De bouw van het Cell gebaseerde neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) voor optische detectie van neurotransmitters

Het algemene doel van deze video is het beschrijven van de methodologie voor de constructie en het testen van celgebaseerde fluorescente neurotransmitter-reporters, oftewel CNiFERs, die kunnen worden gebruikt om de afgifte van specifieke neurotransmitters in vivo optisch te monitoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de neurowetenschappen met betrekking aan de timing en de afgifte van neuromodulatoren in de hersenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden aangepast voor elk type neurotransmitter of neuromodulator dat signalleert via GPCS.

Een regionale demonstratie van deze methode is nuttig. De in vivo injectie en daaropvolgende beeldvorming van CNiFERs zijn technisch uitdagend. Om met deze procedure te beginnen, zie de HEK293-cellen in een T-25 flask die de front-gebaseerde calciumdetector en chimere g-proteïne bevatten.

Kweek de cellen vervolgens in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2, totdat ze ongeveer 50% confluent zijn. Aspireer daarna het medium uit de T-25 flask. Voeg twee milliliter van het lentivirus-mediummengsel toe en incubeer de T-25 flask bij 37 °C en 5% CO2.

Oogst de volgende dag de geïnfecteerde HEK293-cellen door één milliliter trypsine toe te voegen. Resuspendeer vervolgens de celpellet in vijf milliliter HEK293-groeimedium. Zaai één milliliter cellen in een T-75 flask voor invriezen en opslag, en 1,5 milliliter cellen in een T-25 flask voor FACS-analyse.

Voor de agonistcurve met 10 punten, om de geïnfecteerde cellen te testen, zaait u de eerste twee rijen van een met fibronectine gecoate 96-wellplaat met 100 µL van de celsuspensie per well. Incubeer vervolgens de HEK293-cellen die groeien in een T-25 fles, een T-75 fles en een 96-wellplaat tot ze ongeveer 90% confluent zijn bij 37 °C met 5% CO2 gedurende één tot twee dagen. Bepaal vóór de FACS-analyse de functionele expressie van de GPCR door een drug-plaat voor te bereiden met 10 verschillende agonistconcentraties die rond de voorspelde EC 50 liggen.

Bereid verschillende concentraties agonist voor met behulp van een seriële verdunningsmethode en maak een sjabloon om de drugconcentraties bij te houden. Stel vervolgens de temperatuur van de platenlezer in op 37 °C. Programmeer daarna de fluorometrische 96-wells platenlezer voor het meten van FRET en het uitvoeren van oplossingsoverdrachten.

Voor het meten van FRET met de genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde calciumsensor TNXXL, stelt u de excitatiegolflengte in op 436 ± 4,5 nanometer. Stel vervolgens de emissiefilters en de cut-off filters in voor ECFP en citrine. Programmeer daarna de platenlezer om de emissies elke vier seconden te meten, gedurende een totale tijd van 180 seconden.

Kies de opties voor een plaatvolume van 100 µL, een pipet hoogte van 150 µL en de toevoeging van 50 µL own drug uit de drievoudige verbonden plaat. Stel het tijdstip voor de toediening van het geneesmiddel in op 30 seconden. Aspireer daarna het medium uit rij A en B, en voeg 100 µL ACSF toe aan de 96-well sniffer-plaat, die ongeveer 90% confluent is.

Plaats vervolgens de threefold drug plate en de 96-well sniffer plate in de platenlezer. Laat de platen 30 minuten equilibreren bij 37 °C voordat het programma wordt gestart. Exporteer na afloop van de meting in de platenlezer de fluorescentiewaarden naar een tekstbestand.

Importeer dit bestand vervolgens in een eerder gemaakt spreadsheet-sjabloon dat de fluorescentie-intensiteiten normaliseert naar de basislijnen vóór de stimulatie, de piek-FRET-ratio voor elke agonistconcentratie berekent en een dosis-responscurve genereert. Bereid de CNiFER-injectiepipet voor door een glazen capillair op een verticale elektrode-puller te plaatsen. Gebruik een pincet om de punt van de elektrode af te breken tot een diameter van ongeveer 40 micrometers.

Plaats een met ACSF verzadigde spons op een eerder gemaakte schedelwindow van twee bij drie millimeter bij een geanestheseerde muis, om het gebied vochtig te houden terwijl de cellen voor injectie worden voorbereid. Oogst vervolgens de CNiFER-kloon die in een T-75 fles is gekweekt tot ongeveer 80% confluentie. Aspireer het medium en was de cellen met steriele PBS.

Verwijder de PBS en gebruik 10 milliliter ACFS om de cellen van de bodem van de kolf los te maken. Triture vervolgens de cellen om de celklonters te dissociëren. Centrifugeer gedurende twee minuten in een celcultuurcentrifuge.

Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 100 µL ACSF. Centrifugeer vervolgens 30 seconden bij 1400 ×g en verwijder het supernatant, zodat er een pellet overblijft die bedekt is met ACSF. Vul daarna de injectiepipet opnieuw met minerale olie.

Plaats de pipet op een nano-injector. Breng vijf microliters CNiFER-cel-suspensie aan op een stripje plastic paraffinefolie nabij de muispreparaat. Zuig de CNiFER-cellen op in de uitgetrokken pipet.

Verplaats nu de pipet naar de doelcoördinaten voor x en y. Laat de pipetten zakken en doorboor de eerder geprepareerde dunne schedel. Ga door tot ongeveer 200 tot 400 micrometers onder het schedeloppervlak, in de tweede en derde laag van de cortex.

Injecteer 4,6 nanoliters CNiFER-cellen op de diepste plek met de nanoinjector. Let op de beweging in de interface tussen de olie en de cellen. Wacht vervolgens vijf minuten tot de cellen volledig zijn gedispergeerd.

Trek de pipet ongeveer 100 micrometers terug en injecteer opnieuw 4,6 nanoliters CNiFER-cellen en wacht wederom vijf minuten. Trek daarna de pipet langzaam en voorzichtig terug om terugstroom van de CNiFERs te voorkomen. Plaats bij deze procedure het beeldvormingsplatform met de gefixeerde muis onder een 10x waterimmersie-objectief in een tweefoton-microscoop.

Plaats de filterkubus voor FRET-imaging met een dichroïsche spiegel op 505 nanometers en banddoorlaatfilters van 460 nanometers tot 500 nanometers voor het meten van ECFP en van 520 nanometers tot 560 nanometers voor het meten van citrine. Voeg vervolgens ACSF toe aan de put met het uitgedunde schedelvenster en laat het 10x waterimmersie-objectief in de ACSF zakken. Gebruik het oculair in combinatie met de kwiklamp en de GFP-filterkubus om de CNiFERs te lokaliseren.

Schakel nu over naar het 40x waterimmersie-objectief. Selecteer vervolgens het juiste lichtpad voor tweefoton-imaging. Zet de nabij-infrarode femtoseconde-pulslaser aan.

Selecteer de golflengte van 820 nanometer en een vermogensinstelling van 5 tot 15%. Stel de spanning van pmt een en pmt twee in op een submaximale waarde, gewoonlijk 500-1000 volt, afhankelijk van de pmt. Stel vervolgens de gain in op één voor elk kanaal en zet de z-positie van het objectief op nul. Verlaag het objectief ongeveer 100 tot 200 micrometer vanaf het corticale oppervlak en start de xy-scan.

Pas de lasersterkte, gain en pmt-spanning voor elk kanaal aan om de signaal-ruisverhouding van de fluorescentie van de CNiFER te optimaliseren. Gebruik vervolgens de software om de beeldvorming te beperken tot een gebied dat de CNiFER-cellen bevat, evenals een achtergrondgebied. Selecteer de cowman-lijn, met een middeling over twee, voor een geschikte signaal-ruisverhouding, en gebruik een scansnelheid van 3 tot 1 Hz bij 4 µs per pixel.

Teken daarna een ROI rond de CNiFER-cellen, waarbij ongeveer drie tot vier cellen per vlak worden omsloten. Stel een real-time analyse in van de gemiddelde intensiteiten van de ROI.

Start vervolgens de acquisitie om de CNiFER-fluorescentie in de loop van de tijd te monitoren en begin met de elektrische stimulatie of het gedragsexperiment, terwijl de fret wordt gemonitord. In dit voorbeeld werd de fret-respons van D2R CNiFER gemeten op een plaatlezer met een systeem voor vloeistoftoevoer. Deze grafiek toont de fret-respons tijdens de toevoeging van dopamine aan D2 CNiFERs.

Let op dat de ECFP-emissie afneemt terwijl de citrine-emissie toeneemt bij aanwezigheid van dopamine. Hier is een plot van de overeenkomstige FRET-ratio. Hier worden de dosis-respons-curves getoond voor de respons van D2 CNiFERs op dopamine en op norepinefrine.

Daarnaast wordt de responsieve controle CNiFER zonder de D2R gepresenteerd. Deze staafgrafiek toont de FRET-ratio respons voor andere neurotransmitters en modulatoren bij 50 nano molar en één micro molar. Hier wekt elektrische stimulatie van DA-neuronen in de substantia nigra een grote verandering in de FRET-ratio teweeg voor D2 CNiFERs.

Let op hoe de amplitude van de respons toeneemt bij een toenemende intensiteit van de elektrische stimulatie. De koppeling van stimulatie met een cocaïne-injectie versterkt de CNiFER-respons. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u CNiFERs creëert, test en gebruikt voor in vivo imaging.

Gedurende de ontwikkeling van CNiFERs is het essentieel om steriele technieken toe te passen, aangezien deze cellen uiteindelijk in levende muizen zullen worden geïmplanteerd. De realisatie van CNiFERs biedt een belangrijk instrument voor onderzoekers in het veld van de neurowetenschappen om de afgifte van elke neurotransmitter of neuromodulator die signaleert via een G-eiwitgekoppelde receptor optisch te meten. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.