Name: Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing voor de Beoordeling van DNA-methylatie bij Base Pair Resolutie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Leer Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing voor DNA-methylatieanalyse met restrictie-enzymvertering en bisulfietconversie. Deze methode genereert hoge-resolutie epigenetische data van kleine hoeveelheden DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken alle auteurs van het originele ERRBS-rapport. We danken Mame Fall voor technische assistentie. We erkennen de Weill Cornell Medical College Epigenomics Core voor technische diensten en assistentie. Het werk werd ondersteund door een Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, een NCI K08CA169055 en ASH-AMFDP12005 aan FGB, NIH R01HG006798 en R01NS076465, financiering van de Irma T. Hirschl en Monique Weill-Caulier Charitable Trusts en STARR Consortium (I7-A765) aan CEM, en een LLS SCORE-subsidie (7006-13) aan AMM.

Alle procedures uitgevoerd worden goedgekeurd door de Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care en gebruik Comite en volg National Institute of Health richtlijnen. 1. Chirurgische Techniek <ol><li> Handhaaf aseptische techniek tijdens deze procedure door steriele handschoenen, instrumenten, en een steriel chirurgisch veld volgens NIH richtlijnen 25. Steriliseren instrumenten voor het begin van de operatie door ze te autoclaveren (zie Tabel van specifieke reagentia / Apparatuur voor de volledige lijst). Gebruik een glazen kraal sterilisator om instrumenten te steriliseren tijdens de operatie. </li></ol> 2. Anesthesie en Voorbereiding <ol><li> Verdoven de muis in een narcosebox met een mengsel van 0,9 l / min zuurstof en 2,5% isofluraan met een veterinair isofluraan vaporizer systeem. Zorg ervoor dat de muis niet reageert op veranderingen in de lichaamshouding voordat u deze uit de doos. </li><li> Toepassing oogzalf om de mouogen se&#39;s om hen te beschermen tegen uitdrogen. </li><li> Schakel de gasstroom uit de doos om de neuskegel. Plaats de muis vierkant op zijn linkerkant op een verwarmde pad bedekt met een chirurgische pad en absorberend bankje papier met haar neus en mond in de kegel. Permanent toezicht van de muis ademhalingsritme en de snelheid en isofluraan aan te passen als dat nodig is (tussen 2,5-3% isofluraan) om een ​​adequaat niveau van anesthesie te behouden en gebruik de teen knijpen reflex om totale sedatie bevestigen. </li></ol> 3. Chirurgische Aanpak <ol><li> Lijn en de focus van de stereoscoop met het chirurgische veld. Pas de neuskegel en plak beneden zodat het gepositioneerd langs de rand van het gezichtsveld. </li><li> Met de muis liggend op zijn linkerzijde, tape de rand van het rechter oor naar de neus, het blootstellen van het gebied achter het oor waar de incisie wordt gemaakt. Zorg ervoor dat de achterste auriculaire ader verplaatst zich horizontaal over het oor. Merk op dat de correcte plaatsing van tHij dier en taping van het oor zijn cruciaal om snel de gezichtszenuw. </li><li> Bevochtig de vacht op en achter het oor met 70% ethanol en scheren de chirurgische site met behulp van een scheermes of een scalpel. Pre-wetting de vacht maakt het scheren makkelijker in deze anatomische locatie. </li><li> Reinig de huid met een jodium oplossing, zoals Betadine chirurgische scrub (7,5% povidon-jood), gevolgd door 70% ethanol. Herhaal deze reiniging nog twee keer grondig ontsmet het gebied. </li><li> Om te bepalen waar de incisie te maken, op te sporen de achterste auriculaire ader uit het oor caudaal naar het gebied posterior aan het oor uitstulping. Met behulp van de lente schaar, maak een 4 mm incisie 2-3 mm achter het uitsteeksel. </li><li> Ontleden door het onderhuidse vet en fascia met behulp van stompe dissectie. Vermijd direct snijden met de schaar omdat bloedvaten of spierweefsel gemakkelijk kunnen worden beschadigd. </li><li> Als bloeden optreedt, druk uitoefenen op de chirurgische lokatie met een steriel wattenstaafjeten minste 30 sec. Als significant vochtverlies optreedt, injecteer de muis intraperitoneaal met maximaal 0,5 ml steriele 0,9% zoutoplossing met behulp van een 25 of 27 G naald. </li><li> Gebruik een aantal belangrijke monumenten, de spinale accessoire zenuw, gehoorgang, en anterieure kauw- spieren (hieronder beschreven), naar de gezichtszenuw te lokaliseren. Ontleden rond deze monumenten tot de takken van de gezichtszenuw worden gevisualiseerd. De zenuw zal verschijnen als een belangrijke stevige witte structuur wanneer het wordt geopenbaard en een laag van fascia hecht het aan de onderliggende structuren. <ol><li> Vind de spinale accessoire zenuw, die reist van het caudale deel van de schedel te innerveren de trapezius spieren, zodra het onderhuidse vet en fascia zijn ontleed. De gezichtszenuw is diep om de spinale accessoire zenuw. </li><li> Vind de kraakbeenvissen gehoorgang dat parelwitte eruit ziet en kan rostraal van de gezichtszenuw te zien. </li><li> Vind de spierbuik van de voorste kauw- spier die ligt op de top van en caudal naar de gezichtszenuw. </li></ol></li><li> Wanneer de belangrijkste takken van de gezichtszenuw worden gevisualiseerd, sporen ze dorsally hun oorsprong vinden vanaf de stylomastoid foramen. Met behulp van fijne getipt Dumont tang # 5/45 aan de operatiewond open te houden, vooraf de lente schaar tips volgt het pad van de zenuw, verplaats dan de tang dorsaal naar de nieuw geavanceerde gebied open te houden. </li><li> Visualiseer de stam van de gezichtszenuw met het jukbeen, buccale, en marginale mandibular takken op dit punt. OPMERKING: De tijdelijke vestiging zal dichter bij het foramen te vinden. De marginale onderkaak zenuw takken in zijn bovenste en onderste delen dichter bij de kaak, waardoor deze zenuw takken zal niet zichtbaar zijn op dit niveau zijn. <ol><li> Als het uitvoeren van een zenuw doorsnijding, het stabiliseren van de zenuw voorzichtig met de fijne punt tang en snijd de zenuw met de lente-schaar. Vermijd het gebruik van te veel tractie aan de zenuw met de tang om te voorkomen avulsing de zenuw van de hersenstam. Duwde stronken uit elkaar, of knippen en verwijderen van een deel van de distale zenuw om ervoor te zorgen dat er geen heraansluiting kan optreden. </li><li> Als het uitvoeren van een crush, gebruiken Dumont # 5/45 tang om de zenuw te comprimeren gedurende 30 seconden met behulp van een constante druk om alle axonen verbreken, en herhaal dit oogje op een tweede hoek loodrecht op de eerste verliefdheid website. Vermijd het gebruik van variabele hoeveelheden druk tijdens de 30 sec pletten, anders zal de schade inconsistent tussen dieren zijn. </li></ol></li></ol> 4. Sluiting and Recovery <ol><li> Herpositioneren het vet en spieren over de onderliggende structuren. </li><li> Geschatte de randen van de incisie en de wond sluiten met een 7,5 mm wond clip. Hechtingen of lijm zijn ook aanvaardbaar voor de sluiting van de wond. Postsurgical analgetica kan worden verstrekt op dit moment. </li><li> Verwijder de tape van het oor van de muis. Schakel de isofluraan stroom en laat de muis om zuivere zuurstof inademen voor 30 sec tot 1 min. Place van de muis in een lege kooi zonder strooisel om te herstellen van de anesthesie. </li><li> Wanneer de muis wordt teruggewonnen, onderzoekt het gedrag voor bevestigend tekenen van gezichtsverlamming. De snorharen zal worden verlamd en schuin terug naar de wang, zal de neus worden afgeweken, en het oog zal niet knipperen in reactie op een zuchtje lucht. </li><li> Huis dieren gezamenlijk na de operatie als ze vrouwelijke. Vermijd behuizing mannelijke muizen samen omdat ze meer agressief en vaak gedwongen wondklemmen hun cagemate, wat leidt tot infectie te verwijderen. Zorg postsurgical analgetica op dit moment, indien nodig. </li><li> Controleer de muizen eenmaal per dag gedurende enkele dagen na de operatie te voorkomen dat infectie of andere complicatie postoperatief. Verwijder wond clips 7-10 dagen na de operatie als ze niet zijn gevallen op hun eigen. </li><li> Solliciteer smeren oogzalf om het aangedane oog dagelijks naar het hoornvlies complicaties te voorkomen, hetzij tot het oog knipperreflex is rebedekt of tot euthanasie. </li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Het protocol gepresenteerde rendementen basepaarvolgorde resolutie data van cytosine methylatie bij biologisch relevante genomische regio. Het protocol zoals geschreven is geoptimaliseerd voor 50 ng uitgangsmateriaal, maar het kan worden aangepast aan verschillende uitgangsmateriaal (5 ng of meer) 26 verwerken. Dit aanpassing van enkele protocol stappen vereisen zoals in Tabel 6. De ERRBS bibliotheken vatbaar voor gepaarde einde sequentiebepaling en verdere genomische dekking kan ook worden bereikt door sequentiebepaling langer dan 51 cycli leest. Multiplexed sequenering lagere kosten per monster protocol bieden, maar dit leidt tot verminderde dekking per CpG plaats weergegeven in de data (Figuur 5 en Tabel 8), en voldoende diepte dekking analyses die een hoge dekking per vereisen voeren niet opleveren CpG website (bv zoals beschreven door Landan et al. 33). Tot slot wordt in dit protocol (of een bisulfiet gebaseerd protocol) kan niet tussen methyl-cytosine en hydroxymethyl-cytosine 46,47. De stroom kunnen worden geïntegreerd met andere protocolgegevens resultaten 48,49 de verschillende wijzigingen bakenen, en andere modificaties cytosine onlangs gemeld 50, moeten ze van belang. Hoogwaardige bibliotheken verschijnen zoals getoond in figuur 3A-C, en eenmaal samengevoegd voor sequencing levert een spoor zoals in figuur 3G (rood trace) die gelijke molaire bijdragen van beide bibliotheek fracties. Bibliotheek bereiding storing tot vanaf elke stap in de procedure. Als afgebroken DNA verwerkt zal resulteren in bibliotheken die niet verrijkt zijn MspI fragmenten en derhalve in lage CpG dekking met de sequentie parameters in dit protocol beschreven. Als een enzym niet-functionele of onbedoeld buiten één van de reacties, zal het protocol niet de verwachte bibliotheek opleveren. Indien de ligatie reactie is inefficiënt, adapters zijn bij een hogere concentratie dan verwacht, en / of de primers gebruikte concentratie een beperkende reagens voor de uiteindelijke amplificatie stappen kan bibliotheek storing optreden. Overmaat adapters (gezien als pieken bij -150 bp bioanalyzer resultaten Figuur 3D-F) in de bibliotheek ook interfereren met sequencing vanwege de willekeurige clustering van zowel de bibliotheek en overmaat adapters. Hoewel een dergelijke bibliotheek kan blijkbaar normaal sequentie, een aanzienlijk deel van de leest wordt alleen adaptersequenties. Als er teveel adapters worden waargenomen in een bibliotheek, is het het beste om de bibliotheek voorbereiding herhalen als materiaal beschikbaar is met behulp van een optimale inbreng materiaal om kwantiteit verhoudingen adapter. Tenslotte efficiënte PCR amplificatie van de bibliotheken te waarborgen, worden de lagere en hogere bibliotheek fracties gehandhaafd als afzonderlijke monsters gehele bisulfiet conversie en PCR verrijking stappen. Gebeurt dit niet, levert differentiële efficiëntie van de amplificatie tijdens de PCR reactie van hogere en lagere fracties (zoals getoond in figuur 3G blauw spoor) en de mogelijke ongelijke vertegenwoordiging van de respectievelijke genomische loci die in elke bibliotheek fractie tijdens sequencing. De gebruiker kan ervoor kiezen om een ​​kwantitatieve PCR stap onmiddellijk na bisulfiet conversie voor verdere titratie optimale PCR-cycli nodig voor het amplificeren bibliotheken gegenereerd omvatten. ERRBS voorbereiding bibliotheek protocol heeft een aantal belangrijke stappen in die specifieke reagentia worden aanbevolen. Eind-repair stap het gebruik van een vier-nucleotide dNTP mix maakt einde reparatie van producten de CG overhang, zoals die welke voortvloeien uit MspI ster enzymatische activiteit en geknipt DNA fragmenten aanwezig in de oorspronkelijke DNA-monster bevat. Dit resulteert in een verbeterde CpG vertegenwoordiging in de resultaten. Op ligatie stap is het essentieel om een ​​hoge concentratie ligase (2.000.000 eenheden / ml) en gemethyleerde adapters zodat de ligatie reaction is efficiënt en de bisulfiet omzetting niet de adaptersequenties essentieel voor nauwkeurige gegevens uitlijning beïnvloeden. Bij de PCR stap met een polymerase kan amplificeren bisulfiet behandelde GC-rijke DNA-fragmenten dient voor hoge specificiteit. Tot slot, om de eliminatie van overtollige adapters en primers zorgen, SPRI kraal zuivering (bijvoorbeeld: Agencourt AMPure XP) wordt eerder aanbevolen dan kolom gebaseerde testen voor ligatie en PCR-product isolaties. Om een ​​hoge kwaliteit te genereren, is het belangrijk om doelmatige bisulfiet conversie waarborgen. De gepresenteerde controle biedt de gebruiker de mogelijkheid om omzettingsrendement voor sequencing bepalen. Als alternatief kan een niet-humaan DNA zoals lambda DNA worden gebruikt als een interne controle (piek-in). Door de verschillen in soort, kan dit type controle direct in stroomafwaartse sequentie (bijvoorbeeld zoals gebruikt door Yu et al. 34). Indien de piek in is gebruikt, kan het niet worden gebruikt om omzettingsrendement voor bibliotheek sequencing bepalen tenzij uniek geamplificeerd en onafhankelijk sequentie voor bibliotheek sequencing. De omrekeningskoersen die zijn gebaseerd op de methylering status van niet-CpG sites. Dit kan niet geschikt voor gebruik in de context van hoge cytosine methylatie in niet-CpG context (bijvoorbeeld embryonale stamcellen) en parallel monsters of andere middelen voor de beoordeling van omzettingsrendement kan worden gebruikt voor dit doel. Er zijn enkele restricties aan te pakken die uniek zijn voor de sequencing van ERRBS bibliotheken. De eerste drie basen van de bibliotheek fracties sequentie bijna uniform niet willekeurig door de MspI erkenning snede ter (C ^ CGG, zie figuur 4B, C). Dit resulteert in de mogelijkheid van een aanzienlijk verlies van gegevens als gevolg van lage kwaliteit leest als gevolg van slechte cluster lokalisatie ondanks kennelijk grote cluster dichtheid tijdens sequencing. Om deze barrière te overwinnen,onder andere een hoge complexiteit bibliotheek in een onafhankelijke rijstrook (PhiX controle of een ander type bibliotheek) als een speciale controle rijstrook. Hoge complexiteit bibliotheken hebben einden die een evenwichtige vertegenwoordiging van A, C, T en G in de eerste vier basen sequentie. Geschikte rijstroken omvatten bibliotheken, zoals RNA-seq, ChIP-seq, whole genome sequencing, of een controle door de fabrikant aangeboden sequencing machine (bijv PhiX Controle v3). Wanneer aangewezen als controle rijstrook voor de respectieve sequencing run, kan het dienen als basis voor de matrix generatie die wordt gebruikt tijdens de eerste vier basen van sequencing tot cluster posities op te sporen. De hogere kwaliteit leest gevangen zal het gemiddelde dekking per CpG ter verhogen met 5,2 (n = 4). Als alternatief kan dit technische probleem ook worden opgelost met behulp van een donkere sequencing aanpak zoals eerder beschreven 23. Andere sequencing criteria volgen standard operating procedures per protocollen van de fabrikant. Ten slotte is de dekking per CpG cHosen voor data-analyse zal worden geleid door de gebruiker en voor een deel door de biologische vragen van belang. 10x dekking drempel biedt een hoge dekking analyse aanpak, maar deze drempel kan worden verlaagd zou dat van belang zijn. Een volledige bespreking van ERRBS data-analyse valt buiten het bestek van dit artikel, echter differentieel gemethyleerde cytosines en regio&#39;s kan worden bepaald met behulp van open source tools 31,51-53. Aanvullende overwegingen en benaderingen analyse zijn goed beschreven 54,55, en de lezer wordt aangemoedigd om de literatuur te zoeken naar instrumenten het meest geschikt om de geplande analyse. In vergelijking met andere gepubliceerde methoden, ERRBS biedt een vierdaagse protocol dat wanneer deze wordt uitgevoerd zoals beschreven opbrengsten hoge tarieven van de reproduceerbaarheid. Er is gevalideerd vergeleken met de gouden standaard MassARRAY EpiTYPER 26, rendabel voor hoge dekkingsgegevens, en is aanpasbaar voor diverse uitgangsmateriaalhoeveelheden (gunstig voor klinische monster verwerking en andere celtypen van lage frequentie) en sequencing benaderingen. Het biedt basenparen resolutie van biologisch relevante loci en kan in integratieve analyses met andere technieken profilering genoombrede transcriptiefactor bindende, chromatine hermodellering, epigenetische merken en andere cytosine modificaties van belang. ERRBS gegevens gebruik in dergelijke studies kunnen bijdragen tot een omvattende moleculaire benadering en maken hoogdimensionale analyses in de studie van biologische modellen en menselijke ziekten.

DNA methylatie op cytosine (5-methylcytosine) een epigenetische merk kritisch in zoogdiercellen voor een verscheidenheid van biologische processen, waaronder maar niet beperkt tot imprinting, X-chromosoom inactivatie, ontwikkeling en regulatie van genexpressie 1-8. De studie van DNA methylatie patronen in kwaadaardige en andere aandoeningen is bepaald ziektespecifieke patronen en bijgedragen tot het begrip van de ziekte pathogenese en potentiële biomarker ontdekkingen 9-17. Er zijn veel protocollen die de epigenome voor DNA-methylatie-status te ondervragen. Deze kunnen worden onderverdeeld in affiniteit gebaseerde, restrictie-enzym-gebaseerde en bisulfiet conversie gebaseerde testen die microarray of sequencing platforms gebruik stroomafwaarts. Verder zijn er een aantal protocollen die overbruggen deze algemene categorieën, waaronder, maar niet beperkt tot, Combinatie bisulfiet restrictieanalyse 18 en verlaagde Representation bisulfietsequencing (RRBS 19). </p&gt; RRBS werd oorspronkelijk beschreven door Meissner et al. 19,20. Het protocol werd een stap GC-rijke genomische regio gevolgd door bisulfiet sequencing, waardoor kwantitatieve basenpaar resolutie data kostenbesparende 21,22 verrijken. De GC-rijke gebieden doelwit van de MspI (C ^ CGG) restrictie-enzym en cytosine methylatie wordt opgelost door bisulfiet omzetting cytosinen (desaminering ongemodificeerde cytosines tot uracil), gevolgd door polymerasekettingreactie (PCR) amplificatie. RRBS onder de meeste genpromotors en CpG eilanden in een gedeelte van de sequentie die voor een genoom; echter RRBS had beperkte dekking van CpG oevers en andere intergenische regio&#39;s van biologische relevantie. Verschillende groepen hebben gepubliceerd bijgewerkt RRBS protocollen sinds het originele rapport dat verbeteren op de methodologie en de daaruit voortvloeiende dekking van deze genomische regio&#39;s 23-25. Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging Bisulfiet Sequvloeden (ERRBS) omvat bibliotheek voorbereiding wijzigingen en een alternatieve data alignment benadering 26 in vergelijking met RRBS. ERRBS resulteerde in een hoger aantal CpGs weergegeven in de verkregen gegevens en de berichtgeving van genomische regio ondervraagd 26. Deze methode werd gebruikt om DNA methylatie patronen in humane patiënt en andere dierlijke specimens 26-30 lossen. De ERRBS beschreven protocol biedt informatie over alle stappen van voltooiing en gegevens werden gegenereerd met representatieve humaan DNA (monsters werden verkregen uit eerder gemeld, de geïdentificeerde patiëntenmonsters 31 en CD34 + beenmerg monster van een normale menselijke donor). Het protocol bevat een geautomatiseerd grootte selectieproces, waarbij de verwerkingstijd vermindert per monster en zorgt voor een grotere nauwkeurigheid in de bibliotheek grootte selectie. Het protocol combineert een reeks gevestigde moleculaire biologische technieken. Hoog molecuulgewicht DNA wordt gedigereerd wet een methylatie-ongevoelige restrictie-enzym (MspI), gevolgd door end-reparatie, A-tailing, en ligatie van gemethyleerde adapters. Omvang selectie van de GC-rijke fragmenten wordt gevolgd door bisulfiet conversie en PCR-amplificatie voorafgaand aan de sequencing. Bisulfiet conversie is eerder beschreven 32 en gedetailleerd overzicht van de data-analyse en toepassingen valt buiten het bestek van dit artikel, echter aanbevelingen en referenties zijn opgenomen voor het gebruik van de lezers. Het protocol kan worden uitgevoerd in vier dagen en is vatbaar voor kleine ingang (50 ng of minder) materiaal bedragen. Het protocol beschreven levert gegevens met hoge dekking per CpG ter niet alleen voldoende voor differentiële methylering plaats en omgeving bepalingen maar ook epigenetische polymorfisme detectie zoals beschreven door Landan, et al. 33.

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Reactiebuffer voor MspI-enzym; protocol stap 1.2</td></tr><tr><td>Fenoloplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>Geëquilibreerd met 10&nbsp;mM Tris HCl, pH&nbsp;8.0; zie veiligheids- en gebruiksinstructies op http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Zie veiligheids- en gebruiksinstructies op http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/ml</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M, pH 5.2</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, voor moleculaire biologie</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8.5</td></tr><tr><td>tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Bereid een 1 M, pH 8.5-oplossing</td></tr><tr><td>Tris- Ethyleendiaminetetraazijnzuur (TE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>Verdun tot 1x bufferoplossing volgens de aanbevelingen van de fabrikant</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reactiebuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>10x concentratie</td></tr><tr><td>Deoxynucleotidetrifosfaat (dNTP) Oplossingsmix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM elk nucleotide</td></tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td>3.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>5.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotidylkinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>10.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Gebruikt voor DNA-productzuivering in protocol stap 2.3</td></tr><tr><td>2'-deoxyadenosine 5'-trifosfaat (dATP)</td><td>Promega</td><td>U1201</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Klenow-fragment (3'&rarr;5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>MinElute PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Gebruikt voor DNA-productzuivering in protocol stap 3.3</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2.000.000 eenheden/ml</td></tr><tr><td>Methyleringsadapter Oligo-kit</td><td>Illumina</td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Gebruikt in protocolgedeelten die magnetische kralenzuiveringsstappen implementeren (stappen 4.3 en 8.2). Breng voor gebruik in evenwicht met kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>Pippin Prep Gel Cassettes, 2% agarose, kleurstof-vrij</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td><td>met interne standaarden</td></tr><tr><td>Certified Low Range Ultra agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>Tris-boraat-EDTA (TBE) buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>50 bp DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Dye, Oranje (6x)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&nbsp;Mes&nbsp;Nr.&nbsp;11</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extractiekit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td>Gebruikt in protocol stap 6.2</td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>Alternatief voor stap 6.2</td></tr><tr><td>Universal Methylated Human DNA Standard</td><td>Zymo Research</td><td>D5011</td><td>Gebruikt als bisulfietconversiecontrole</td></tr><tr><td>FastStart High Fidelity PCR System</td><td>Roche</td><td>03553426001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Een op fluorescentie gebaseerde DNA-kwantificeringstest; gebruikt in protocol stappen 1.1, 9.1 en 10.1</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magneet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA Sample prep</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>Barcoded adapters gebruikt voor multiplexing bibliotheken; Zie Aanvullend bestand voor multiplexing-protocol.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry Block Heater</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelelektroforesesysteem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroforese voeding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel doc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV of blauw licht transilluminator</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verbeterde verminderde vertegenwoordiging bisulfietsequencing voor de beoordeling van dna-methylatie bij base pair resolutie

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylatie patroon mapping zwaar bestudeerd in normale en zieke weefsels. Verschillende methoden zijn vastgesteld om de cytosine methylatie patronen ondervragen cellen. Verminderde vertegenwoordiging van whole genome bisulfietsequencing is ontwikkeld om kwantitatieve basenparen resolutie cytosine methylatie patronen te detecteren bij GC-rijke genomische loci. Dit wordt bewerkstelligd door het combineren van het gebruik van een restrictie-enzym, gevolgd door bisulfiet conversie. Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing (ERRBS) verhoogt de biologisch relevante genomische loci bedekt en is gebruikt om cytosine methyleringsprofiel in DNA van mens, muis en andere organismen. ERRBS initieert met restrictie-enzym digestie van DNA laagmoleculaire fragmenten voor gebruik in de bibliotheek bereiding genereren. Deze fragmenten worden onderworpen aan standaard bibliotheek constructie voor de volgende generatie sequencing. Bisulfiet omzetting van niet-gemethyleerd cytosinen voorafgaand aan de finale amplificatiop stap kunt voor kwantitatieve basis resolutie van cytosine methylatie niveaus in overdekte genomische loci. Het protocol kan worden voltooid binnen vier dagen. Ondanks de lage complexiteit in de eerste drie bases gesequenced, ERRBS bibliotheken leveren van hoge kwaliteit van de gegevens bij het gebruik van een aangewezen sequencing controle rijstrook. Mapping en bioinformatica-analyse wordt vervolgens uitgevoerd en levert gegevens op die gemakkelijk geïntegreerd worden met verschillende genoom-brede platforms. ERRBS gebruik kunnen maken van kleine hoeveelheden grondstoffen waardoor het mogelijk is om de menselijke klinische monsters en toepasbaar te verwerken in een reeks van wetenschappelijke toepassingen. De video geproduceerd demonstreert kritische stappen van de ERRBS protocol.

Verbeterde Gereduceerde Representatie Bisulfiet Sequencing is een methode voor de voorbereiding van sequencingbibliotheken voor DNA-methylatieanalyse op basis van restrictie-enzymdigestie gecombineerd met cytosine bisulfietconversie. Dit protocol vereist 50 ng aan uitgangsmateriaal en levert data met base-paarresolutie op GC-rijke genomische regio's.

Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing voor de Beoordeling van DNA-methylatie bij Base Pair Resolutie

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Het algemene doel van deze procedure is om sequencing-bibliotheken te genereren voor base pair-resolutie D-N-A-C-P-G, methylatie-analyse op basis van restrictie-enzymdigestie gecombineerd met cytosine door sulfaatconversie. Dit wordt bereikt door eerst MSP een restrictie-enzymdigestie van hoogwaardig DNA uit te voeren, gevolgd door eindherstel, een tailing en ligatie van gemethyleerde adapters. De volgende stap is het uitvoeren van sulfaatconversie op grootte-geselecteerde fragmenten na sulfaatconversie.De fragmenten worden versterkt met behulp van PCR. De laatste stap is het uitvoeren van kwaliteitscontrole en sequencing, gevolgd door gegevensvisualisatie en -analyse. Uiteindelijk detecteert verbeterde gereduceerde representatie van bi sulfaat sequencing kwantitatieve base pair-resolutie van cytidine methylatiepatronen op CG-rijke genomische loci.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere DNA-methylatiemethoden, zoals microarrays, is dat het kleine hoeveelheden inputmateriaal kan gebruiken om D-N-A-C-P-G-methyleringsgegevens met base pair-resolutie en biologisch relevante sites te genereren. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we geïnteresseerd waren in het verkennen van epigenetische patronen buiten de regio's die in traditionele assays worden bedekt. We waren geïnteresseerd in de ontwikkeling van deze techniek om over te gaan van microarrays naar het genereren van DNA-methyleringsgegevens met base pair-resolutie die geïntegreerd kunnen worden met gegevens die gegenereerd worden door andere next-generation technieken.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van epigenetica. Bijvoorbeeld, epigenetisch patroon en heterogeniteit in biologische monsters vergeleken met normale controles of andere ziektetoestanden. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn bij deze methode het uitdagend vinden vanwege de lengte van de procedure, de talrijke specifieke vereisten en de unieke sequencingkarakteristieken van de gegenereerde bibliotheken van Mamie fall.Een onderzoeksspecialist in ons lab zal assisteren bij het demonstreren van de procedure om dit protocol te starten. Eerst, bereid gezuiverde aliquoten van genomisch DNA-monsters voor die een MSP een restrictie-enzymdigestie hebben ondergaan, een blunt end herstelreactie en een enkele nucleotide toevoeging aan de drie prime-uiteinden. Op dit punt zullen de DNA-producten klaar zijn voor adapterligatie om te beginnen. Breng 10 microliter van het A-A-L-D-N-A-monster over in een 0,2 milliliter PCR-buis en plaats de buis op ijs.Plaats bovendien een aliquot van de adaptermoleculen op ijs. Bereid vervolgens het ligatiereagensmengsel op ijs voor. Voeg zowel het ligatiereagens als de adaptermoleculen toe aan het DNA-monster en pipet om en om een paar keer om te mengen.Plaats een PCR-buis in een thermische cycler en laat de ligatiereactie overnacht doorgaan bij 16 graden Celsius op de volgende dag. Zuiver de ligatieproducten met behulp van een magnetisch parel- of silicakolom gebaseerde vaste fase DNA-extractiekit. Bij de laatste stap van het zuiveringsproces.Elueer het DNA door 30 microliter watervrij DNA toe te voegen. Het gezuiverde DNA-product kan worden bewaard bij min 20 graden Celsius totdat het nodig is voor monsters, die begonnen met de totale DNA van 25 nanogram of meer. Gebruik een geautomatiseerd gel-extractieapparaat zoals de PI en prep om te selecteren voor geligeerde producten met lengtes tussen 150 base paar en 400 base paar.Zorg ervoor dat DNA-visualisatiekleuren zoals Ethereum bromide of cyber groen worden uitgesloten van de agros cassette omdat ze de DNA-migratie-eigenschappen van de gevorkte adaptergebonden fragmenten kunnen veranderen. Standaard agros gel-gebaseerde grootteselectieprotocollen kunnen ook worden gebruikt voor deze stap van het protocol om DNA-elektroforese op een pippin 2% kleurstof-vrije aros cassette op te zetten. Maak een nieuw protocol in de Pippin Prep console en selecteer de 2%DF marker L optie als de cassette van keuze.Schakel vervolgens de optie voor het gebruik van interne standaarden in en controleer of het referentiebaannummer overeenkomt met de baannummers voor het isoleren van DNA-fragmenten variërend van 150 base paar en 400 base paar. Selecteer de bereikoptie als de verzamelmodus en voer de volgende limietparameters in: 135 voor base paar start 410 voor base paar einde en 240 voor base paar paws. Dit geeft het apparaat opdracht om het elektroforetische veld uit te lijnen met de elektro-elutie uitgangspoort.Wanneer DNA-fragmenten binnen dat bereik zich in de buurt van de uitlaat bewegen. Na het opslaan van het protocolbestand, bereid de gelcassette en de monsterlaadputjes van het instrument voor door de standaard operationele procedures van Pippen Prep te volgen bij het opzetten van het instrument. Bereid de DNA-monsters voor op elektroforese door 10 microliter van de DNA-marker toe te voegen aan een 30 microliter aliquot van een gegeven post-ligatiemonster om de mengsels op de gelcassette te laden.Verwijder eerst 40 microliter van het elektroforesebuffer uit elk monster. Vervang vervolgens het volume door elk 40 microliter monstermarkeringsmengsel in afzonderlijke putjes te pipetten. Keer terug naar de console, laad het opgeslagen protocol en druk op start om de elektroforese te starten.Wanneer het programma de 240 base paar bereikt, onderbreek handmatig en verzamel 40 microliter van de uitlaat uit elke uitgangspoort met een pipet. Label deze fracties als de onderste bibliotheekfractie. Nadat de onderste bibliotheekfracties zijn verzameld, spoel de uitlaatpoorten onmiddellijk door 40 microliter vers elektroforesebuffer toe te voegen.Pipet de buffer omhoog en omlaag minstens drie keer en zuig vervolgens het snet op. Herhaal deze wasbeurt nog twee keer om alle sporen van kortlengte DNA-soorten uit de uitlaten te verwijderen. Voeg nu 40 microliter elektroforesebuffer toe aan het monster.Seal de elucia-poorten en druk op de knop om het elucia-proces te hervatten. Bij voltooiing van het Ellucian-programma op de 410 base paar-instelling, verzamel de 40 microliter van Inuit uit alle uitgangspoorten en label deze fracties als de bovenste bibliotheekfractie. Op dit punt zijn beide bibliotheekfracties gel-gezuiverd en al klaar voor bi sulfaatconv

enhanced-reduced-representation-bisulfite-sequencing-for-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De gouden standaard voor DNA methylatie analyse is genomische sequentie van bisulfiet omgezet DNA. Deze methode maakt gebruik van de verhoogde gevoeligheid van cytosine in vergelijking met 5-methylcytosine (5-MEC) tegen desaminering bisulfiet onder zure omstandigheden. Niet-gemethyleerd cytosines kunnen worden onderscheiden van gemethyleerd cytosines na PCR-amplificatie van het doel genomisch DNA.

DNA-methylatie: bisulfiet Wijziging en Analyse

Een gestroomlijnde workflow om DNA-methylatie en expressie van genen veranderingen te bestuderen op de jeugd stress wordt weergegeven. Vanaf moeder scheiding van pasgeboren muizen en isolatie van discrete hersenweefsel vertegenwoordigen wij een protocol van DNA en RNA tegelijk isoleren van hersenweefsel ponsen voor latere bisulfiet sequencing en RT-PCR analyse.

Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

This video demonstrates the procedure of bisulfite modification of genomic DNA from gastrointestinal cancer samples. The technique is beneficial for investigating the relationship between genes’ methylation patterns and establishing their contribution to carcinogenesis.

Bisulfite Conversion of Genomic DNA: A Method to Study DNA Methylation in Genomic DNA Samples from Gastrointestinal Cancer Tissue

Bisulfiet amplicon sequentiebepaling (BSAS) is een methode voor het kwantificeren van cytosinemethylatie in gerichte genomische regio's van belang. Deze methode maakt gebruik van bisulfietconversie in combinatie met PCR-amplificatie van doelregio's vóór next-generation sequencing om absolute kwantificering van DNA-methylatie op een basisspecifiek niveau te produceren.

Gerichte DNA methylatie analyse van next-generation sequencing

Hier presenteren we een protocol om het gehele genoom DNA-methylatie in grootschalige klinische patiënt screening studies met behulp van de Methyl-bindende DNA Capture sequencing (MBDCap-seq of MBD-volgende) technologie en de daaropvolgende bioinformatica analyse pijplijn te onderzoeken.

-Methyl-bindende DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd methyl-CpG-bindingsdomein (MBD) sequentieringsprotocol en een berekeningspijpleiding om differentieel gemethyleerde CpG-rijke regio's bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie (CLL) te identificeren.

Omvattende DNA-methyleringsanalyse met gebruikmaking van een methyle-CpG-bindende domein-opnamebaseerde methode bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie

Hier presenteren we een protocol zodat nauwkeurige kwantificering van mitochondriale methylation van DNA (mtDNA). In dit protocol beschrijven we een enzymatische spijsvertering van DNA met BamHI in combinatie met een bioinformatic analyse pijpleiding die kan worden gebruikt om te voorkomen dat overschatting van mtDNA methylering niveaus veroorzaakt door de secundaire structuur van mtDNA.

Methodologie voor nauwkeurige detectie van mitochondriaal DNA methylatie

We beschrijven hier, het protocol en de uitvoering van Methyl-Seq, een epigenomic-platform, met behulp van een rat-model om epigenetische veranderingen die zijn gekoppeld aan chronische stress blootstelling te identificeren. Resultaten tonen aan dat de rat Methyl-Seq platform is voor het opsporen van methylation van verschillen die uit stress blootstelling bij ratten voortvloeien van.

Een Rat Methyl-Seq Platform om epigenetische veranderingen Associated with Stress Exposure te identificeren

De huidige studie beschrijft de workflow om DNA-methylatiegegevens te beheren die zijn verkregen door microarray-technologieën. Het protocol demonstreert stappen van monstervoorbereiding tot data-analyse. Alle procedures worden in detail beschreven en de video toont de belangrijke stappen.

Monstervoorbereiding tot bio-informatica analyse van DNA-methylatie: associatiestrategie voor obesitas en gerelateerde eigenschappenstudies

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van...

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

Leer Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing voor DNA-methylatieanalyse met restrictie-enzymvertering en bisulfietconversie. Deze methode genereert hoge-resolutie epigenetische data van kleine hoeveelheden DNA.

Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing voor de Beoordeling van DNA-methylatie bij Base Pair Resolutie

Meer video's verkennen