Name: 3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Leer een 3D PDMS-cultuurmethode voor celbiologisch onderzoek met chemoattractant gradiënten. Dit platform analyseert multi-cellulaire reacties en toont aan dat organoïden zwakkere signalen detecteren dan enkele cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door toelagen aan AJE (NSF PD-11-7246, de Stichting van het onderzoek van de borstkanker (BCRF-17-048), en NCI U54 CA210173) en AL (U54CA209992).

Alle dieren werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite, Johns Hopkins University, school of Medicine.
1. fabricage van het mesofluidic apparaat
<ol><li>Ontwerp het masker van de mal voor PDMS apparaat met behulp van een 3D-CAD-software.</li>
	<li>Print de mal met behulp van stereolithography apparatuur met een thermisch resistente hars. Opmerking: de hier beschreven procedures werden uitgevoerd door een commerciële 3D print service.</li>
	<li>Meng een PDMS monomeer oplossing met het Uithardings middel in een 10:1 verhouding. voor de fabricage van het apparaat is 3 mL PDMS mengsel vereist. Het totale volume is afhankelijk van het aantal van de mallen worden gefabriceerd.</li>
	<li>Degas het mengsel door het toepassen van een vacuüm met het gebruik van een in-house laboratorium vacuüm of vacuümpomp in een vacuüm verdrooger gedurende 1 uur.</li>
	<li>DEP het oppervlak van de mal met een plakband om stof te verwijderen, en giet het PDMS mengsel aan de mal. Als bubbels worden ingevoerd in het proces, herhaal ontgassing in de vacuüm verdrooger. Bubbels opgesloten tussen de pilaren van de mal kan worden verwijderd doorprikken ze met een scherpe naald. Opmerking: de ontgassing proces bij kamertemperatuur moet worden gedaan binnen 1 uur of minder.</li>
	<li>Cure de PDMS door het verwarmen van 80 °C gedurende 2 uur. Laat de mal af te koelen bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Snijd de grens tussen de mal en PDMS met een mes en dan afpellen PDMS uit de mal zorgvuldig.</li>
	<li>Trim de PDMS deel aan de 22 mm x 22 mm dekglaasje te passen en punch een gat aan de inlaat. Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
	<li>Reinig de PDMS deel en 22 mm x 22 mm dekglaasje door het afvegen van de oppervlakken met een laag-lint weefsels en 70% ethanol. Verwijder vervolgens grote stofdeeltjes door deppen met een plakband.</li>
	<li>Steriliseer het PDMS deel en dekglaasje door een van beide autoclaaf (121 °C gedurende 8 minuten NAT, 15 minuten droog) of blootstelling aan UV-licht gedurende 1 uur.</li>
	<li>Behandel de onderkant van de PDMS deel en cover slip met Corona kwijting Gun voor 5 min in het weefselcultuur kap en vervolgens Bond ze samen. Let op: Leg alle niet-geleidend materiaal zoals polystyreenschuim op de bodem en verwijder alle geleidende materialen tijdens dit proces. Injecteer collageen onmiddellijk in het apparaat, binnen 5 minuten, na de behandeling om de verlijming tussen collageen gel en glas dekglaasje te verhogen.</li>
</ol>2. Cell voorbereiding: primaire borst organite isolatie
Opmerking: de details van de borstklier organite isolatie kan worden gevonden in een vorig werk11. Elke vorm van enkele cel of organite kan worden bereid volgens hun eigen isolatie/detachement protocollen.
<ol><li>Gehakt de borstklier weefsel van de muizen met een scalpel tot het weefsel ontspant en schud het voor 30 min bij 37 ° c in 50 mL van Collagenase/trypsine oplossing (10 mL per muis) in DEME/F12 aangevuld met 0,1 g van trypsine, 0,1 g van Collagenase , 5 mL FBS, 250 l van 1 μg/mL insuline, en 50 l van 50 μg/mL gentamicine.</li>
	<li>Centrifugeer de Collagenase/trypsine oplossing bij 1.250 x g voor 10 min. Verwijder de bovendrijvende door aspiratie. Verspreid cellen in 10 mL van DMEM/F12, en centrifugeer bij 1.250 x g gedurende 10 min. Na het verwijderen van DMEM/F12 door aspiratie, opnieuw op te schorten cellen in 4 mL van DMEM/F12 aangevuld met 40 l van DNase (2 eenheden/l).</li>
	<li>Schud de DNase oplossing met de hand voor 2-5 min en dan Centrifugeer bij 1.250 x g voor 10 min.</li>
	<li>Afzonderlijke organoids van enkele cellen door vier differentiële Centrifuges (Pulse tot 1.250 x g en stop de centrifuge 3-4 s na het bereiken van de beoogde snelheid). Tussen elke puls, aspireren de bovendrijvende en de pellet opnieuw op te schorten in 10 mL van DMEM/F12.</li>
	<li>Re-Suspend de laatste pellet in de gewenste hoeveelheid groeimedium van DMEM/F12 met 1% penicilline/streptomycine en 1% insuline-transferrin-selenium-X voor de voorbereiding van collageen.</li>
</ol>3. collageen voorbereiding en injectie
Opmerking: andere soorten ECM gels kunnen worden bereid volgens hun eigen gelering protocollen.
<ol><li>Bereid collageen type I oplossing (3,78 mg/mL), 10x DMEM, 1 N NaOH oplossing, normaal groeimedium op ijs. Nota: Houd op ijs tot de procedure wordt voltooid.</li>
	<li>Voeg 6 l van 1 N NaOH oplossing toe, 200 l van groeimedium en 50 l van 10x DMEM in een pre-gekoelde micro centrifugebuis en meng de oplossing grondig.</li>
	<li>Voeg 425 l van collageen in de pre-Mixed oplossing toe en meng door pipetten.</li>
	<li>Centrifugeer het collageen mengsel kort (minder dan 5 seconden) te scheiden en te verwijderen bubbels uit het mengsel.</li>
	<li>Houd de geneutraliseerde collageen oplossing op ijs voor 1 uur tot vezelvorming te induceren.</li>
	<li>Voeg 50 l van de cel schorsing in het collageen mengsel en meng grondig. Opmerking: de uiteindelijke collageen concentratie is 2 mg/mL.</li>
	<li>Injecteer de oplossing met 200 l pipet door de inlaat van het PDMS apparaat totdat de hele kamer is ingevuld. Als het collageen mengsel overloopt door de lacunes van de pilaren, knip de overtollige collageen gel met scherpe chirurgische mes na gelering.</li>
	<li>Houd het apparaat in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 voor 1 uur om gelering te induceren.</li>
	<li>Vul de reservoirs aan beide zijden met groeimedium en houd het apparaat in de incubator op 37 ° c met 5% CO2 tot confocale beeldvorming wordt uitgevoerd.</li>
</ol>4.3D beeldvorming en kwantificering
<ol><li>Installeer een levende-cel Imaging cultuurkamer aan een confocale Microscoop en vooraf ingesteld de temperatuur en CO2 tot 37 ° c en 5%, respectievelijk. Om vochtigheid omhoog te krijgen, voeg water in het reservoir van de kamer toe en plaats natte doekjes in de kamer indien nodig.</li>
	<li>Plaats het PDMS apparaat in de kamer en voeg EFG toe aan een van de reservoirs als "bron" van het EFG in de gradiënt formatie. Het andere reservoir zal een ' gootsteen ' dienen voor de ontwikkeling van de ruimtelijk gegradeerde EFG-verdeling. 2,5 nM EFG werd toegevoegd in de gootsteen voor het maken van de gradiënt van 0,5 nM/mm in deze studie.</li>
	<li>Stel het bereik van de Z-stack met betrekking tot het volume van de organoids van belang en start de Imaging. Let op: om fototoxiciteit te voorkomen, probeer dan een lagere Laser intensiteit in confocale beeldvorming of gebruik multi-foton Imaging technieken.</li>
	<li>Reconstrueren een 3D-beeld van 2D-afbeelding stacks met behulp van commerciële software of een op maat gemaakt programma. Meet de lengte en hoek van de takken die zich uitstrekken van de organoids of migratie van individuele cellen. Hier, uit te voeren kwantificering door het tekenen van een FreeHand schets rond de organite lichaam met behulp van ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).</li>
<li>Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+emerging+paradigms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins: emerging paradigms of signal transduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Stem+Cell+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering Stem Cell Organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li>
<li>Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+3D+matrix+microenvironment+regulates+cell+migration+through+spatiotemporal+dynamics+of+contractility-dependent+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions.</a> Nature Communications. 6, 8720(2015).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry+%28Palo+Alto%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li>
<li>Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluidic+device+to+study+directional+angiogenesis+in+complex+tissue+and+organ+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models.</a> Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+lapse+investigation+of+antibiotic+susceptibility+using+a+microfluidic+linear+gradient+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).</li>
<li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De fabricage van PDMS mallen werd uitgevoerd met behulp van een commerciële 3D print service, maar kan ook worden bereikt door een high-end 3D-printer in-House. Onder verschillende 3D fabricagemethoden, stereolithography wordt aanbevolen voor hoge resolutie schimmel generatie. Omdat PDMS uitharding op hoge temperatuur (80 °C) plaatsvindt, moeten de materialen voldoende thermisch resistent zijn, die expliciet moeten worden gespecificeerd, als het afdrukken uitbesteed is. Een thermische post-Cure kan worden besproken met d...

In fysiologische omgeving, cellen zijn ingebed in een extracellulaire matrix (ECM) en blootgesteld aan een overvloed aan biomoleculen. Interacties tussen cellen en de omliggende omgeving reguleren intracellulaire processen die diverse fenotypes beheersen, waaronder migratie, groei, differentiatie en overleving1,2. Er is veel geleerd over cellulair gedrag in een conventionele 2D-cel cultuur. Echter, met de komst van intravital Imaging en experimenten met cellen ingebed in 3D-hydrogels, belangrijke verschillen in cel gedrag zijn erkend in de vereenvoudigde 2D in vitro culturen versus 3D-weefsel-achtige omgevingen. Terwijl de cellen interageren met ECM vezels en de betekenis van hun mechanische eigenschappen binnen de 3D-matrix, de materiële stijfheid van de gel is niet een volledig onafhankelijke variabele in een 2D in vitro-systeem. De dimensionaliteit verandert focal adhesie vorming, wat resulteert in verschillende cel morfologie en gedrag. Bovendien zijn cellen op een 2D-oppervlak blootgesteld aan minder signalering cues dan cellen open voor alle richtingen in 3D.
Deze beperkingen hebben de belangen verhoogd voor 3D-systemen die de ruimtelijke en chemische complexiteit van levende weefsels vertegenwoordigen en beter voorspellen in vivo weefsel functies. Zij zijn ontwikkeld in vele vormen van organoids als zelf-assembleert cellulaire microstructuren aan cellen die willekeurig in ECM worden gestrooid3,4. Recente ontwikkelingen in de microfabricage technologieën hebben de komst van verschillende soorten 3D-cultuursystemen5,6,7,8,9 voor het bestuderen van fenotypische veranderingen en cellulaire reacties op oplosbare signalen; technologische belemmeringen beperken echter het wijdverbreide gebruik in onderzoekslaboratoria. In veel gevallen, de fabricageprocessen vereisen fotolitho grafie technieken en achtergrondkennis voor zachte lithografie. Bovendien moeten verschillende factoren worden gecontroleerd om met succes een apparaat te bouwen en om een optimale functie van het apparaat te bereiken over een lange periode van tijd.
Onze methode beschrijft hoe een 3D PDMS apparaat te construeren voor de integratie van cellen en multicellulaire organoids in een 3D-omgeving met gedefinieerde chemoattractant gradiënten en vervolgens te analyseren epitheel reacties op EFG10. Uit onze gegevens blijkt dat de capaciteit van organoids om te reageren op ondiepe EFG-gradiënten voortvloeit uit intercellulaire chemische koppeling door gap junctions. Het suggereert het potentieel van organoids voor een nauwkeurigere opsporing van zwakke en lawaaierige ruimtelijk gegradeerde ingangen. Het fabricageproces vereist geen cleanroom installatie, noch fotolitho grafie technieken. Echter, de 3D PDMS apparaat bevat de nodige factoren van 3D fysiologische omgeving. Deze methode zal nuttig zijn om 3D cellulair gedrag te bestuderen en het heeft groot onderzoekpotentieel met verschillende cel types, chemoattractants, en ECM combinaties.

<table><tbody><tr><td>22mm x 22mm dekglas&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Collageen I, Rat</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics 4.2</td><td>COMSOL Inc</td><td></td><td>Gebruikt voor het simuleren van diffusiedynamica</td></tr><tr><td>10x DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>DEME/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4623</td><td></td></tr><tr><td>EGF Recombinant Muis-Eiwit</td><td>Thermo Fisher</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Gebruikt voor het meten van vertakkingslengte en hoeken</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>5750-060</td><td></td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrine-Selenium-X</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>Weinig pluis tissue</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>Kimtech doek</td><td></td></tr><tr><td>Materiaal voor mal</td><td>Proto labs</td><td>Accura SL5530&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur voor malprinten</td><td>Proto labs</td><td>Stereolithogrphy</td><td>Maximale afmeting: 127mm x 127mm x 63.5mm, Laagdikte: 0.0254mm</td></tr><tr><td>Dienst voor malprinten</td><td>Proto labs</td><td>Aangepast</td><td>https://www.protolabs.com/</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>VWR</td><td>16777-164P</td><td></td></tr><tr><td>Spinning-disk confocale microscoop</td><td>Solamere Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>184 SIL ELAST KIT&nbsp;</td><td>PDMS kit</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935</td><td></td></tr></tbody></table>

3d-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Verschillende beperkingen van de 2D-cel cultuursystemen hebben gevonkt interesse in 3D-cel cultuur en analyse platforms, die beter zou nabootsen van de ruimtelijke en chemische complexiteit van levende weefsels en na te bootsen in vivo weefsel functies. Recente ontwikkelingen in de microfabricage technologieën hebben de ontwikkeling van 3D in vitro omgevingen vergemakkelijkt waarin cellen kunnen worden geïntegreerd in een goed gedefinieerde extracellulaire matrix (ECM) en een gedefinieerde set van oplosbare of matrix geassocieerde biomoleculen. De technologische belemmeringen hebben echter hun wijdverbreide gebruik in onderzoekslaboratoria beperkt. Hier beschrijven we een methode om eenvoudige apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids in 3D-micromilieus met een gedefinieerde chemoattractant gradiënt. Wij illustreren het gebruik van dit platform voor de analyse van de respons van epitheelcellen en organoids naar gradiënten van groeifactoren, zoals epidermale groeifactor (EFG). EFG gradiënten waren stabiel in de apparaten voor enkele dagen die leiden tot gerichte Branch vorming in de borst organoids. Deze analyse konden we concluderen dat collectieve gradiënt sensing door groepen van cellen is gevoeliger versus enkele cellen. We beschrijven ook de fabricagemethode, die niet nodig fotolitho grafie faciliteiten, noch geavanceerde zachte lithografie technieken. Deze methode zal nuttig zijn om 3D cellulair gedrag te bestuderen in de context van de analyse van de ontwikkeling en pathologische staten, met inbegrip van kanker.

EFG is een essentiële regulator van vertakking morfogenese in de borstklieren en een kritische chemoattractant het begeleiden van de migratie van borst epitheelcellen in invasieve groei van kanker. We gebruikten de mesoscopische vloeibare apparaten hierboven beschreven om de reactie van cellen te bestuderen om gedefinieerde EFG gradiënten (Figuur 1a, B)10. Het apparaat levert een cultuurgebied van 5 mm breed, 10 mm lan...

We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Verschillen in vereenvoudigde 2D in vitro culturen versus 3D weefsel-achtige omgevingen hebben de interesse in 3D-systemen om de ruimtelijke en chemische complexiteit van levende weefsels vertegenwoordigen toegenomen. Het fabricageproces vereist geen facilitaire of fotolithografietechnieken. Het 3D PDMS-apparaat bevat echter de nodige vectoren voor 3D-fysiologische omgevingstoepassingen.Voor mesofluidic apparaat voorbereiding, gebruik maken van een passende drie-dimensionale computer-aided ontwerp software programma om het masker van de mal te ontwerpen voor de polydimethylsiloxane of PDMS apparaat en print de mal met behulp van stereo lithografie apparatuur met een thermoresistant hars. Wanneer de mal klaar is, ongeveer meng drie milliliter PDMS monomeer oplossing per mal met een uithardingsmiddel op een 10 tot een verhouding en gebruik een vacuüm om het mengsel te ontgassen in een vacuüm desiccator voor een uur. Gebruik aan het einde van de uitdroging een stuk plakband om stof van het oppervlak van de mal te verwijderen en vul de mal voorzichtig met de ontgasseerde PDMS-oplossing.Vervolgens moet u de PDMS twee uur lang op 80 graden Celsius cureren voordat de mal bij kamertemperatuur kan afkoelen. Wanneer de mal wordt gekoeld aan de aanraking, gebruik een mes om de grens tussen de mal en PDMS snijden en zorgvuldig schil de PDMS uit de mal. Trim de PDMS om een 22 bij 22 millimeter coverslip passen en punch een gat op de inlaat.Veeg met lage pluisweefsels en 70% ethanol het apparaat en de coverslip af en dep het apparaat met een nieuw stuk plakband om grote stofdeeltjes te verwijderen. Dan autoclave de PDMS-apparaat en coverslip op 121 graden Celsius gedurende acht minuten nat en 15 minuten droog en behandel het onderste oppervlak van de PDMS deel en coverslip met een corona ontlading pistool gedurende vijf minuten in een weefsel cultuur kap voor de binding van de stukken samen. Om het apparaat te laden, eerst de cellen van belang opnieuw op te stellen in een passend volume groeimedium aangevuld met 1%penicilline en streptomycine en 1%insuline-transferrine-selenium-x.Vervolgens meng 50 microliters van de borstkliercelsuspensie met 425 microliter vers bereide geneutraliseerde collageenoplossing en vul een pipet van 200 microliter met de collageencelsuspensie. Injecteer de suspensie via de inlaat in het PDMS-apparaat totdat de hele kamer is gevuld en plaats het apparaat in de couveuse op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende een uur om gelatie te induceren voordat ze de reservoirs aan beide zijden vullen met groeimedium en het apparaat terug te brengen naar de couveuse tot confocale beeldvorming. Voor 3D-beeldvorming en kwantificering installeer je een live celbeeldvormingscultuurkamer op een confocale microscoop en stel je de temperatuur en kooldioxide vooraf op respectievelijk 37 graden Celsius en 5%.Voeg water toe aan het reservoir van de beeldkamer om de kamer te bevochtigen, plaats indien nodig natte doekjes in de kamer en plaats het PDMS-apparaat in de kamer. Voeg epidermale groeifactor aan een van de reservoirs als een bron van de factor in de gradiënt vorming waardoor het andere reservoir om te dienen als een gootsteen voor de ontwikkeling van de ruimtelijk gesorteerde epidermale groeifactor verdeling. Stel vervolgens het bereik van de Z-stack in voor het volume van organoïden van belang en start de beeldvorming.Gebruik aan het einde van het experiment een geschikt beeldanalyseprogramma om de lengte en hoek van de takken te meten die zich uitstrekken van de organoïden of de migratie van individuele cellen. Zowel in silico als in vitro tests bleek de vorming van een stabiele lineaire epidermale groeifactor gradiënt over de celcultuur gebied dat duurt ongeveer twee dagen zonder aanvulling van de bron of gootsteen reservoirs wat suggereert dat de epidermale groeifactor, een 6,4 kilodalton eiwit, kan een stabiele diffusie-gebaseerde gradiënt vormen binnen een collageen gel bereid zoals aangetoond over een relatief korte periode van tijd. Borstorganoïden vormen meerdere takken in aanwezigheid van ruimtelijk uniforme 2,5 nanomolar epiderale groeifactor zonder directionele bias gedurende drie dagen als epidermale groeifactor wordt toegevoegd in de lineaire gradiënt om 0,5 nanomolar per milliliter te hebben.De takvorming vertoont echter een significante directionele bias. Van nota, onderdrukt de toevoeging van de remmers van de hiaatverbinding het vermogen van organoïden om op de gradiënt te antwoorden. De pH van collageen oplossing is van cruciaal belang voor de gelatie en de levensvatbaarheid van de cel.Als het collageen niet wordt geneutraliseerd voor het mengen, zal de levensvatbaarheid van de cel laag zijn. Deze methode kan worden uitgebreid om meer realistische weefsel modellering tegemoet te komen en kan vasculaire netwerkvorming van individuele cellen in de gel tegemoet te komen.

3d-analysis-of-multi-cellular-responses-to-chemoattractant-gradients

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten van chemoeffectors.

Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

Een benadering om de migratie van cellen geëxplanteerde (trunk neurale cellen) analyseren beschreven. Deze methode is goedkoop, zacht en kunnen onderscheiden chemotaxis van zowel chemokinesis en andere invloeden op trekkende polariteit zoals die afgeleid van cel-cel interacties in de primaire neurale stam celkweek.

Analyse van Trunk neurale cel migratie met behulp van een gewijzigd Zigmond Kamer Assay

This video demonstrates neutrophil chemotaxis assay using an all-on-chip method. The method allows direct isolation of neutrophils from the whole blood by immunomagnetic negative selection followed by chemotaxis assay on a microfluidic chip.

A Microfluidic Chip-Based Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Using Whole Blood

Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

De driedimensionale stroom kamer inrichting een...

A Novel Driedimensionale Flow Kamer Device aan chemokine-gerichte extravasatie van Cellen doorgeven Studie onder Fysiologische stroomtoestanden

Celmigratie is een belangrijk onderdeel van de menselijke ontwikkeling en het leven. Om de mechanismen te begrijpen die celmigratie kunnen veranderen, presenteren we een planar gradient diffusiesysteem om chemotaxis in een 3D collageenmatrix te onderzoeken, waardoor men de moderne diffusiekamerbeperkingen van bestaande assays kan overwinnen.

Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix

Visual chemotaxis assays zijn essentieel voor een beter begrip van hoe eukaryotische cellen te controleren-chemoattractant gemedieerde directionele cel migratie. Hier beschrijven we gedetailleerde methoden voor: 1) real-time, hoge-resolutie controle van meerdere chemotaxis assays, en 2) tegelijkertijd het visualiseren van de chemoattractant gradiënt en de spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in neutrofielen-achtige HL60 cellen.

Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

Dit artikel geeft de gedetailleerde methode om een ​​snelle neutrofiele chemotaxis-analyse te verrichten door de integratie van de on-chip neutrofiele isolatie uit volledig bloed en de chemotaxis-test op een enkele microfluïdische chip.

Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

Hier beschrijven we methoden voor de beoordeling van de cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie. In de microscopie gebaseerde assay onderzoeken we lokalisatie van fluorescently-geëtiketteerden biosensoren na korte stimulatie met schuintrekken stroom. We testen ook activering van verschillende eiwitten van belang in reactie op acute mechanische stimulatie biochemically.

Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie

Collectieve Celmigratie in ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen wordt vaak geleid door de gradiënten van groeifactoren of signalering van moleculen. Hier beschreven is een experimenteel systeem dat tractie microscopie combineert met een microfluïdisch systeem en een demonstratie van het kwantificeren van de mechanica van collectieve migratie onder biochemische gradiënt.

Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie

Leer een 3D PDMS-cultuurmethode voor celbiologisch onderzoek met chemoattractant gradiënten. Dit platform analyseert multi-cellulaire reacties en toont aan dat organoïden zwakkere signalen detecteren dan enkele cellen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Meer video's verkennen