Name: Generatie van Escape varianten van het Influenza Virus monoklonale antistoffen neutraliseren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Leer hoe je escape-varianten van influenzavirus genereert om de bindingsplaatsen van neutraliserende monoklonale antistoffen te identificeren. Deze methode helpt bij vaccinontwikkeling en het begrijpen van virus-antistof interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd met de federale middelen van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases, het National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, onder CEIRS contract HHSN272201400008C (F.K.); NIH U19AI109946-01 (F.K.); en P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

<ol><li>Shaw, M. L., Palese, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+ML+%22Orthomyxoviridae%3A+the+viruses+and+their+replication%22">Orthomyxoviridae: the viruses and their replication</a>. , (2013).</li>
<li>Nelson, M. I., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+epidemic+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolution of epidemic influenza.</a> Nat Rev Genet. 8 (3), 196-205 (2007).</li>
<li>Lauring, A. S., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasispecies+Theory+and+the+Behavior+of+RNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001005(2010).</li>
<li>Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preexisting+human+antibodies+neutralize+recently+emerged+H7N9+influenza+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).</li>
<li>Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., Lee, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
<li>Tan, G. S., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Pathog. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>Smith, K., Garman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Steel, J., Lowen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Wang, T. T., Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+a+synthetic+peptide+from+the+influenza+virus+hemagglutinin+provides+protection+against+distinct+viral+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).</li>
<li>Impagliazzo, A., Milder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).</li>
<li>Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+soluble+headless+hemagglutinin+protects+mice+from+challenge+with+divergent+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses.</a> Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).</li>
<li>Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+Microscopy+Structures+of+Chimeric+Hemagglutinin+Displayed+on+a+Universal+Influenza+Vaccine+Candidate%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate.</a> mBio. 7 (2), e00257(2016).</li>
<li>Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+identification+of+the+antibody-binding+sites+of+Hong+Kong+influenza+haemagglutinin+and+their+involvement+in+antigenic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation.</a> Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).</li>
<li>Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+structure+of+influenza+virus+haemagglutinin+defined+by+hybridoma+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies.</a> Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).</li>
<li>Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+antigenic+sites+of+influenza+virus+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin.</a> Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).</li>
<li>Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+Mapping+of+the+Hemagglutinin+Molecule+of+A%2F%28H1N1%29pdm09+Influenza+Virus+by+Using+Monoclonal+Antibody+Escape+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants.</a> J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).</li>
<li>Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Geneva: World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+manual+on+animal+influenza+diagnosis+and+surveillance%22">WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance</a>. , (2002).</li>
<li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Propagation+in+Embryonated+Chicken+Eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs.</a> J Vis Exp. (97), e52421(2015).</li>
<li>Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Recombinant+Influenza+Virus+from+Plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA.</a> J Vis Exp. (42), e2057(2010).</li>
<li>Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+primer+set+for+the+full-length+amplification+of+all+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22ArchVirol%22%5BJournal%5D)">Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses.</a> ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).</li>
<li>Zhou, B., Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+Influenza+B+Virus+Genomic+Amplification+Facilitates+Sequencing%2C+Diagnostics%2C+and+Reverse+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics.</a> J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).</li>
<li>Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+and+designing+protein+function+with+restricted+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring and designing protein function with restricted diversity.</a> Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).</li>
<li>Chen, C. -W., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+Scanning-assisted+Identification+of+a+Monoclonal+Antibody-recognized+Linear+B-cell+Epitope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope.</a> J Vis Exp. (121), e55417(2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Hoewel de meerderheid van residuen geïdentificeerd met behulp van escape-mutanten nauwkeurig zijn, is een van het grote voorbehoud van deze aanpak dat puntmutaties van escape varianten, niet noodzakelijkerwijs binnen de moleculaire voetafdruk van het antilichaam toegewezen mogelijk zoals bepaald door structurele analyses. Dit is te wijten aan het vermogen van een mutatie op een bepaalde residu kan leiden tot een conformationele verandering distale naar de locatie van het gemuteerde residu, analoog aan een allosteric effect. Een andere beperking is dat deze methode kan alleen worden uitgevoerd voor het neutraliseren van antilichamen; antilichamen die in vitro selectieve druk ontbreken zal niet leiden tot het ontsnappen van mutanten. Echter kan deze beperking worden overwonnen met behulp van een panel van escape varianten gegenereerd door eerder gekarakteriseerd neutraliserende antilichamen. Tan et al. gebruikt een variant van de ontsnapping van een neutraliserende mAb aan het virus H7N9 voor het toewijzen van de epitoop van een niet-neutraliserende antilichamen7.
Echter biedt het ophelderen van de epitopes van antistoffen via de generatie van escape varianten een levensvatbaar alternatief voor kristallografie en cryo-Elektron microscopie, die beide een uitgebreide investeringen van apparatuur nodig. Andere alternatieven zijn om te bepalen van de minimale bindende regio van mAbs met behulp van alanine scannen of peptide scannen/truncatie mutanten. Alanine mutagenese scannen kan een aanzienlijke hoeveelheid werk bij het genereren van een groot aantal varianten tijdens screening van29, terwijl peptide scannen beperkt tot lineaire epitopes30 isvereisen. De in dit protocol beschreven methode vereist geen speciale apparatuur of techniek en in feite, maakt gebruik van bestaande in vitro neutralisatie tests bewerkt voor het genereren van escape varianten van de antilichamen van belang.
Het protocol voor genereren ontsnappen varianten die meerdere passages (b.v., stengel-specifieke antilichamen vereisen) is sterk afhankelijk van de beginconcentratie van antilichaam in passage 0. Het is beter om de onzekere en starten op een helft van een lager is dan de helft van de maximale remmende concentratie van een antilichaam logboek logboek en robuuste virus groei mogelijk. De onderzoeker kan speculeren dat een hoge titer virus cultuur in aanwezigheid van immunologische lagedruk een grote genetische variatie in de virale bevolking zullen hebben. Escape varianten kunnen worden geselecteerd voor door het geleidelijk aan verhogen van de antilichaam-concentratie in de volgende passages. In het geval dat de virus groei afneemt, kan de hoeveelheid virale supernatant kan worden verhoogd in de volgende passage met behoud van dezelfde hoeveelheid antilichaam concentratie in de vorige passage.
Een meerderheid van universele griepvaccins beoogt te verduidelijken met een robuuste antistofrespons op weg naar de regio van de stengel van de HA. De analyses van escape varianten aan stengel-specifieke antilichamen zijn belangrijk bij het bepalen van de relatie tussen influenza virus fitness en immunologische druk. Interessant, waren escape mutant virussen die voortvloeien uit de stengel-specifieke mAbs allemaal verzwakt in vivo in lymfkliertest LD50 studies4. Deze studies geven een sterke zaak voor vaccinatie stengel gebaseerde platforms. Bovendien, kan dit protocol worden gebruikt om te identificeren escape-mutanten aan andere anti-virale verbindingen, zoals klein molecuul remmers. Tenslotte, deze methode is niet beperkt tot influenza virus oppervlakte glycoproteïnen, maar ook grotere schaal kan worden toegepast om te bepalen van de epitopes van andere virale glycoproteïnen.

Gelijkaardig aan andere RNA-virussen, influenza A virussen bezitten een feilbare polymerase die het mogelijk voor het genereren van een veelheid van antigene varianten met elke ronde voor replicatie1,2,3 maakt. De griep een virus heeft een verbazingwekkend vermogen aan te passen en te onttrekken aan de menselijke immune reactie via antigene drift, die wordt bereikt door een accumulatie van mutaties op de oppervlakte glycoproteïnen die tot het verlies van antilichaam binding leidt. Antigene drift van de virale oppervlakte glycoproteïnen, HA en neuraminidase (NA), vereist de noodzaak te herformuleren en beheren van het vaccin jaarlijks.
Technologische vooruitgang in de isolatie en de generatie van antigeen-specifieke antilichamen hebben een groot aantal vaccin-geïnduceerde mAbs4,5,6,7,8opgeleverd. Op zijn beurt heeft de karakterisatie van de epitopes voor mAbs die in grote lijnen het neutraliseren van influenza A virussen sterk geholpen met de ontwikkeling van verschillende universele influenza vaccin kandidaten9,10,11, 12,13,14. Het ophelderen van de antigene voetafdruk van een mAb onthult de structurele determinanten neutralisatie en zorgt voor een weloverwogen aanpak van vaccin ontwerp. Echter, het is niet realistisch noch rendabel voor laboratoria te karakteriseren structureel uitgebreide panelen van mAbs door middel van röntgendiffractie of cryo-elektronenmicroscopie om kaart epitopes op de virale antigeen15, 16 , 17 , 18.
Röntgendiffractie of cryo-elektronenmicroscopie vereist dure apparatuur, gespecialiseerde technieken en potentieel een uitgebreide hoeveelheid tijd om gegevens te genereren. Een alternatieve en snellere aanpak is gebruik te maken van de snelle generatie van uiteenlopende virale bevolking via de foutgevoelige RNA-afhankelijke RNA-polymerase genereren escape-mutanten om te bepalen van de epitopes van mAbs19,20, 21,22,23. De generatie van escape varianten vereist geen speciale apparatuur of techniek en kan worden uitgevoerd met de conventionele laboratoriumreagentia en apparatuur.
Hier beschrijven we een methode die het mogelijk maakt voor de toewijzing van kritische residuen vereist voor mAb bindende die de influenza HA herkent.

<table><tbody><tr><td>Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid</td><td>Corning, Inc.</td><td>353072</td><td>Gebruik van het assayplateau voor de microneutralisatietest</td></tr><tr><td>Falcon 96-well clear V-bottom plate</td><td>Corning, Inc.</td><td>353263</td><td>Gebruik van het assayplateau voor de hemagglutinine-remmingstest</td></tr><tr><td>1X Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11095080</td><td>Besmettingsmedium</td></tr><tr><td>Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-behandeld trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>Klieft onvolwassen HA0 naar HA1 en HA2</td></tr><tr><td>Biotinyleerd anti-NP primair antilichaam (IAV)</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB8258B</td><td>Een antilichaam dat het NP-eiwit van influenza A-virussen herkent</td></tr><tr><td>Biotinyleerd anti-NP primair antilichaam (IBV)</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB8260B-5</td><td>Een antilichaam dat het NP-eiwit van influenza B-virussen herkent</td></tr><tr><td>Streptavidine-HRP-antilichaam</td><td>EMD Millipore</td><td>18-152</td><td>Dit wordt gebruikt als secundair antilichaam voor het biotinyleerde anti-NP-antilichaam</td></tr><tr><td>HRP-substraat (SIGMAFAST-OPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9187-5SET</td><td>o-fenyleendiamine dihydrochloride wateroplosbaar substraat voor HRP</td></tr><tr><td>96-well V-bottom plate</td><td>Nunc</td><td>249662</td><td>Gebruik van het assayplateau voor de hemagglutininetest</td></tr><tr><td>Kippenkleurige rode bloedcellen</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7201403</td><td>Gebruikt om het vermogen van het influenzavirus om agglutineren te beoordelen</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td>Extractie van RNA</td></tr><tr><td>Superscript III</td><td>Invitrogen</td><td>12574018</td><td>Reverse transcriptase</td></tr><tr><td>Gel Extractie Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Isolatie van geamplificeerde PCR-product</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11013</td><td>Fluorescente secundair antilichaam voor menselijke antilichamen</td></tr><tr><td>Anti-muis IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Fluorescente secundair antilichaam voor muis antilichamen</td></tr><tr><td>6-well polystyreen microplate</td><td>Corning, Inc.</td><td>353934</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene lange termijn opslag Cryo-buizen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5012-0020</td><td>Invriezen van het virale cultuursupernatant</td></tr><tr><td>Reassortant A/California/04/09 (H1)</td><td>Palese Laboratorium</td><td></td><td>Reassortant virus dat de HA en NA van A/California/04/09 (H1N1) tot expressie brengt met de interne segmenten van A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td></tr><tr><td>Reassortant A/Shanghai/1/13 (H7)</td><td>Palese Laboratorium</td><td></td><td>Reassortant virus dat de HA en NA van A/Shanghai/1/13 (H7N9) tot expressie brengt met de interne segmenten van A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td></tr><tr><td>Rundvleesalbumine oplossing (35%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen gel extractie kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Zuivering van DNA-fragmenten op basis van silica-membraan</td></tr></tbody></table>

generatie van escape varianten van het influenza virus monoklonale antistoffen neutraliseren

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenzavirussen vertonen een opmerkelijk vermogen tot aanpassing en de immuunrespons van de gastheer te omzeilen. Unidirectioneel is door antigene veranderingen die zich op de oppervlakte glycoproteïnen van het virus voordoen. De generatie van escape varianten is een krachtige methode in ophelderen hoe virussen ontsnappen immuun detectie en identificatie van kritieke residuen vereist voor antilichaam binding. Hier beschrijven we een protocol over het influenza-A virus ontsnappen varianten maken door gebruik te maken van menselijke of lymfkliertest monoclonal antilichamen (mAbs) gericht tegen de virale hemagglutinine (HA). Met het gebruik van onze techniek, we eerder gekenmerkt kritische residuen nodig zijn voor het binden van antistoffen gericht op het hoofd of de stengel van de roman aviaire H7N9 HA. Het protocol kan worden gemakkelijk aangepast voor andere virus-systemen. Analyses van escape varianten zijn belangrijk voor het modelleren van de antigene drift, bepalen van één nucleotidepolymorfisme (SNPs) verlenen weerstand en virus fitness, en bij het ontwerpen van vaccins en/of therapeutics.

Wij hebben vroeger variaties van deze methode voor het genereren van escape varianten aan menselijke en lymfkliertest mAbs geïnduceerd door de seizoensgebonden influenza virus vaccin, H7N9 vaccinatie of sequentiële DNA/recombinant HA eiwit vaccinatie4,5 ,6,7. Zoals hierboven beschreven, werden antilichamen eerst gekenmerkt met behulp van de HI en microneutralization testen om te vernemen welke specifieke protocol om door te gaan met de volgende4,5. Antilichamen 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 en 07-4D 05 bleken te hebben van HI en neutralisering activiteiten tegen het aviaire H7N9 virus (A/Shanghai/1/2013) (tabel 1), en dus de oorsprongsregels in protocol 1 (stap 2.1) werd gebruikt. Protocol 2 (stap 2.2) is voor mAbs met het neutraliseren van dat gebrek aan HI activiteit, zoals 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 en S6-B01 (tabel 1), gebruikt voor het genereren van escape varianten. Mutant toewijzing van de ontsnapping onthuld dat veel van de antistoffen kritische residuen op verschillende locaties op de virale HA4,5 (Figuur 4 herkennen). Terwijl de meerderheid van de HI-positieve antistoffen hebben mutant residuen in de buurt van reeds gerapporteerde antigene sites van de H7 HA ontsnappen, de HI-negatieve antilichamen escape-mutanten met puntmutaties gegenereerd in de stengel regio4,5 .
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antilichaam</td>
			<td>Hallo activiteit</td>
			<td>NEUT activiteit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5D 03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5G 01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4D 05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41-5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045-051310-2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042-100809-2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6-B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: Tabel van antilichaam HI en neutralisering activiteit. Tien H7-specifieke mAbs geïsoleerd uit personen die zijn ingeënt met een experimenteel vaccin H7N9 vertonen verschillende in vitro antivirale activiteiten5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">Voorwaartse Primer (5' naar 3')</td>
			<td colspan="4">Omgekeerde Primer (5' naar 3')</td>
			<td colspan="2">Thermocylcer voorwaarden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">42 ° c gedurende 60 minuten, 94 ºC voor 2 min/5 cycli van 94 ºC voor 20 s, 50 ºC voor 30 s en 68 ° c voor 3 min 30 s, gevolgd door 40 cycli van 94 ºC voor 20 s, 58 ºC voor 30 s , en 68 ° c voor 3 min 30 s met een tijd van de laatste uitbreiding bij 68 ° c gedurende 10 minuten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">45 ºC voor 60 min, 55 ºC voor 30 min, 94 ºC voor 2 min/5 cycli van 94 ºC voor 20 s, 40 ºC voor 30 s en 68 ° c voor 3 min 30 s, gevolgd door 40 cycli van 94 ºC voor 20 s , 58 ºC voor 30 s, en 68 ° c voor 3 min 30 s met een tijd van de laatste uitbreiding bij 68 ° c gedurende 10 minuten</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 2: universele influenza virus inleidingen. Primerparen voor de versterking van de HA-segmenten van influenza-A27 B28 virussen en hun respectieve thermocycler voorwaarden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg"> 
Figuur 1: HI assay. (A) A schema voor het opzetten van een HI-assay voor het testen van de activiteit van twee muis H1-specifieke mAbs 7B2 (hoofd-specifiek) en 6F12 (Steel-specifiek) met behulp van een 96-Wells-V-bodemplaat, en (B) een voorbeeld van de resultaten van een HI assay23. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg"> 
Figuur 2: Microneutralization assay. Een schema voor het opzetten van een microneutralization-assay voor het testen van de activiteit van twee menselijke mAbs 4 d 055 en CR911417. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg"> 
Figuur 3: generatie van escape-mutanten. De methodologie voorgesteld zal worden afhankelijk van de HI en de activiteit van de microneutralization tentoongesteld door het antilichaam. De generatie van escape-mutanten tegen (A) wellicht neutraliserende antilichamen van de HI-positieve één passage in de sector eieren, terwijl (B) neutraliserende antilichamen van HI-negatieve mogelijk meerdere passages met steeds grotere hoeveelheden van antilichaam in de cultuur van de weefsel van de cel. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg"> 
Figuur 4: een voorbeeld van een epitoop toewijzing van de roman aviaire H7N9 HA gegenereerd met escape mutant varianten. Vaccin-geïnduceerde antistoffen geïsoleerd van individuen ingeënt met een kandidaat H7N9 influenza een vaccin werden gebruikt voor het genereren van escape mutant varianten. Elke residu aangegeven in rood geeft de locatie van essentiële aminozuren nodig voor efficiënte binding van een mAb. Gegevens waren aangepast van Dunand-Henry et al., 20154. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Beschrijven we een methode waarmee we identificeren kritische residuen nodig zijn voor de binding van de mens of lymfkliertest monoclonal antilichamen die gericht zijn op de virale hemagglutinine van influenza A-virussen. Het protocol kan worden aangepast aan andere oppervlakte glycoproteïnen van virus en hun overeenkomstige neutraliserende antilichamen.

Generatie van Escape varianten van het Influenza Virus monoklonale antistoffen neutraliseren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Het algemene doel van deze methode is om een werkprotocol te bieden voor het bepalen van het epitoop van een neutraliserend monoklonaal antilichaam. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de immunologie en virologie die kunnen helpen bij het definiëren van interacties tussen gastheer en virus, het ontwikkelen van therapeutica en diagnostische instrumenten, welke allemaal kunnen bijdragen aan het ontwerp van vaccins. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden uitgevoerd met basisprocedures voor weefselkweek en moleculaire biologie, zonder dat speciale instrumenten of apparatuur nodig zijn.De procedure zal worden gedemonstreerd door Mark Bailey, een MD en PhD-student uit het laboratorium van Peter Palese. Begin deze procedure met de karakterisering van antilichamen op basis van hemoagglutinatieremming, of HI, en neutralisatieactiviteiten zoals beschreven in het tekstprotocol. Neutraliserende antilichamen met HI-activiteit worden verder geanalyseerd door eerst vier verdunningen van het betreffende antilichaam voor te bereiden in toenemende concentraties in één keer PBS in een volume van 100 µL per verdunning.Bereid vervolgens een virusvoorraad voor van één miljoen plaque-vormende eenheden per milliliter in 1× PBS in een volume van 400 µL. Meng daarna 100 µL van één miljoen plaque-vormende eenheden per milliliter virus met 100 µL van elke antilichaamverdunning of 100 µL 1× PBS. Incubeer de monsters gedurende één uur in een incubator bij 37 °C met 5% CO₂.Inject na kort vortexen 200 µL van elk mengsel in specifieke pathogeenvrije geëmbryoneerde kippeneieren. Incubeer de eieren vervolgens gedurende 40 tot 44 uur bij 37 °C zonder koolstofdioxide. Na de incubatie worden de virusgeïnfecteerde geëmbryoneerde eieren geofferd door ze gedurende minimaal zes uur bij 4 °C te plaatsen.Oogst vervolgens de allantoïsvloeistof uit de eieren zoals eerder beschreven. Bevestig tot slot de escape-varianten door de HI-assay uit te voeren zoals beschreven in het tekstprotocol. Om escape-varianten te genereren tegen neutraliserende antilichamen die geen HI-activiteit bezitten, moet het virus gepassageerd worden in aanwezigheid van toenemende hoeveelheden antilichamen.Zaai MDCK-cellen uit in een zeswellenplaat met een dichtheid van één miljoen cellen per well. Incubeer de cellen gedurende minimaal vier uur in een incubator van 37 °C met 5% koolstofdioxide. Verdun ondertussen de virusvoorraad tot één miljoen plaque-vormende eenheden per milliliter.Bereid een enkele verdunning van het antilichaam voor op 0,02 mg/mL in één keer MEM met TPCK-behandelde trypsine in een volume van 250 µL. Gebruik voor alle volgende passages hogere antilichaamconcentraties. Meng 250 µL verdund virus met 250 µL verdund antilichaam, of met 250 µL één keer MEM als controle zonder antilichaam.Incubeer het mengsel van virus en antilichamen gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C met 5% koolstofdioxide. Aspireer na incubatie van de cellen het medium met een glazen Pasteurpipet en was de monolaag cellen met 1 mL 1× PBS. Voeg 500 µL van de mengsels toe aan de wells voordat deze gedurende één uur worden geïncubeerd in een incubator van 37 °C met 5% koolstofdioxide.Voeg na één uur twee milliliter eenvoudig MEM met TPCK-behandelde trypsine toe aan de wells. Controleer de cellen 48 uur na infectie onder de microscoop op tekenen van het cytopathisch effect, of CPE, of voer een hemoagglutinatietest uit om virale groei te detecteren. Indien er CPE-groei is in de cultuur die is aangevuld met antilichamen, oogst dan het supernatant in meerdere cryotubes.Label de buisjes met het passagesnummer en bewaar deze bij -80 °C. Bewaar 100 µL van het supernatant om een verse MDCK-monolaag te infecteren met 2 mL 1× MEM aangevuld met TPCK-trypsine en antilichaam. Denk eraan om voor elke passage een controle zonder antilichaam op te nemen.Verhoog de concentratie van het antilichaam in elke opeenvolgende passage totdat de virusgroei nog steeds levensvatbaar is, zelfs bij de uiteindelijke concentratie van 0.6 mg/mL antilichaam. Vries de meerdere vials supernatant van elke passage in en bewaar deze bij -80 °C. Ga verder met de isolatie en analyses van de ontsnapte varianten zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.Vaccin-geïnduceerde antilichamen, geïsoleerd van personen die gevaccineerd waren met het kandidaat H7N9 influenza A-vaccin, werden gebruikt om escape-mutantvarianten te genereren. Mapping van de escape-mutanten onthulde dat veel van de antilichamen kritieke residuen herkenden op verschillende locaties op het virale HA. Elk residu, aangegeven in het rood, vertegenwoordigt de locatie van kritieke aminozuren die nodig zijn voor efficiënte binding van een monoklonaal antilichaam, terwijl de meerderheid van de HI-positieve antilichamen escape-mutantresiduen vertoonden nabij eerder gerapporteerde antigenische sites van het H7HA. De HI-negatieve antilichamen genereerden escape-mutanten met puntmutaties in de stokregio.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden toegepast om de structurele determinanten van bescherming tegen andere pathogenen te ontrafelen. Deze techniek is niet alleen beperkt tot het genereren van escape-varianten van monoklonale antilichamen, maar kan ook worden ingezet tegen antivirale verbindingen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe het bindingsepitoop van monoklonale antilichamen kan worden bepaald door in vitro escape-varianten te genereren.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig te zijn bij het werken met virussen en passende persoonlijke beschermingsmiddelen te gebruiken.

generation-escape-variants-neutralizing-influenza-virus-monoclonal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a technique for generating escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies. Antibody-neutralized virus suspension is injected into embryonated chicken eggs to propagate escape variants selectively. This results in a virus population predominantly of escape variants, confirmed via a Hemagglutination assay.

Generation of Influenza Virus Escape Variants against Neutralizing Antibodies

The video showcases a method to create cold-adapted recombinant influenza viruses. It involves transfecting human cells with bi-directional plasmids, followed by incubation at lower temperature incubation to yield viruses suitable for vaccine production, characterized by reduced replication in warmer conditions.

Generating  Recombinant Live-Attenuated Influenza Viruses for Vaccines

Redding van recombinant arenavirussen uit gekloneerde cDNA's, gegeven voor een reverse genetische benadering stelt onderzoekers de rol van specifieke virale genproducten, evenals de bijdrage van de verschillende specifieke gebieden en residuen te onderzoeken, om verschillende aspecten van de biologie van arenavirus . Ook reverse genetics technieken FDA-goedgekeurde cellijnen (Vero) voor vaccinontwikkeling verschaft nieuwe mogelijkheden voor het genereren van effectieve en veilige vaccins ter...

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

Hier beschrijven we een manier om correct gevouwen en functionele oppervlak influenzavirus-antigenen afgeleid van de nieuwe Chinese H7N9 virus in insectencellen uiten. De techniek kan worden aangepast aan ectodomeinen van elke virale of cellulaire oppervlakte-eiwitten tot expressie.

Expressie van Functionele Recombinant Hemagglutinine en neuraminidase Eiwitten uit de roman H7N9 Influenza Virus Met de baculovirusexpressiesysteem

Een geoptimaliseerd protocol wordt gepresenteerd voor de generatie van monoklonale antilichamen op basis van de hybridoma-technologie. Muizen werden geïmmuniseerd met een immunoconjugaat. Miltcellen werden gefuseerd door PEG en een elektrische impuls met onsterfelijke myeloomcellen. Antilichaam-producerende hybridoma-cellen werden geselecteerd door HAT en antigeen-specifiek ELISA-screening.

Genereren van monoklonale muizenantilichamen door Hybridoma Technology

Deze studie beschrijft een   -Imaging gebaseerde micro-neutralisatietest de antigene relaties tussen virussen te analyseren. Het protocol maakt gebruik van een flatbed scanner en heeft vier stappen, waaronder titratie titratie kwantificering, neutralisatie, en neutralisatie kwantificering. De test werkt goed met de huidige circulerende influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B-virussen.

Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van Fc-gemedieerde effector functies door antilichamen die gericht het influenza virus hemagglutinine. Deze test kan ook worden aangepast voor de beoordeling van het vermogen van monoclonal antilichamen of polyclonal sera gericht op andere virale oppervlakte glycoproteïnen ertoe Fc-gemedieerde immuniteit.

Een methode om te beoordelen van Fc-gemedieerde Effector functies geïnduceerd door Influenza hemagglutinine specifieke antilichamen

Influenza neutraliserende antilichamen correleren met bescherming van influenza-infecties. Microneutralization testen meten van neutraliserende antilichamen in menselijke sera en worden vaak gebruikt voor menselijke influenza-serologie. We beschrijven een microneutralization assay cuvetten van de MDCK-SIAT1 voor het meten van neutraliserende antilichamen titers voor hedendaagse 3C.2a en 3C.3a A(H3N2) virussen na griepvaccinatie of infectie.

Meten van Influenza neutraliserende antilichamen reacties op A(H3N2) virussen in menselijke Sera door Microneutralization testen met behulp van MDCK-SIAT1 cellen

Deze studie beschrijft een hoog debiet, imaging gebaseerde micro-neutralisatie test om te bepalen van de titer van neutraliserende antilichamen specifiek voor respiratoir syncytieel virus (RSV). Deze bepaling-indeling is getest op verschillende monster typen.

Een verbeterde en hoge doorvoer respiratoir syncytieel Virus (RSV) Micro-neutralisatie Assay

Dit protocol beschrijft de toepassing van een nieuw hybride alfavirus-SARS-CoV-2-pseudovirus (Ha-CoV-2) als platform voor snelle kwantificering van de besmettelijkheid van SARS-CoV-2-varianten en hun gevoeligheid voor neutraliserende antilichamen.

Toepassing van Ha-CoV-2-pseudovirus voor snelle kwantificering van SARS-CoV-2-varianten en neutraliserende antilichamen

Leer hoe je escape-varianten van influenzavirus genereert om de bindingsplaatsen van neutraliserende monoklonale antistoffen te identificeren. Deze methode helpt bij vaccinontwikkeling en het begrijpen van virus-antistof interacties.

Generatie van Escape varianten van het Influenza Virus monoklonale antistoffen neutraliseren

Meer video's verkennen