De bouw van het Cell gebaseerde neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) voor optische detectie van neurotransmitters In Vivo

Het algemene doel van deze video is om de methodologie te beschrijven voor de constructie en het testen van op cellen gebaseerde neurotransmitter fluorescente reporters, of CNiFERs, die kunnen worden gebruikt om de afgifte van specifieke neurotransmitters in vivo optisch te monitoren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de neurowetenschappen te beantwoorden over het tijdstip en de afgifte van neuromodulatoren in de hersenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden aangepast voor elk type neurotransmitter of neuromodulator, dat signalen door middel van GPCS.

Regionale demonstratie van deze methode is nuttig. Het is de in vivo injectie, en de daaropvolgende beeldvorming van CNiFERs zijn technisch uitdagend. Om deze procedure te beginnen, zie de HEK293 cellen die de front-based calcium detector en chimerische g-eiwit bevatten in een T-25 flacon.

Kweek vervolgens de cellen in een bevochtigde incubator, bij 37 graden Celsius, met vijf procent CO2, tot ongeveer 50%confluent. Daarna, aspireer het media uit de T-25 flacon. Voeg twee milliliter van de lenta virus media mix toe, en incubeer de T-25 flacon bij 37 graden Celsius, met 5%CO2.

De volgende dag, oogst de geïnfecteerde HEK293 cellen door een milliliter trypsine toe te voegen. Herstel vervolgens de cel pellet in vijf milliliter HEK293 groei media. Zaai een milliliter cellen in een T-75 flacon voor bevriezing en opslag, en 1,5 milliliter cellen in een T-25 flacon voor FACS analyse.

Voor de 10 punten agonistencurve, om de geïnfecteerde cellen te testen, zaai de eerste twee rijen van een fibronectine gecoate 96 well plate met 100 microliter van de cel suspensie per well. Bepaal vervolgens de functionele expressie van de GPCR door een drug plate voor te bereiden met 10 verschillende agonist concentraties die de voorspelde EC 50 omvatten. Vervolgens, incubeer de HEK293 cellen die groeien in een T-25 flacon, een T-75 flacon, en een 96 well plate tot ongeveer 90%confluent bij 37 graden Celsius met 5%CO2 gedurende een tot twee dagen.

Bereid verschillende concentraties van agonist voor met behulp van een seriële dilutiemetode, en creëer een sjabloon om de drug concentraties bij te houden. Stel vervolgens de plate reader temperatuur in op 37 graden Celsius. Programmeer vervolgens de 96 well fluorometrische plate reader voor het meten van fret, en het uitvoeren van oplossingsoverdrachten.

Voor het meten van fret met een genetisch gecodeerde fret-gebaseerde calcium sensor, TNXXL, stel de excitatiegolflengte in op 436 plus of min 4,5 nanometer. Stel vervolgens de emissiefilters en de cut off filters in voor ECFP en citrine. Programmeer vervolgens de plate reader om de emissie elke vier seconden te meten, voor een totaal van 180 seconden.

Kies de opties voor 100 microleader plate volume, 150 microliter pipet hoogte, en levering van 50 microliter drug van de drievoudige compound plate. Stel het tijdstip voor drug levering in op 30 seconden. Aspirant vervolgens het media uit rijen A en B, en voeg 100 microliter ACSF toe aan de 96 well sniffer plate, die ongeveer 90%confluent is.

Laad vervolgens de drievoudige drug plate en 96 well sniffer plate in de plate reader. Laat 30 minuten om de platen te gelijken bij 37 graden Celsius, voordat u het programma start. Exporteer na de plate reader run de fluorescentie reader waarden naar een tekstbestand.

Importeer vervolgens dit bestand naar een eerder gemaakte spreadsheet sjabloon die de fluorescentie intensiteiten normaliseert naar de pre-stimulus basislijnen, berekent de piek fret verhouding voor elke agonist concentratie, en genereert een dosisresponscurve. Bereid de CNiFER injectie pipet voor door een glazen capillair op een verticale elektrode puller te plaatsen. Gebruik een paar pincetten om het uiteinde van de elektrode te breken tot een diameter van ongeveer 40 micrometer.

Plaats een ACSF gedrenkte spons op een eerder gevormde twee bij drie millimeter dunne schedelvenster van een anesthetiseerde muis, om vochtig te blijven terwijl de cellen voor injectie worden voorbereid. Verzamel vervolgens de CNiFER kloon die in een T-75 flacon tot ongeveer 80%confluency is gegroeid. Aspireer het media, en was de cellen met steriel PBS.

Verwijder PBS, en gebruik 10 milliliter ACFS om de cellen los te maken van de bodem van de flacon. Trichcera vervolgens de cellen om de celklompjes te dissociëren. Centrifugeer gedurende twee minuten in een celcultuur centrifuge.

Verwijder het supernatant, en herstel de pellet in 100 microliter ACSF. Centrifugeer vervolgens gedurende 30 seconden bij 1400 keer G, en verwijder het supernatant, waardoor een pellet achterblijft, bedekt met ACSF. Vul vervolgens de injectie pipet met mineraal olie.

Laad de pipet op een nano injector. Plaats vijf microliter van de CNiFER cel suspensie op een strook van plastic paraffine film nabij de muis voorbereiding. Trek de CNiFER cellen op in de getrokken pipet.

Verplaats nu de pipet naar de doel x en y coördinaten. Laat de pipets zakken, en prik door het verdunde schedel, dat eerder is voorbereid. Ga door tot ongeveer 200 tot 400 micrometer onder het oppervlak van de schedel, in lagen twee en drie van de cortex.

Injecteer 4,6 nanoliter van CNiFER cellen op de diepste plaats met de nano injector. Let op beweging in het olie en cel interface. Wacht vervolgens vijf minuten voor de cellen om te dispenseren.

Trek de pipet ongeveer 100 micrometer terug en injecteer nogmaals 4,6 nanoliter van CNiFER cellen en wacht opnieuw vijf minuten. Trek vervolgens de pipet langzaam en voorzichtig terug om te voorkomen dat de CNiFERs terugstromen. Plaats in deze procedure het beeldvorming platform met de hoofdbeperkte muis onder een 10x water immersie objectief in een twee foton beeldvorming microscoop.

Plaats de filter kubus voor fret beeldvorming die een dichroische spiegel bij 505 nanometer heeft en band pass filters die 460 nanometer tot 500 nanometer overspannen voor het meten van ECFP en 520 nanometer tot 560 nanometer voor het meten van citrine. Voeg vervolgens ACSF toe aan de put, die