Name: De bouw van het Cell gebaseerde neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) voor optische detectie van neurotransmitters In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Leer de constructie van CNiFERs voor optische detectie van neurotransmitters in vivo met HEK293-cellen. Deze methode biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van neuromodulatordynamiek in het brein.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken B. Conklin (University of California, San Francisco) voor het verstrekken van de G qi5 en G qs5 cDNAs, A. Schweitzer voor hulp bij de elektronica, N. Taylor voor hulp bij het ​​screenen van klonen, Ian Glaaser en Robert Rifkin voor proeflezen en Olivier Griesbeck voor TN-XXL. Dit werk werd ondersteund door subsidies voor onderzoek door het Amerikaanse National Institute on Drug Abuse (NIDA) (DA029706; DA037170), het Nationaal Instituut voor Biomedische beeldvorming en Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) en de &quot;Neuroscience gerelateerd aan drugs &quot;training subsidie ​​door middel van NIDA (DA007315).

<ol><li>Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+vivo.+microdialysis+to+the+study+of+cholinergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems.</a> Methods. 23, 21-39 (2001).</li>
<li>Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+subsecond+dopamine+release+with+fast-scan+cyclic+voltammetry+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo.</a> Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Chemical+Neurotransmission+with+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors.</a> ACS Chem Neurosci. , (2015).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extrasynaptic+glutamate+dynamics+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+fluorescent+probe+for+visualizing+glutamate+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission.</a> Nat Methods. 10, 162-170 (2013).</li>
<li>Nguyen, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+biosensor+for+neurotransmitter+release+and+in+situ+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity.</a> Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).</li>
<li>Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+reporters+reveal+in+vivo+dynamics+of+dopamine+and+norepinephrine+release+in+murine+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex.</a> Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. , e3998(2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq%CE%B1+to+that+of+Gj%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).</li>
<li>Yamauchi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+ligand-gated+ion+channel+receptors+with+genetically+encoded+Ca2%2B+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors.</a> PLoS One. 6, e16519(2011).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+during+action+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation.</a> Nature. 494, 238-242 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De oprichting van CNiFERs een innovatieve en unieke strategie voor het optisch meten van afgifte van neurotransmitters in de hersenen in vivo. CNiFERs zijn ideaal voor het meten extrasynaptic afgifte, dat wil zeggen, volume geleiding voor neurotransmitters. Moet voor elk CNiFER bezit de eigenschappen van de natieve GPCR, die een fysiologische optisch meten van de veranderingen in niveaus van neurotransmitters in de hersenen. Tot op heden zijn CNiFERs gemaakt voor het detecteren van acetylcholine (M1-CN...

Om volledig te begrijpen hoe neuronen communiceren in de hersenen, is het noodzakelijk om een werkwijze voor de afgifte van neurotransmitters in vivo te meten. Er zijn verschillende gevestigde technieken voor het meten neurotransmitters in vivo. Een algemeen gebruikte techniek is microdialyse, waarin een canule in de hersenen is geplaatst en een kleine hoeveelheid cerebrospinale vloeistof wordt verzameld en geanalyseerd met behulp van hoge-prestatie vloeistofchromatografie en elektrochemische detectie 1. Microdialyse een ruimtelijke resolutie in de orde van enkele diameter van de sonde, bijvoorbeeld ~ 0,5 mm voor een 200 urn diameter microprobe. De tijdsresolutie van deze techniek is echter traag vanwege sampling intervallen die duren meestal ~ 5 min of meer 1. Bovendien zijn analyses niet in real-time. Een andere techniek is snel scannen cyclische voltammetrie (FSCV), die een koolstofvezel sonde die in de hersenen wordt ingevoegd gebruikt. FSCV heeft uitstekende temporale resolutie (subsecond), hoge gevoeligheid (nanomolair), en ruimtelijke resolutie met een diameter van de sonde van 5 tot 30 pm. Echter, FSCV beperkt tot zenders die een karakteristiek oxidatie en reductie profiel met spanning te produceren op een koolstofatoom potentiometrische probe 2. Een derde techniek om neurotransmitters te meten is rechtstreeks via genetisch-gecodeerde neurotransmitter (NT) biosensoren 3. Bij deze methode wordt een fusie-eiwit gevormd dat een ligand bindend domein een zender gekoppeld met een fluorescentie-energieoverdracht (FRET) gebaseerde paar fluoroforen 4 of 5 gepermuteerde GFP bevat. In tegenstelling tot de vorige twee werkwijzen worden deze biosensoren genetisch gecodeerde en tot expressie gebracht op het oppervlak van een gastheercel, zoals een neuron, door de productie van transgene dieren of acuut bij gebruik van virale middelen om cellen te infecteren. Tot op heden zijn genetisch gecodeerd biosensoren is alleen ontwikkeld voor detecting glutamaat en GABA 3-5. Beperkingen met deze technieken de lage gevoeligheid, in het nM bereik, en het onvermogen om de detectie uit te breiden naar het grote aantal zenders, bijvoorbeeld klassieke neurotransmitters, neuropeptiden en neuromodulators, welk signaal door middel van G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR&#39;s) zijn. In feite, zijn er bijna 800 GPCRs in het menselijk genoom. Om deze tekortkomingen aan te pakken, hebben we een innovatief hulpmiddel om optisch maatregel vrijkomen van neurotransmitter die door middel van een GPCR signaleert ontwikkeld. CNiFERs (cell-based neurotransmitter fluorescente reporters gemanipuleerde) zijn klonale HEK293 cellen ontworpen om een specifieke GPCR dat, wanneer gestimuleerd, veroorzaakt een toename van intracellulaire [Ca2 +] die wordt gedetecteerd door een genetisch gecodeerde FRET gebaseerde Ca2 + sensor drukken, TN-XXL. Aldus CNiFERs transformeren neurotransmitter receptor binding in een verandering in fluorescentie, een directe en real-time optische read-out van de lokale neurotransmitter activiteit. Door gebruikmaking van de natuurlijke receptor voor een bepaalde neurotransmitter, CNiFERs behouden chemische specificiteit, affiniteit en temporele dynamiek van het endogeen tot expressie receptoren. Tot op heden zijn er drie soorten CNiFERs, één voor het detecteren van acetylcholine met de M1 receptor, één voor het detecteren van dopamine aangemaakt met de D2-receptor en één voor het detecteren van norepinefrine met de receptor α1a 6,7. De CNiFER technologie is gemakkelijk uitbreidbaar is, waardoor het vatbaar voor elk type GPCR. In dit artikel Jupiter beschrijven we en illustreren de werkwijze voor het ontwerpen, realiseren en testen in vivo CNiFERs voor elke toepassing.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&nbsp;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>Cloning: voor het genereren van lentivirus</td></tr><tr><td>12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um Falcon cell strainers</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 Well Plate, flat bottom, clear&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3596</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 well cell culture plates&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux black clear bottom&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Flexstation pipet tips</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Acetylcholine Chloride&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2661</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Norepinephrine&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Dopamine Hydrochloride&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Histamine&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Glutamate&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Epinephrine&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Somatostatin&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&nbsp;</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Substance P&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Melatonin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Fluorescence Plate Reader &amp; software</td><td>Molecular Devices</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp;DMEM (high glucose) with Glutamax&nbsp;&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Weefselkweek</td></tr><tr><td>&nbsp;Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139</td><td>Weefselkweek</td></tr><tr><td>&nbsp;Pen/Strep&nbsp; antibiotics</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Weefselkweek</td></tr><tr><td>&nbsp;Puromycin&nbsp;&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>Weefselkweek</td></tr><tr><td>&nbsp;Fibronectin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Weefselkweek</td></tr><tr><td>CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td><td>Weefselkweek</td></tr><tr><td>cyanoacrylate glue&nbsp;</td><td>Loctite</td><td>Loctite no. 495</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>plastic paraffin film&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Parafilm&reg;</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Nanoinjector</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Glass electrodes</td><td>Drummond</td><td>3-000-203G</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>hand held drill</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Burrs for drill</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05; 19007-07)</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Sterilizing bath</td><td>FST</td><td>18000-45, Hot Bead Sterilizer</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>isoflurane chamber/mask</td><td>Highland Medical Equipment</td><td>564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>3D scope with arm</td><td>Zeiss</td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>fiber optic light</td><td></td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td></td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>70 % (v/v) isopropyl alcohol</td><td></td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Prep Pads</td><td>dynarex</td><td>1108</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>NaCl 0.9% (injectie, USP, 918610)</td><td></td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>CYCLOSPORINE (INJECTIE, USP)</td><td></td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Buprenex (injectie) buprenorphine (0,03 &mu;g per g knaagdier)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Surgifoam</td><td>Ethicon</td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Grip dental cement</td><td>Dentsply</td><td>#675571, 675572</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Instant SuperGlue&nbsp;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C&amp;B</td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>no. 0 cover glass</td><td>Fisher</td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>stereotaxic frame&nbsp;</td><td>Kopf</td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Rectal probe and heating pad</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>optical breadboard for imaging</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Fisher</td><td>S55667</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Kwik-Cast (Silicone elastomer)</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Suture&nbsp;&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>18&rsquo;&rsquo;, 1667, 4-0</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>chirurgie en stereotactische injectie</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-30;

de bouw van het cell gebaseerde neurotransmitter fluorescent engineered reporters (cnifers) voor optische detectie van neurotransmitters<em&gt; in vivo</em

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Celgebaseerde neurotransmitter fluorescente reporters gemanipuleerd (CNiFERs) een nieuw instrument voor neurologen optisch detecteren van de afgifte van neurotransmitters in de hersenen in vivo. Een specifieke CNiFER werd uit een humane embryonale niercellijn die stabiel tot expressie brengt een specifieke G-eiwit gekoppelde receptor, die paren Gq / 11 G-eiwitten, en een op FRET gebaseerde Ca2 + -detector, TN-XXL. Activering van de receptor leidt tot een verhoging van het FRET signaal. CNiFERs hebben nM gevoeligheid en een temporele respons seconden omdat CNiFER kloon maakt gebruik van de natuurlijke receptor voor een bepaalde neurotransmitter, bijvoorbeeld D2R voor dopamine. CNiFERs worden direct geïmplanteerd in de hersenen, waardoor zij neurotransmitter afgifte zin met een ruimtelijke resolutie van minder dan honderd micrometer, waardoor ze ideaal volume transmissie in vivo meten. CNiFERs kan ook worden gebruikt om andere middelen te onderzoeken op mogelijke kruisreactiviteit in vivo. We hebben onlangs breidde de familie van CNiFERs om GPCR&#39;s omvatten die koppelen aan G i / o G-eiwitten. CNiFERs zijn beschikbaar voor het detecteren van acetylcholine (ACh), dopamine (DA) en norepinefrine (NE). Aangezien elke GPCR kan worden gebruikt om een ​​nieuwe maken CNiFER en dat er ongeveer 800 GPCRs in het menselijk genoom beschrijven we hier de algemene procedure voor het ontwerpen, realiseren en testen elk type CNiFER.

Een CNiFER is afgeleid van een humane embryonale niercellen (HEK293) cellen die is ontworpen om ten minste twee eiwitten stabiel tot expressie: een specifieke G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) en een genetisch gecodeerd [Ca2 +] opnemer, TN-XXL. TN-XXL ondergaat fluorescentie-energieoverdracht (FRET) tussen cyaan en geel fluorescerende eiwitten, eCFP en citroengeel, respectievelijk, in reactie op Ca2 + -ionen 6,15. Activering van GPCR&#39;s die endogeen <...

We presenteren een protocol om op cellen gebaseerde neurotransmitter fluorescerende engineered reporters (CNiFERs) te creëren voor de optische detectie van volumetrische neurotransmitter release.

De bouw van het Cell gebaseerde neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) voor optische detectie van neurotransmitters<em&gt; In Vivo</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

Het algemene doel van deze video is het beschrijven van de methodologie voor de constructie en het testen van celgebaseerde fluorescente neurotransmitter-reporters, oftewel CNiFERs, die kunnen worden gebruikt om de afgifte van specifieke neurotransmitters in vivo optisch te monitoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de neurowetenschappen met betrekking aan de timing en de afgifte van neuromodulatoren in de hersenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden aangepast voor elk type neurotransmitter of neuromodulator dat signalleert via GPCS.Een regionale demonstratie van deze methode is nuttig. De in vivo injectie en daaropvolgende beeldvorming van CNiFERs zijn technisch uitdagend. Om met deze procedure te beginnen, zie de HEK293-cellen in een T-25 flask die de front-gebaseerde calciumdetector en chimere g-proteïne bevatten.Kweek de cellen vervolgens in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2, totdat ze ongeveer 50% confluent zijn. Aspireer daarna het medium uit de T-25 flask. Voeg twee milliliter van het lentivirus-mediummengsel toe en incubeer de T-25 flask bij 37 °C en 5% CO2.Oogst de volgende dag de geïnfecteerde HEK293-cellen door één milliliter trypsine toe te voegen. Resuspendeer vervolgens de celpellet in vijf milliliter HEK293-groeimedium. Zaai één milliliter cellen in een T-75 flask voor invriezen en opslag, en 1,5 milliliter cellen in een T-25 flask voor FACS-analyse.Voor de agonistcurve met 10 punten, om de geïnfecteerde cellen te testen, zaait u de eerste twee rijen van een met fibronectine gecoate 96-wellplaat met 100 µL van de celsuspensie per well. Incubeer vervolgens de HEK293-cellen die groeien in een T-25 fles, een T-75 fles en een 96-wellplaat tot ze ongeveer 90% confluent zijn bij 37 °C met 5% CO2 gedurende één tot twee dagen. Bepaal vóór de FACS-analyse de functionele expressie van de GPCR door een drug-plaat voor te bereiden met 10 verschillende agonistconcentraties die rond de voorspelde EC 50 liggen.Bereid verschillende concentraties agonist voor met behulp van een seriële verdunningsmethode en maak een sjabloon om de drugconcentraties bij te houden. Stel vervolgens de temperatuur van de platenlezer in op 37 °C. Programmeer daarna de fluorometrische 96-wells platenlezer voor het meten van FRET en het uitvoeren van oplossingsoverdrachten.Voor het meten van FRET met de genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde calciumsensor TNXXL, stelt u de excitatiegolflengte in op 436 ± 4,5 nanometer. Stel vervolgens de emissiefilters en de cut-off filters in voor ECFP en citrine. Programmeer daarna de platenlezer om de emissies elke vier seconden te meten, gedurende een totale tijd van 180 seconden.Kies de opties voor een plaatvolume van 100 µL, een pipet hoogte van 150 µL en de toevoeging van 50 µL own drug uit de drievoudige verbonden plaat. Stel het tijdstip voor de toediening van het geneesmiddel in op 30 seconden. Aspireer daarna het medium uit rij A en B, en voeg 100 µL ACSF toe aan de 96-well sniffer-plaat, die ongeveer 90% confluent is.Plaats vervolgens de threefold drug plate en de 96-well sniffer plate in de platenlezer. Laat de platen 30 minuten equilibreren bij 37 °C voordat het programma wordt gestart. Exporteer na afloop van de meting in de platenlezer de fluorescentiewaarden naar een tekstbestand.Importeer dit bestand vervolgens in een eerder gemaakt spreadsheet-sjabloon dat de fluorescentie-intensiteiten normaliseert naar de basislijnen vóór de stimulatie, de piek-FRET-ratio voor elke agonistconcentratie berekent en een dosis-responscurve genereert. Bereid de CNiFER-injectiepipet voor door een glazen capillair op een verticale elektrode-puller te plaatsen. Gebruik een pincet om de punt van de elektrode af te breken tot een diameter van ongeveer 40 micrometers.Plaats een met ACSF verzadigde spons op een eerder gemaakte schedelwindow van twee bij drie millimeter bij een geanestheseerde muis, om het gebied vochtig te houden terwijl de cellen voor injectie worden voorbereid. Oogst vervolgens de CNiFER-kloon die in een T-75 fles is gekweekt tot ongeveer 80% confluentie. Aspireer het medium en was de cellen met steriele PBS.Verwijder de PBS en gebruik 10 milliliter ACFS om de cellen van de bodem van de kolf los te maken. Triture vervolgens de cellen om de celklonters te dissociëren. Centrifugeer gedurende twee minuten in een celcultuurcentrifuge.Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 100 µL ACSF. Centrifugeer vervolgens 30 seconden bij 1400 ×g en verwijder het supernatant, zodat er een pellet overblijft die bedekt is met ACSF. Vul daarna de injectiepipet opnieuw met minerale olie.Plaats de pipet op een nano-injector. Breng vijf microliters CNiFER-cel-suspensie aan op een stripje plastic paraffinefolie nabij de muispreparaat. Zuig de CNiFER-cellen op in de uitgetrokken pipet.Verplaats nu de pipet naar de doelcoördinaten voor x en y. Laat de pipetten zakken en doorboor de eerder geprepareerde dunne schedel. Ga door tot ongeveer 200 tot 400 micrometers onder het schedeloppervlak, in de tweede en derde laag van de cortex.Injecteer 4,6 nanoliters CNiFER-cellen op de diepste plek met de nanoinjector. Let op de beweging in de interface tussen de olie en de cellen. Wacht vervolgens vijf minuten tot de cellen volledig zijn gedispergeerd.Trek de pipet ongeveer 100 micrometers terug en injecteer opnieuw 4,6 nanoliters CNiFER-cellen en wacht wederom vijf minuten. Trek daarna de pipet langzaam en voorzichtig terug om terugstroom van de CNiFERs te voorkomen. Plaats bij deze procedure het beeldvormingsplatform met de gefixeerde muis onder een 10x waterimmersie-objectief in een tweefoton-microscoop.Plaats de filterkubus voor FRET-imaging met een dichroïsche spiegel op 505 nanometers en banddoorlaatfilters van 460 nanometers tot 500 nanometers voor het meten van ECFP en van 520 nanometers tot 560 nanometers voor het meten van citrine. Voeg vervolgens ACSF toe aan de put met het uitgedunde schedelvenster en laat het 10x waterimmersie-objectief in de ACSF zakken. Gebruik het oculair in combinatie met de kwiklamp en de GFP-filterkubus om de CNiFERs te lokaliseren.Schakel nu over naar het 40x waterimmersie-objectief. Selecteer vervolgens het juiste lichtpad voor tweefoton-imaging. Zet de nabij-infrarode femtoseconde-pulslaser aan.Selecteer de golflengte van 820 nanometer en een vermogensinstelling van 5 tot 15%. Stel de spanning van pmt een en pmt twee in op een submaximale waarde, gewoonlijk 500-1000 volt, afhankelijk van de pmt. Stel vervolgens de gain in op één voor elk kanaal en zet de z-positie van het objectief op nul. Verlaag het objectief ongeveer 100 tot 200 micrometer vanaf het corticale oppervlak en start de xy-scan.Pas de lasersterkte, gain en pmt-spanning voor elk kanaal aan om de signaal-ruisverhouding van de fluorescentie van de CNiFER te optimaliseren. Gebruik vervolgens de software om de beeldvorming te beperken tot een gebied dat de CNiFER-cellen bevat, evenals een achtergrondgebied. Selecteer de cowman-lijn, met een middeling over twee, voor een geschikte signaal-ruisverhouding, en gebruik een scansnelheid van 3 tot 1 Hz bij 4 µs per pixel.Teken daarna een ROI rond de CNiFER-cellen, waarbij ongeveer drie tot vier cellen per vlak worden omsloten. Stel een real-time analyse in van de gemiddelde intensiteiten van de ROI.Start vervolgens de acquisitie om de CNiFER-fluorescentie in de loop van de tijd te monitoren en begin met de elektrische stimulatie of het gedragsexperiment, terwijl de fret wordt gemonitord. In dit voorbeeld werd de fret-respons van D2R CNiFER gemeten op een plaatlezer met een systeem voor vloeistoftoevoer. Deze grafiek toont de fret-respons tijdens de toevoeging van dopamine aan D2 CNiFERs.Let op dat de ECFP-emissie afneemt terwijl de citrine-emissie toeneemt bij aanwezigheid van dopamine. Hier is een plot van de overeenkomstige FRET-ratio. Hier worden de dosis-respons-curves getoond voor de respons van D2 CNiFERs op dopamine en op norepinefrine.Daarnaast wordt de responsieve controle CNiFER zonder de D2R gepresenteerd. Deze staafgrafiek toont de FRET-ratio respons voor andere neurotransmitters en modulatoren bij 50 nano molar en één micro molar. Hier wekt elektrische stimulatie van DA-neuronen in de substantia nigra een grote verandering in de FRET-ratio teweeg voor D2 CNiFERs.Let op hoe de amplitude van de respons toeneemt bij een toenemende intensiteit van de elektrische stimulatie. De koppeling van stimulatie met een cocaïne-injectie versterkt de CNiFER-respons. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u CNiFERs creëert, test en gebruikt voor in vivo imaging.Gedurende de ontwikkeling van CNiFERs is het essentieel om steriele technieken toe te passen, aangezien deze cellen uiteindelijk in levende muizen zullen worden geïmplanteerd. De realisatie van CNiFERs biedt een belangrijk instrument voor onderzoekers in het veld van de neurowetenschappen om de afgifte van elke neurotransmitter of neuromodulator die signaleert via een G-eiwitgekoppelde receptor optisch te meten. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

construction-cell-based-neurotransmitter-fluorescent-engineered

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Met de groeiende belangstelling voor stamceltherapieën, moleculaire imaging technieken zijn ideaal voor de bewaking stamceltransplantatie gedrag na transplantatie. Luciferase reporter genen hebben ingeschakeld non-invasieve, repetitieve evaluatie van de overleving van de cel, de locatie en de proliferatie in vivo. Deze video zal laten zien hoe je hESC proliferatie track in een levende muis.

In vitro en in vivo bioluminescente reportergen-beeldvorming van menselijke embryonale stamcellen

We hebben een nieuwe techniek van het kwantificeren van nicotine acetylcholine receptor veranderingen binnen subcellulaire regio's van specifieke subtypes van CNS neuronen beter de mechanismen van de nicotine verslaving te begrijpen met behulp van een combinatie van benaderingen waaronder fluorescerend eiwit tagging van de receptor met behulp van de knock-in aanpak en spectrale confocale beeldvorming.

Spectrale confocale beelden van de fluorescent gelabeld nicotinereceptoren in de knock-in muizen met chronische Nicotine Administratie

Source: Lacin, E., et al. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a technique for imaging neurotransmitter release in vivo using cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs), specialized reporter cells pre-injected into the mouse cortex. Positioned under a two-photon microscope, the mouse allows visualization of...

Imaging Neurotransmitter Release Using Cell-Based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters

Met zijn kleine transparante lichaam, goed gedocumenteerde neuroanatomie en een groot aantal vatbaar genetische technieken en...

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

Hier presenteren we een nieuwe Ca 2+ -Imaging aanpak met behulp van een bioluminescente reporter. Deze benadering maakt gebruik van een gefuseerde construct GFP-aequorine dat bindt aan Ca2 + en licht emitteert, waardoor de noodzaak voor excitatie licht. Aanzienlijk deze methode maakt het mogelijk lange doorlopende beeldvorming, de toegang tot diepe hersenstructuren en hoge tijdsresolutie.

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

Deze nieuw ontwikkelde fluorescentie gebaseerde technologie kan op lange termijn van de transcriptie van de circadiane klok genen in de suprachiasmatic kern (SCN) vrij bewegen muizen in real time en met een hoge temporele resolutie.

In Vivo Controle van de circadiane klok genexpressie in de muis Suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding calcium signalering bij populaties van individuele celtypes op de lymfkliertest motorische eindplaat.

Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Met behulp van transgene fluorescerende muizen worden gedetailleerde protocollen beschreven om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in motorische en sensorische axonen van de intacte heupzenuw bij levende dieren te beoordelen.

Uitbreiding van de toolkit voor in vivo beeldvorming van axonaal transport

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Leer de constructie van CNiFERs voor optische detectie van neurotransmitters in vivo met HEK293-cellen. Deze methode biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van neuromodulatordynamiek in het brein.

De bouw van het Cell gebaseerde neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) voor optische detectie van neurotransmitters In Vivo (Video) | JoVE Journal

De bouw van het Cell gebaseerde neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) voor optische detectie van neurotransmitters

Meer video's verkennen