De Algemene Vergadering en de toepassing van 'Shear Rings': A Novel endotheliale Model voor Orbital, Unidirectionele en Periodieke Fluid Flow en Shear Stress
31 oktober 2016
Verschillende niveaus en patronen van vloeistofschuifspanning zijn bekend om hun modulatie van endothèle genexpressie, fenotype en gevoeligheid voor ziekten. We bespreken de samenstelling en het gebruik van'schuifringen': een model dat unidirectionele, periodieke schuurspanningspatronen produceert. Schuifringen zijn eenvoudig te assembleren, economisch en kunnen hoge celopbrengsten produceren.
Het algemene doel van dit model is het creëren van een eenvoudige en economische methode voor in vitro studies naar periodieke vloeistofstroom en schuifspanning op endotheelcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de endotheelcelphysiologie, zoals de vraag hoe periodieke schuifspanning de vorm, structuur en werking van endotheelcellen beïnvloedt.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er gebruik wordt gemaakt van een eenvoudig geassembleerd weefselkweekapparaat, dat relatief grote oppervlakken biedt voor de evaluatie van cellulaire responsen. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door dhr. Luke White, een medicus in mijn laboratorium. Begin deze procedure door presentatiesoftware te gebruiken om een sjabloon voor de constructie van een shear ring te maken, met een buitenprofiel van 150 millimeter en een interne diameter van 100 millimeter in het midden van de cirkel van 150 millimeter.
Print het sjabloon op een vel wit A4-papier. Pipetteer, terwijl u in een zuurkast met adequate ventilatie werkt en handschoenen draagt, 10 millimeter methyleenchloride in een glazen Petrischaal van 150 millimeter. Het is essentieel dat de schaal van glas is, aangezien methyleenchloride de meeste kunststoffen oplost.
Plaats een plastic Petrischaal van 150 millimeter op het buitenste afschuifsjabloon. Gebruik een rotary tool om een gat van 3 millimeter in het midden van een schaal van 100 millimeter te boren. Verwijder alle plastic spanen die bij het boren zijn ontstaan.
Houd de Petri-schaal van 100 millimeter met een handschoen vast, keer deze om en doop de bovenrand van de schaal gedurende ongeveer drie seconden in het bad met methyleenchloride. Laat het overtollige methyleenchloride van de schaal van 100 millimeter afdruppelen en plaats vervolgens snel de bevochtigde rand van de schaal op het centrum van de schaal van 150 millimeter. Lijn de schaal van 100 millimeter zorgvuldig uit op de gemarkeerde mal.
Draai de schaal van 100 millimeter voorzichtig een paar keer met de klok mee en tegen de klok in om een goede hechting aan de schaal van 150 millimeter te garanderen. Zodra het methyleenchloride is opgedroogd, worden de nieuw verbonden petrischalen omgedraaid en worden de contactpunten zorgvuldig geïnspecteerd. Als er geen volledige, nauwe afsluiting is gevormd, wordt er met een transferpipet 0,5 milliliter methyleenchloride door het gat van 3 millimeter geïnjecteerd.
Pak de schaal op en draai deze voorzichtig zodat het methyleenchloride de rand bereikt. Nadat is vastgesteld dat er een nauwe afsluiting is gevormd tussen de twee Petrischalen, wordt het gat in de schaal van 100 millimeter afgedicht door een kraal van 3 millimeter siliconenkit aan te brengen. Snijd met een multitool voorzien van een platte snijkop het bovenste gedeelte van 3 centimeter van een conische polystyreen kweekbuis van 15 millimeter af, waarbij ten minste één centimeter van de buis onder de dop overblijft.
Gebruik de vlakke zijde van de snijkop om de rand van de afgesneden buis te polijsten tot deze glad en vlak is. Verwijder alle plastic schilfers die door het slijpen zijn ontstaan. Trek met een markeerpen de omtrek van de afgesneden 15 milliliter concole buis over op het deksel van de 150 millimeter schaal, ongeveer 0,5 centimeter vanaf de rand van de schaal.
Boor een gat binnen de getekende cirkel, waarbij een marge van ongeveer één tot twee millimeter vanaf de rand van de cirkel wordt gelaten. Plaats de afgeknipte bovenkant van de conicale buis over het geboorde gat. Breng met een transferpipet ongeveer een kwart milliliter, of 250 µL methylenechloride aan op de afgeknipte randen van de conicale buis om de conicale buis aan het 150 millimeter deksel te hechten.
Sluit tot slot het 150 millimeter deksel op de 150 millimeter schaal door een een millimeter dikke kraal siliconenkit rond de binnenrand van de bovenste petrischaal aan te brengen. Een schema van een geassembleerde afdichtring wordt getoond. De blauwe kleur stelt het gebied met geplaatteleerde endotheelcellen voor.
De buitenste en binnenste rode pijlen geven de orbitale beweging aan van de shear ring en het medium binnen de shear ring wanneer deze op een orbitale schudmachine wordt geplaatst. Bereid de sterilisatie voor door ongeveer 10 milliliter PBS via de poort van de 15 milliliter conische buis in de nieuw gevormde shear ring te pipetteren. Draai voorzichtig om eventuele resten in de shear ring te verwijderen.
Verwijder de PBS met een Pasteurpipet en een vacuümaspirator. Herhaal het wassen met PBS totdat al het debris is verwijderd. Om de afschuifring te steriliseren, wordt een combinatie van spoelen met 70% ethanol en UV-bestraling gebruikt.
Draai de geventileerde dop los, pipetteer ongeveer 10 milliliters 70% ethanol via de toegangspoort en draai de dop weer vast. Draai en kantel de sear-ring meerdere keren om er zeker van te zijn dat de binnenkant van de sear-ring grondig is gewassen. Aspireer het overtollige 70% ethanol onder een weefselkweekkap.
Sproei de toegangspoort en de dop grondig in met 70% ethanol met behulp van een plantenspuit. Plaats vervolgens de shearring en de dop onder UV-straling in de weefselkweekkap tot ze volledig droog zijn. Schroef de dop weer vast zodra de shearring droog is.
Bewaar de gesteriliseerde shear-ringen bij kamertemperatuur tot ze worden gebruikt voor het uitplaten van cellen. Ter voorbereiding op een studie naar schuifspanning moeten endotheliale cellen eerst in gesteriliseerde shear-ringen worden geplaatst volgens het standaardprotocol voor celkweek. Laat de cultuur confluent worden voordat de stroomstudies worden gestart.
Wanneer de cellen confluency hebben bereikt, worden de experimentele shear rings op een orbital shaker geplaatst die op de onderste plank in de incubator staat om plankstress en vibraties te minimaliseren. Plaats de shear rings van de statische controlegroep in dezelfde incubator. Laat de shear rings voor de gewenste duur van de toepassing van shear stress op de shaker staan.
Nadat de cellagen gedurende de gewenste tijd aan schuifspanning zijn blootgesteld, worden de schuifringen uit de incubator gehaald. Verwijder het deksel van de schuifring en neem de cellen en/of het medium op voor de gewenste eindpuntanalyse. Let op dat onderzoekers na het openen van de schuifringen de cellen en het medium voor analyse op verschillende manieren kunnen oogsten.
Hier worden representatieve resultaten getoond van het uiterlijk van humane CMEC D3 hersenendotheelcellagen in shear rings na 48 uur periodieke vloeistofshear of statische blootstelling; er werd waargenomen dat de uitlijning van de cultuur niet altijd parallel loopt aan de door de pijlen aangegeven stroomrichting. Enkele reacties op periodieke shear worden getoond in Rat Retinale Microvasculaire Endotheelcellagen. 72 uur periodieke vloeistofshear in shear rings resulteerde in een significante vermindering van Platelet-endothelial cell adhesion molecule ten opzichte van de Beta-actine loading control.
Zodra men de methode beheerst, kunnen er in ongeveer drie uur meerdere shear rings worden geconstrueerd, mits dit correct wordt uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de binnenschaal zorgvuldig uit te lijnen met de buitenschaal, zodat er een nauwe afsluiting tussen beide ontstaat. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe shear rings te construeren en te gebruiken als eenvoudige methode om In Vitro periodieke vloeistofstroom- en schuifspanningsstudies uit te voeren op endotheelcellen. Vergeet niet dat werken met methyleenchloride gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het werken onder een zuurkast bij stappen waar dit vereist is.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een model dat bekendstaat als 'shear rings', waarmee unidirectionele, periodieke afschuifspanningspatronen worden gegenereerd om endotheelcellen te bestuderen. De methode is eenvoudig, voordelig en levert hoge celaantallen op, wat onderzoek naar de fysiologie van endotheelcellen faciliteert.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Fysiologie van endotheelcellen
- Fluïdische schuifspanning
- In vitro modellen
Achtergrond
- Fluïde schuifspanning beïnvloedt de genexpressie van endotheelcellen en de vatbaarheid voor ziekten.
- Het begrijpen van de effecten van schuifspanning is cruciaal voor de vasculaire biologie.
- Huidige methoden kunnen tekortschieten in efficiëntie of complexiteit.
- Shear rings bieden een nieuwe benadering om deze effecten te bestuderen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een kosteneffectieve methode voor het bestuderen van periodieke vloeistofstroming.
- Het onderzoeken van de invloed van periodieke afschuifspanning op de morfologie en functie van endotheelcellen.
- Het verbeteren van het inzicht in de reacties van het endotheel op mechanische stimuli.
Gebruikte methoden
- Assemblage van een sjabloon voor de constructie van een afschuifring.
- Gebruik van een weefselkweekapparaat voor evaluatie van grote oppervlakken.
- Toepassing van periodieke vloeistofstroom op endotheelcellen.
- Demonstratie van de procedure door een medicijnstudent.
Belangrijkste Resultaten
- Afschuifringen produceren effectief gecontroleerde afschuifspanningspatronen.
- De methode maakt een significante evaluatie van de cellulaire respons mogelijk.
- Met deze techniek zijn hoge celopbrengsten haalbaar.
- Periodieke afschuiving beïnvloedt de vorm en functie van endotheliale cellen.
Conclusies
- Shear-ringen zijn een waardevol instrument voor endotheliaal onderzoek.
- Dit model kan het begrip van de endotheliale fysiologie vergroten.
- Toekomstige studies kunnen deze methode inzetten voor diverse toepassingen.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Management
De reacties van endotheelcellen op periodieke schuifspanning zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van vasculaire pathofysiologie en het identificeren van mechanosensitieve drugtargets. Het shear ring-model biedt een schaalbaar, reproduceerbaar in vitro systeem dat high-throughput evaluatie van endotheel-fenotypes onder gecontroleerde hemodynamische omstandigheden mogelijk maakt. Dit ondersteunt de targetvalidatie en mechanistische risicoanalyse in cardiovasculaire ontdekkingsprogramma's door vloeistofstroomdynamiek te koppelen aan moleculaire read-outs.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om endotheliale mechanotransductiepaden te onderzoeken onder fysiologische shear-patronen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de functionele validatie van shear-responsieve targets met behulp van kwantificeerbare adhesie- en aligneringsfenotypen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert fenotypische screening van verbindingen die endotheliale reacties op periodieke stroming moduleren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Biedt een gestandaardiseerd platform met een groot oppervlak voor een consistente vorming van endotheliale monolagen.
- Schaalbaarheid: Maakt de generatie van meerdere replica's mogelijk voor dosis-respons- en tijdverloopstudies onder orbitale schuifspanning.
- Kwantitatieve output: Maakt de meting van schuifspanningsafhankelijke veranderingen in de expressie van adhesiemoleculen tussen bloedplaatjes en endotheel mogelijk als functionele readout.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert pathofysiologische schuifspanningscondities die betrokken zijn bij vasculaire inflammatie en trombose.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en in vivo endothele dysfunctie via meetbare biomarkers zoals PECAM-1 downregulatie.
- Mechanische risicoreductie: Helpt bij het prioriteren van targets door causale verbanden vast te stellen tussen schuifspanningspatronen en verschuivingen in het endotheelphenotype.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het shear ring-model past binnen het vroege ontdekkingscontinuüm en ondersteunt hypothesegestuurde target-identificatie en preklinische validatie van vasculaire therapieën door een fysiologisch relevante mechanische stimulus te bieden.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypotheseonderzoek naar shear-gevoelige routes in de endotheliale fysiologie mogelijk met behulp van gecontroleerde periodieke stroming.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve adhesie- en morfologische eindpunten die geschikt zijn voor de evaluatie van verbindingenbibliotheken.
- Analytiek: Genereert genormaliseerde read-outs (bijv. PECAM-1 ten opzichte van beta-actine ratio's) die vergelijking tussen condities en hit-selectie mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt biomarker-gestuurde vooruitgang door het modelleren van shear-patronen die geassocieerd worden met endotheliale activatie of dysfunctie.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vormt een kosteneffectief, modulair systeem dat aanpasbaar is voor verschillende endotheliale subtypen en projectteams voor duurzaam gebruik in mechanobiologieprogramma's.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in endotheliale reacties op hemodynamische krachten door gedefinieerde, periodieke shear-profielen.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie en het behoud van steriliteit via eenvoudige assemblage en vloeistofbeheersing met siliconen afdichtingen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdig inzicht te bieden in de hemodynamische risico's van vasculaire targets.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van mechanosensitieve pathways mogelijk op basis van shear-afhankelijke fenotypische resultaten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist aseptische techniek en bekendheid met oplosmiddelgebaseerde bonding met methyleenchloride onder een zuurkast.
- Afhankelijk van toegang tot orbitale schudmers die compatibel zijn met incubatoromgevingen voor langdurige shear-applicatie.
- Vereist gestandaardiseerde celuitzaai en confluentiebeoordeling om reproduceerbare shear-blootstelling te garanderen.
- Omvat overwegingen met betrekking tot materiaalkompatibiliteit, aangezien methyleenchloride plastics beschadigt en glas of resistente substraten vereist.
- Beperkt tot shear-magnitudes en frequenties die haalbaar zijn via orbitale beweging; niet geschikt voor simulaties van hoge frequentie of turbulente stroming.
