Generatie van Escape varianten van het Influenza Virus monoklonale antistoffen neutraliseren

Het algemene doel van deze methode is om een werkprotocol te bieden voor het bepalen van het epitoop van een neutraliserend monoklonaal antilichaam. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de immunologie en virologie die kunnen helpen bij het definiëren van interacties tussen gastheer en virus, het ontwikkelen van therapeutica en diagnostische instrumenten, welke allemaal kunnen bijdragen aan het ontwerp van vaccins. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden uitgevoerd met basisprocedures voor weefselkweek en moleculaire biologie, zonder dat speciale instrumenten of apparatuur nodig zijn.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Mark Bailey, een MD en PhD-student uit het laboratorium van Peter Palese. Begin deze procedure met de karakterisering van antilichamen op basis van hemoagglutinatieremming, of HI, en neutralisatieactiviteiten zoals beschreven in het tekstprotocol. Neutraliserende antilichamen met HI-activiteit worden verder geanalyseerd door eerst vier verdunningen van het betreffende antilichaam voor te bereiden in toenemende concentraties in één keer PBS in een volume van 100 µL per verdunning.

Bereid vervolgens een virusvoorraad voor van één miljoen plaque-vormende eenheden per milliliter in 1× PBS in een volume van 400 µL. Meng daarna 100 µL van één miljoen plaque-vormende eenheden per milliliter virus met 100 µL van elke antilichaamverdunning of 100 µL 1× PBS. Incubeer de monsters gedurende één uur in een incubator bij 37 °C met 5% CO₂.

Inject na kort vortexen 200 µL van elk mengsel in specifieke pathogeenvrije geëmbryoneerde kippeneieren. Incubeer de eieren vervolgens gedurende 40 tot 44 uur bij 37 °C zonder koolstofdioxide. Na de incubatie worden de virusgeïnfecteerde geëmbryoneerde eieren geofferd door ze gedurende minimaal zes uur bij 4 °C te plaatsen.

Oogst vervolgens de allantoïsvloeistof uit de eieren zoals eerder beschreven. Bevestig tot slot de escape-varianten door de HI-assay uit te voeren zoals beschreven in het tekstprotocol. Om escape-varianten te genereren tegen neutraliserende antilichamen die geen HI-activiteit bezitten, moet het virus gepassageerd worden in aanwezigheid van toenemende hoeveelheden antilichamen.

Zaai MDCK-cellen uit in een zeswellenplaat met een dichtheid van één miljoen cellen per well. Incubeer de cellen gedurende minimaal vier uur in een incubator van 37 °C met 5% koolstofdioxide. Verdun ondertussen de virusvoorraad tot één miljoen plaque-vormende eenheden per milliliter.

Bereid een enkele verdunning van het antilichaam voor op 0,02 mg/mL in één keer MEM met TPCK-behandelde trypsine in een volume van 250 µL. Gebruik voor alle volgende passages hogere antilichaamconcentraties. Meng 250 µL verdund virus met 250 µL verdund antilichaam, of met 250 µL één keer MEM als controle zonder antilichaam.

Incubeer het mengsel van virus en antilichamen gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C met 5% koolstofdioxide. Aspireer na incubatie van de cellen het medium met een glazen Pasteurpipet en was de monolaag cellen met 1 mL 1× PBS. Voeg 500 µL van de mengsels toe aan de wells voordat deze gedurende één uur worden geïncubeerd in een incubator van 37 °C met 5% koolstofdioxide.

Voeg na één uur twee milliliter eenvoudig MEM met TPCK-behandelde trypsine toe aan de wells. Controleer de cellen 48 uur na infectie onder de microscoop op tekenen van het cytopathisch effect, of CPE, of voer een hemoagglutinatietest uit om virale groei te detecteren. Indien er CPE-groei is in de cultuur die is aangevuld met antilichamen, oogst dan het supernatant in meerdere cryotubes.

Label de buisjes met het passagesnummer en bewaar deze bij -80 °C. Bewaar 100 µL van het supernatant om een verse MDCK-monolaag te infecteren met 2 mL 1× MEM aangevuld met TPCK-trypsine en antilichaam. Denk eraan om voor elke passage een controle zonder antilichaam op te nemen.

Verhoog de concentratie van het antilichaam in elke opeenvolgende passage totdat de virusgroei nog steeds levensvatbaar is, zelfs bij de uiteindelijke concentratie van 0.6 mg/mL antilichaam. Vries de meerdere vials supernatant van elke passage in en bewaar deze bij -80 °C. Ga verder met de isolatie en analyses van de ontsnapte varianten zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.

Vaccin-geïnduceerde antilichamen, geïsoleerd van personen die gevaccineerd waren met het kandidaat H7N9 influenza A-vaccin, werden gebruikt om escape-mutantvarianten te genereren. Mapping van de escape-mutanten onthulde dat veel van de antilichamen kritieke residuen herkenden op verschillende locaties op het virale HA. Elk residu, aangegeven in het rood, vertegenwoordigt de locatie van kritieke aminozuren die nodig zijn voor efficiënte binding van een monoklonaal antilichaam, terwijl de meerderheid van de HI-positieve antilichamen escape-mutantresiduen vertoonden nabij eerder gerapporteerde antigenische sites van het H7HA. De HI-negatieve antilichamen genereerden escape-mutanten met puntmutaties in de stokregio.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden toegepast om de structurele determinanten van bescherming tegen andere pathogenen te ontrafelen. Deze techniek is niet alleen beperkt tot het genereren van escape-varianten van monoklonale antilichamen, maar kan ook worden ingezet tegen antivirale verbindingen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe het bindingsepitoop van monoklonale antilichamen kan worden bepaald door in vitro escape-varianten te genereren.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig te zijn bij het werken met virussen en passende persoonlijke beschermingsmiddelen te gebruiken.