiger is in het internationale normalisatiecomité. De procedure wordt gedemonstreerd door Erika Hue, een jonge onderzoeker uit mijn unit. Om nucleïnezuren uit een biologisch monster van respiratoire vloeistoffen te extraheren, begint u onder een zuurkast met het toevoegen van 140 µL biologisch monster aan 560 µL lyssolution en incubeert u dit gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg 560 µL ethanol toe aan het monster, breng 630 µL van de totale oplossing aan op een silicacolom en centrifugeer. Breng de resterende 630 µL aan op de silicacolom en centrifugeer opnieuw. Nadat het monster op de kolom is aangebracht, wordt de kolom twee keer gewassen met telkens 500 µL van de wasbuffers AW1 en AW2.

Voeg vervolgens 50 µL elutiebuffer of AVE-buffer op kamertemperatuur toe om de nucleïnezuren uit de kolom te elueren. Sluit de dop en incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer daarna één minuut bij 6.000 ×g.

Om het DNA te amplificeren, bereidt u na het titreren van de primers en de probe volgens het tekstprotocol 22,5 µL reactiemengsel voor per reactie door 12,5 µL PCR-mastermix, 20 µM forward- en reverse-primers, 10 µM van de probe en voldoende ultrapuur water toe te voegen om een totaalvolume van 22,5 µL te bereiken. Bereid het PCR-reactiemengsel altijd in een specifieke zone om contaminatie te voorkomen. Pipetteer 22,5 µL van het betreffende reactiemengsel in elke reactieput van een 96-wells plaat.

Voeg negatieve controles toe voor de extractie en PCR om er zeker van te zijn dat geen van de reagentia besmet is met ongewenst DNA. Voeg vervolgens 2,5 µL van het monster, de negatieve extractiecontrole, de negatieve PCR-controle of het positieve controlemonster toe aan de overeenkomstige reactieputjes. Gebruik daarna een adhesieve plaatafdichting om de plaat af te sluiten.

Centrifuge vervolgens bij 6.000 gs gedurende 10 seconden. Plaats de plaat in een real-time PCR-systeem. Selecteer vervolgens het sjabloon voor de indeling van de assay en de PCR-programma-instellingen zoals hier getoond, en start de run.

Nadat de ruwe gegevens van het real-time PCR-systeem naar een spreadsheet zijn overgezet, stelt u de drempelwaarde in de amplificatieplots in boven de basislijn en binnen het gebied van exponentiële groei om de drempelcyclus voor elk monster te bepalen. Zet elke set standaardpunten uit als een standaardcurve om de lineariteit vast te stellen. Bereken vervolgens het kopie-aantal voor de verschillende monsters op basis van de standaardcurve.

Om de detectielimiet van de qRT-PCR-resultaten te bepalen, worden 90 µL ultrapuur water in zes buisjes gedoseerd. Om zes tienvoudige seriële verdunningen van het plasmide te maken om de afnamezone te targeten, wordt gestart met het overbrengen van 10 µL van de plasmide-werkverdunning naar het buisje met 90 µL ultrapuur water. Het buisje wordt kortstondig gevortext en gecentrifugeerd.

Breng vervolgens 10 µL van de buis over naar de volgende buis met water. Herhaal de overdracht na vortexen en centrifugeren totdat alle buizen met water het plasmide hebben ontvangen. Bepaal, nadat het DNA in de zes tienvoudige seriële verdunningen is geamplificeerd zoals eerder in deze video beschreven, de afnamezone, wat de laatste verdunning van het plasmide is die een positief signaal geeft en de eerste verdunning zonder detectie.

Om zes tweevoudige seriële verdunningen voor te bereiden, verdeelt u 25 µL ultrapuur water over zes buisjes. Neem de laatste verdunning van het plasmide die een positief signaal gaf bij de tienvoudige verdunningen en breng 25 µL vanuit dit buisje over naar het eerste buisje met water. Vortex en centrifugeer voordat u de overige vijf verdunningen voorbereidt zoals zojuist gedemonstreerd.

Amplificeer het DNA uit de tweevoudige seriële verdunningen zoals eerder in deze video beschreven. Bereken na het amplificeren van het DNA uit de drie onafhankelijke proeven het aantal positieve replica's van de 24 replica's voor elk niveau van plasmidconcentratie. Bepaal de LOD met een betrouwbaarheid van 95 procent of LOD 95 procent PCR, wat het niveau is dat resulteert in de detectie van 23 positieve replica's van de 24 replica's.

Om de LOD van de methode te bepalen, worden vijf tweevoudige seriële verdunningen gemaakt, beginnend met 25 µL van de werkverdunning van het plasmide. Deze werkverdunning is vier keer zo geconcentreerd als de laatste concentratie van een tienvoudige verdunning die een positief signaal gaf. Het plasmide dat in de amplificatiestap wordt gebruikt, is afkomstig van een plasmide-werkverdunning die in een specifiek gebied is bereid om contaminatie te voorkomen. Dit is een kritische stap.

Breng 5 µL van elke verdunning van het plasmide over naar vier buisjes met 135 µL van het negatieve bronmateriaal om vier replica's van de vijf positieve standaarden te verkrijgen. Voer de extractie uit voor de vier replica's van de vijf positieve standaarden en voer de amplificatieprocedure uit zoals eerder in deze video beschreven. Tel het aantal positieve replica's van de acht replica's voor elk niveau van de plasmideconcentratie.

Bepaal ten slotte de LOD-methode, wat het laatste niveau is waarbij acht van de acht herhalingen positief zijn. De in deze video beschreven kwantitatieve RT-PCR-methode detecteert en kwantificeert equid herpesvirus-2 in respiratoire vloeistoffen. In dit experiment werden tienvoudige seriële verdunningen gemaakt om de afnamezone te schatten, welke ligt tussen de verdunningen 10⁻⁹ en 10⁻¹⁰.

De LOD PCR-waarde werd bepaald met een nieuwe tweevoudige seriële verdunning in de afnamezone. Om het lineariteitsbereik en de LOQ PCR te bepalen, werd de LOD PCR-waarde gebruikt als startpunt voor een reeks van zes tienvoudige seriële verdunningen tussen 2,6, de LOD PCR-waarde, en 260.000 kopieën per 2.5 µL monster. De LOQ PCR is de laagste concentratie binnen het lineariteitsbereik.

De karakterisering van de volledige methode is de validatie van alle stappen die nodig zijn om qRT-PCR-gegevens te verkrijgen, vanaf de extractie van DNA uit het respiratoire monster tot aan de amplificatie en kwantificatie van het target. De kwantitatieve prestaties van de volledige analytische qRT-PCR-methode werden geëvalueerd en gevalideerd met een nauwkeurigheidsprofiel dat in deze grafiek wordt weergegeven. De virale genoomlasten van EHV2 in 172 neusswabmonsters van paarden met respiratoire aandoeningen werden gekwantificeerd zoals hier getoond.

De virale genoomhoeveelheden waren hoger bij jonge paarden, waarbij de hoogste hoeveelheid werd vastgesteld op 1,9 × 10¹¹ kopieën per milliliter. Eenmaal beheerst kan deze techniek in minder dan twee uur per amplificatiestap worden uitgevoerd, en het totaal van de validatiestappen kan in minder dan vier weken worden voltooid mits dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het risico op contaminatie moet worden vermeden, met name bij het werken met een plasmidenoplossing.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals sequenering, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals genoomidentificatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de extractie en amplificatie van DNA uitvoert en hoe u hun PCR-reserves karakteriseert. Vergeet niet dat het werken met biologische monsters zoals pathogenen uiterst gevaarlijk kan zijn.

Bij het uitvoeren van deze procedure moeten altijd bepaalde voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het werken in een zuurkast en in een gebied met een aangepast veiligheidsniveau.