Een Micro-CT-gebaseerde methode voor het karakteriseren van laesies en vinden van elektroden in kleine dierlijke hersenen
8 november 2018
Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode ter voorbereiding van kleine dierlijke hersenen van micro-CT beeldvorming, in welke letsels kunnen worden gekwantificeerd en elektroden gelegen met hoge precisie in de context van de hele hersenen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurowetenschappen door het verstrekken van een eenvoudiger, minder foutgevoelig, en meer kwantitatieve methode voor het verifiëren van laesies en het lokaliseren van elektrode locaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt voor de verificatie van laesies en elektrode sites in de hele hersenen zonder de noodzaak voor sectioning. Het eindproduct is een digitaal 3D-volume van de hersenen en meerdere hersenen kunnen parallel worden verwerkt.
Hoewel deze methode zal worden aangetoond in de rat, kan het ook worden toegepast op andere organismen, zoals muizen en zebravinken. Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen, omdat sommige stappen vereisen bijzondere zorg om de beste resultaten te garanderen. Om te beginnen, plaats een geëxtraheerd brein in overfusie oplossing in een 50 milliliter conische buis.
Bewaar het monster twee tot drie dagen met zacht schudden op vier graden Celsius. Zorg ervoor dat het osmium wordt verdund in water en niet in een buffer. Dit komt omdat het water zal fungeren als een mild wasmiddel, waardoor het osmium diep in het weefsel kan doordringen.
Bereid 50 milliliter van 2% osmiumtetroxide in dubbel gedestilleerd water. Plaats vervolgens de hersenen in een nieuwe 50 milliliter conische buis en voeg de osmium tetroxide oplossing. Sluit de buis en sluit deze af met paraffinefolie om lekken te voorkomen.
Bewaar de verzegelde buis op vier graden Celsius met zachte schudden voor twee weken. Zorg ervoor dat de buis horizontaal wordt geplaatst. De hersenen is erg dik en een lange manieren om te reizen door diffusie.
Door de buis horizontaal te plaatsen, kan het osmium dieper in het weefsel komen. Nadat het monster twee weken lang is ingebroed, was het vijf keer met dubbelgedestilleerd water om alle niet-gebonden osmiumtetroxide uit het monster te verwijderen. Was vervolgens het monster met dubbel gedestilleerd water gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.
Vervang het dubbelgedistilleerde water door vier verdunningen ethanol om het monster te dehydrateren. Om te beginnen met de hars infiltratie proces, verplaats het monster door drie aceton en drie aceton hars verdunningen, dan dompel het monster in 100% hars bij kamertemperatuur om het infiltratieproces voort te zetten. Breng hierna het monster over naar een wegwerpmal.
Bezielt het monster met verse 100% hars gedurende vier uur bij kamertemperatuur. Ontgassen het monster in een vacuümoven gedurende 15 minuten bij 45 graden Celsius. Dan genezen van het monster in een oven voor 48 uur op 60 graden Celsius.
Ten slotte, wanneer het monster klaar is met genezen, schil de wegwerpvorm af en scan het met de Micro-CT-machine. In traditionele secties moet de oriëntatie van de hersenen vooraf worden bepaald. Met behulp van deze Micro-CT-methode kan het digitale volume van de monsterhersenen in drie dimensies worden gemanipuleerd en vrijwel in elke richting worden gesneden.
Scanning elektronenmicroscopie van de voorbereide rattenhersenen bevestigen dat het weefsel niet significant beschadigd was ten behoeve van Micro-CT beeldvorming. Een zebra vink hersenen werd ook voorbereid en gescand volgens dit protocol om het nut van deze methode te testen op andere kleine dierlijke hersenen. Deze techniek kan worden gebruikt om oppervlaktelaesies in de hersenen te vinden, evenals laesies diep in de hersenen.
Deze techniek kan ook worden toegepast op de locatie van enkele tetrodes in situ, elektrolytische laesies, elektrodesporen, tetrode arrays in situ, en silicium sondes in situ. Tijdens een poging deze procedure, het is belangrijk om te onthouden om de hersenen te broeden lang genoeg en met voldoende agitatie. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals optogenetica en twee-fotonbeeldvorming worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de rol die verschillende hersengebieden spelen in verschillende gedragingen.
Deze techniek zou onderzoekers op het gebied van neurowetenschappen in staat kunnen stellen om structuur-functierelaties tussen de hersenen en het gedrag bij ratten, muizen, zangvogels en andere kleine dieren beter te verkennen. Vergeet niet dat het werken met osmium zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen en het werken in een vacuümkap moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het voorbereiden van kleine dierenceheren, specifiek rattenhersenen, voor micro-CT beeldvorming. De techniek is bedoeld om laesies te kwantificeren en elektroden nauwkeurig te lokaliseren zonder de noodzaak van secties, waardoor een uitgebreid 3D digitaal volume van de hersenen wordt geproduceerd.
Belangrijke onderdeelcomponenten van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Beeldvormingstechnieken
- Laesieanalyse
Achtergrond
- Micro-CT beeldvorming maakt niet-destructieve analyse van hersenstructuren mogelijk.
- Traditionele sectiemethoden kunnen foutengevoelig zijn en de oriëntatieflexibiliteit beperken.
- Deze methode verbetert de mogelijkheid om laesies en elektrodeplaatsing te analyseren.
- Toepasbaar op verschillende kleine dieren zoals muizen en zebravinken.
Doel van het onderzoek
- Om een vereenvoudigde en minder foutengevoelige voorbereidingsmethode voor micro-CT beeldvorming te ontwikkelen.
- Om nauwkeurige lokalisatie van laesies en elektroden te bieden.
- Om 3D manipulatie van hersenmonsters voor verbeterde analyse mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Het belangrijkste platform dat wordt gebruikt, is micro-CT beeldvorming van voorbereide hersenmonsters.
- Het belangrijkste biologische model is het rattenbrein, maar de methode is aanpasbaar voor andere kleine dieren.
- De methode omvat specifieke incubatieperiodes en het gebruik van osmiumtetraoxide voor weefselvoorbereiding.
- Kritieke stappen omvatten horizontale buisplaatsing en meerdere wasstappen om osmiumpenetratie te garanderen.
- De laatste voorbereiding omvat het uitharden van de hars en scannen met een Micro-CT machine.
Belangrijkste resultaten
- Deze methode maakt de visualisatie van zowel oppervlakkige als diepe hersenlaesies mogelijk.
- Het maakt nauwkeurige identificatie van elektrodesporen en laesies mogelijk terwijl de weefselintegriteit wordt gehandhaafd.
- Gescaneerde monsters tonen aan dat weefselschade minimaal is, wat de toepasbaarheid van de techniek bevestigt.
- De procedure kan verdere experimenten zoals optogenetica en twee-foton beeldvorming ondersteunen.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een effectieve methode voor het voorbereiden van dierenceheren voor gedetailleerde analyse met behulp van micro-CT.
- De techniek stelt onderzoekers in staat om neurongedrag en structurele relaties te onderzoeken zonder de monsters te beschadigen.
- In het algemeen verbetert het de mogelijkheden van neurowetenschappelijk onderzoek om hersenmechanica te begrijpen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate lesion characterization and electrode localization are critical for validating mechanistic hypotheses in neuroscience-driven drug discovery. This micro-CT-based workflow enables high-resolution, quantitative mapping of brain interventions, reducing manual error and supporting reproducible, cross-study comparisons. The approach enhances predictive confidence at the target validation and preclinical model inflection points, directly impacting translational continuity and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of lesion placement and electrode localization for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing 3D anatomical context for intervention sites.
- Facilitates quantitative comparison of experimental manipulations across studies and models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain models for downstream functional assays and behavioral studies.
- Standardizes lesion and electrode mapping, improving reproducibility and assay reliability.
- Generates digital volumes suitable for automated or manual segmentation and analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns anatomical intervention data with behavioral and functional outcomes in disease-relevant systems.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-modal data integration.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This micro-CT method integrates at the interface of discovery biology and preclinical model validation, bridging anatomical verification with functional and behavioral readouts.
- Discovery Biology: Provides quantitative, 3D verification of experimental manipulations for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, high-resolution anatomical data to support assay readiness and cross-study standardization.
- Analytics: Enables digital measurement and comparison of lesion volumes and electrode positions across conditions.
- Translational Research: Supports alignment of anatomical and functional data for disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, digital workflow adaptable to multiple small animal models and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation studies.
- Operational Value: Streamlines verification processes, enabling parallel sample processing and digital archiving.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by standardizing anatomical validation across programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative anatomical data for model selection and advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue preparation, micro-CT imaging, and digital volume analysis.
- Demands access to micro-CT instrumentation and compatible analysis software (free or proprietary).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample handling and imaging protocols.
- Adaptable to various small animal models with protocol adjustments for tissue size and composition.
- Safety precautions are essential due to hazardous reagents such as osmium tetroxide.
