Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

Het algemene doel van deze procedure is om rechtstreeks neurale stamcellen te induceren uit bloedcellen. Dit wordt bereikt door eerst CD 34-positieve hematopoietische voorlopercellen uit het bloed te verrijken. De tweede stap is om CD 34-cellen te transfecteren met sendi-virus dat transcriptionele factoren bevat.

Vervolgens worden de neurale stamcellen afgeleid met behulp van selectief medium. De laatste stap is om de geïnduceerde neurale stamcellen te differentiëren in neuronen, astroglia en oligodendrocyten. Uiteindelijk wordt immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om de resulterende cellen te karakteriseren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de duur van neuronen direct uit fibroblasten, ook IPS-generatie, is dat deze methode het vervelende proces van IPS-generatie en berekening omzeilt, maar toch een grote hoeveelheid neuronale cellen biedt die kunnen relateren en differentiëren tot neuronen. Ik had voor het eerst het idee voor deze methode toen ik merkte dat getransfecteerde gehechte CT 34-cellen eigenlijk heel vergelijkbaar zijn met primaire gekweekte neuroprogene cellen die aantonen dat de procedure zal zijn Marines, een technicus uit mijn leven. Na het isoleren van CD 34-cellen uit perifere bloedmononucleaire cellen volgens de instructies in het tekstprotocol, begint het proces van het kweken van de CD 34-cellen door Resus, het suspenderen van de CD 34-cellen in CD 34-medium en vervolgens de cellen in een 24-wellsplaat te zaaien bij drie keer 10 tot de vijfde cellen per well in één milliliter medium.

Na incubatie gedurende 24 uur in een 37 graden Celsius weefselkweekincubator met 5% koolstofdioxide, verzamel de zwevende cellen en centrifugeer de celsuspensie bij 110 keer G bij kamertemperatuur. Gooi vervolgens het supernatant weg en suspendeer de cellen opnieuw in vers CD 34-onderhoudsmedium. Zie een nieuwe 24-wellsplaat bij één keer 10 tot de vijfde cellen per well in één milliliter medium, incubeer bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide incubator gedurende vijf extra dagen, waarbij elk andere dag de helft van het medium wordt vervangen.

Door voorzichtig het bovenste helft van het supernatant af te zuigen terwijl de CD 34-cellen zich op de bodem van de wells bevinden, zoals hier op de vijfde dag wordt getoond. Na het plateren, verzamel CD 34-cellen en centrifugeer de cellen bij 170 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gooi het supernatant weg, suspendeer de cellen opnieuw zoals eerder en zaai een verse 24-wellsplaat bij één keer 10 tot de vijfde cellen per well in één milliliter medium. Ontdooi vervolgens een cyto tune IPS Sendi herprogrammeringskit.

Door eerst de bodems van de buizen 10 seconden in een 37 graden Celsius waterbad te dompelen en vervolgens volledig te ontdooien bij kamertemperatuur. Centrifugeer de buizen kort en leg ze op ijs. Bereid het Sendai-virusmengsel voor door het aanbevolen volume van elk virus vermeld op het certificaat van analyse voor de bijbehorende partij te mengen.

Een besmettingsmultipliciteit van 15 wordt aanbevolen. Voeg de Sendai-virusmix toe aan elk wel van CD 34-cellen. Meng vervolgens de wellen door voorzichtig het plaatje te schudden.

Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide incubator. Observeer de transductie-efficiëntie. Merk op dat celaggregaten en sferen zoals hier getoond indicatoren zijn van succesvolle transductie.

Vervolgens incubeer de cellen in de weefselkweekincubator gedurende vijf tot zeven dagen totdat gehechte cellen verschijnen en 30 tot 50% confluentie bereiken, zoals hier elke twee dagen wordt getoond. Vervang de helft van het medium door voorzichtig de bovenste helft van het medium over te brengen naar een andere well. Als celsferen worden overgebracht naar de nieuwe well, voeg dan een gelijke hoeveelheid vers medium toe.

Controleer de co fluentie van de cellen met behulp van de geïnverteerde microscoop. Wanneer de cellen 30 tot 50% confluent zijn, aspireer het supernatant en reserveer het en voeg vervolgens één milliliter neurale progenitormedium toe aan elke well om een back-upplaat te maken met behulp van de sferen in het supernatant centrifugeer, het reserve supernatant bij 170 keer G gedurende 10 minuten. Gooi vervolgens het supernatant weg en suspendeer het pellet in neurale progenitormedium en plateer in een matrigel-gecoate 24-wellsplaat.

Zoals eerder, vervang het medium in elke plaat met cellen om de andere dag totdat de cellen 60 tot 80% confluentie bereiken. Meestal na een week. Zodra de cellen de vereiste confluentie bereiken, aspireer het supernatant en voeg één milliliter neurale stamcelmedium toe aan elke well.

Dissocieer vervolgens de cellen door een celschraper te gebruiken, gevolgd door zeer voorzichtig pipetteren. Breng vervolgens de cellen over van één well van de 24-wellsplaat naar één well van een zes-wellsplaat.

Voeg nog een milliliter medium toe aan de well en na het herhalen van de procedure voor alle wellen, plaats de zes-wellsplaat in de 37 graden Celsius 5% koolstofdioxide incubator. Vervang het volledige volume medium om de andere dag totdat de cellen 60% confluentie bereiken, waarna dissocieer en ververs de cellen in een verhouding van één tot drie zoals net getoond om een portie ongedifferentieerde neurale stamcellen te bevriezen. Bereid eerst het stamcelbevriezingsmedium voor door 20% dimethylsulfoxide of DMSO toe te voegen aan het neurale stamcelmedium en plaats het op ijs.

Dissocieer vervolgens de cellen in de zes-wellsplaat. Gebruik een celschraper en voorzichtig pipetteren. Reserveer een aliquot van de suspensie voor een celtelling en centrifugeer vervolgens de cellen bij 170 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur terwijl de cellen draaien, tel de cellen in het aliquot van suspensie met behulp van een hemo, cytometer of geautomatiseerde celteller en bereken het volume medium dat nodig is om een celconcentratie van één keer 10 tot de zes cellen per milliliter te geven.