Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing voor de Beoordeling van DNA-methylatie bij Base Pair Resolutie

Het algemene doel van deze procedure is om sequencing-bibliotheken te genereren voor base pair-resolutie D-N-A-C-P-G, methylatie-analyse op basis van restrictie-enzymdigestie gecombineerd met cytosine door sulfaatconversie. Dit wordt bereikt door eerst MSP een restrictie-enzymdigestie van hoogwaardig DNA uit te voeren, gevolgd door eindherstel, een tailing en ligatie van gemethyleerde adapters. De volgende stap is het uitvoeren van sulfaatconversie op grootte-geselecteerde fragmenten na sulfaatconversie.

De fragmenten worden versterkt met behulp van PCR. De laatste stap is het uitvoeren van kwaliteitscontrole en sequencing, gevolgd door gegevensvisualisatie en -analyse. Uiteindelijk detecteert verbeterde gereduceerde representatie van bi sulfaat sequencing kwantitatieve base pair-resolutie van cytidine methylatiepatronen op CG-rijke genomische loci.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere DNA-methylatiemethoden, zoals microarrays, is dat het kleine hoeveelheden inputmateriaal kan gebruiken om D-N-A-C-P-G-methyleringsgegevens met base pair-resolutie en biologisch relevante sites te genereren. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we geïnteresseerd waren in het verkennen van epigenetische patronen buiten de regio's die in traditionele assays worden bedekt. We waren geïnteresseerd in de ontwikkeling van deze techniek om over te gaan van microarrays naar het genereren van DNA-methyleringsgegevens met base pair-resolutie die geïntegreerd kunnen worden met gegevens die gegenereerd worden door andere next-generation technieken.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van epigenetica. Bijvoorbeeld, epigenetisch patroon en heterogeniteit in biologische monsters vergeleken met normale controles of andere ziektetoestanden. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn bij deze methode het uitdagend vinden vanwege de lengte van de procedure, de talrijke specifieke vereisten en de unieke sequencingkarakteristieken van de gegenereerde bibliotheken van Mamie fall.

Een onderzoeksspecialist in ons lab zal assisteren bij het demonstreren van de procedure om dit protocol te starten. Eerst, bereid gezuiverde aliquoten van genomisch DNA-monsters voor die een MSP een restrictie-enzymdigestie hebben ondergaan, een blunt end herstelreactie en een enkele nucleotide toevoeging aan de drie prime-uiteinden. Op dit punt zullen de DNA-producten klaar zijn voor adapterligatie om te beginnen. Breng 10 microliter van het A-A-L-D-N-A-monster over in een 0,2 milliliter PCR-buis en plaats de buis op ijs.

Plaats bovendien een aliquot van de adaptermoleculen op ijs. Bereid vervolgens het ligatiereagensmengsel op ijs voor. Voeg zowel het ligatiereagens als de adaptermoleculen toe aan het DNA-monster en pipet om en om een paar keer om te mengen.

Plaats een PCR-buis in een thermische cycler en laat de ligatiereactie overnacht doorgaan bij 16 graden Celsius op de volgende dag. Zuiver de ligatieproducten met behulp van een magnetisch parel- of silicakolom gebaseerde vaste fase DNA-extractiekit. Bij de laatste stap van het zuiveringsproces.

Elueer het DNA door 30 microliter watervrij DNA toe te voegen. Het gezuiverde DNA-product kan worden bewaard bij min 20 graden Celsius totdat het nodig is voor monsters, die begonnen met de totale DNA van 25 nanogram of meer. Gebruik een geautomatiseerd gel-extractieapparaat zoals de PI en prep om te selecteren voor geligeerde producten met lengtes tussen 150 base paar en 400 base paar.

Zorg ervoor dat DNA-visualisatiekleuren zoals Ethereum bromide of cyber groen worden uitgesloten van de agros cassette omdat ze de DNA-migratie-eigenschappen van de gevorkte adaptergebonden fragmenten kunnen veranderen. Standaard agros gel-gebaseerde grootteselectieprotocollen kunnen ook worden gebruikt voor deze stap van het protocol om DNA-elektroforese op een pippin 2% kleurstof-vrije aros cassette op te zetten. Maak een nieuw protocol in de Pippin Prep console en selecteer de 2%DF marker L optie als de cassette van keuze.

Schakel vervolgens de optie voor het gebruik van interne standaarden in en controleer of het referentiebaannummer overeenkomt met de baannummers voor het isoleren van DNA-fragmenten variërend van 150 base paar en 400 base paar. Selecteer de bereikoptie als de verzamelmodus en voer de volgende limietparameters in: 135 voor base paar start 410 voor base paar einde en 240 voor base paar paws. Dit geeft het apparaat opdracht om het elektroforetische veld uit te lijnen met de elektro-elutie uitgangspoort.

Wanneer DNA-fragmenten binnen dat bereik zich in de buurt van de uitlaat bewegen. Na het opslaan van het protocolbestand, bereid de gelcassette en de monsterlaadputjes van het instrument voor door de standaard operationele procedures van Pippen Prep te volgen bij het opzetten van het instrument. Bereid de DNA-monsters voor op elektroforese door 10 microliter van de DNA-marker toe te voegen aan een 30 microliter aliquot van een gegeven post-ligatiemonster om de mengsels op de gelcassette te laden.

Verwijder eerst 40 microliter van het elektroforesebuffer uit elk monster. Vervang vervolgens het volume door elk 40 microliter monstermarkeringsmengsel in afzonderlijke putjes te pipetten. Keer terug naar de console, laad het opgeslagen protocol en druk op start om de elektroforese te starten.

Wanneer het programma de 240 base paar bereikt, onderbreek handmatig en verzamel 40 microliter van de uitlaat uit elke uitgangspoort met een pipet. Label deze fracties als de onderste bibliotheekfractie. Nadat de onderste bibliotheekfracties zijn verzameld, spoel de uitlaatpoorten onmiddellijk door 40 microliter vers elektroforesebuffer toe te voegen.

Pipet de buffer omhoog en omlaag minstens drie keer en zuig vervolgens het snet op. Herhaal deze wasbeurt nog twee keer om alle sporen van kortlengte DNA-soorten uit de uitlaten te verwijderen. Voeg nu 40 microliter elektroforesebuffer toe aan het monster.

Seal de elucia-poorten en druk op de knop om het elucia-proces te hervatten. Bij voltooiing van het Ellucian-programma op de 410 base paar-instelling, verzamel de 40 microliter van Inuit uit alle uitgangspoorten en label deze fracties als de bovenste bibliotheekfractie. Op dit punt zijn beide bibliotheekfracties gel-gezuiverd en al klaar voor bi sulfaatconv