Gebruik van virale vermelding testen en moleculaire docking analyse voor de identificatie van antivirale kandidaten tegen Coxsackievirus A16

Dit protocol kan helpen bij de ontdekking van potentiële antivirale kleine moleculen door middel van een mechanisme-gedreven aanpak. De tijd van toevoegingstest bepaalt bij welke stap van de infectie het kleine molecuul zijn antivirale activiteit vertoont. Moleculair docking voorspelt de interactie tussen het kleine molecuul en de virale eiwitten.

Om de invloed van geneesmiddelen op gastheercellen voorafgaand aan virale infectie te evalueren, zaad RD cellen in 12-well platen op een twee keer 10 tot de vijfde cellen per goed plating dichtheid. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius in een 5%kooldioxide incubator 's nachts. De volgende ochtend, behandel elke put van de RD monolayer met een test verbinding van belang, in drievoud, bij niet-toxische concentraties in een milliliter basale medium gedurende een of vier uur.

Aan het einde van de behandeling incubatie, was de cellen met een milliliter PBS alvorens 50 plaque-vormende eenheden van het virus in 300 microliters van basale medium per put gedurende een uur, met schommelen om de 15 minuten. Aan het einde van de infectie incubatie, was de cellen met PBS en overlay de cellen met een milliliter vers basaal medium met 0,8% methylcellulose. Na 72 uur in de celkweek incubator, was elk goed met twee milliliter PBS en bevestig de cellen met 0,5 milliliter van 37% formaldehyde per put gedurende 15 minuten.

Aan het einde van de fixatie, was de putten met PBS en bevlek de cellen met 0,5 milliliter van 0,5% kristal violet oplossing per put. Na twee minuten, was de putten met een zachte stroom van water en laat de plaat te drogen. Plaats vervolgens de plaat op een witte lichtbak voor het tellen en bereken het percentage coxsackievirus geïnfecteerde cellen volgens de formule.

Voor moleculaire docking analyse, download 3D moleculen van de testverbindingen van PubChem. Als een molecuul geen 3D-structuur heeft geüpload, download dan de 2D-structuur of gebruik de SMILE-snaarsequentie om de structuur via een geschikt moleculair programma om te zetten in een 3D-molecuul. Download vervolgens een virale biologische assemblage-eenheid van RCSB Protein Data Bank.

Verwijder met behulp van een geschikt bio-computingprogramma de oplosmiddelen uit het Protein Data Bank-bestand, vervang de onvolledige zijketens met behulp van gegevens uit de Dunbrack 2010 rotamerbibliotheek en voeg waterstof en kosten toe aan de structuur zoals eerder gemeld. Om de testverbindingen aan te meren op de voorbereide viruseenheid, uploadt u het bestand van de testverbinding naar de Universiteit van Californië San Francisco Chimera als ligand en selecteert u het hele voorbereide virale eiwit als de receptor om blind docking uit te voeren. Voor extra docking, beperken de docking site op het virale eiwit tot regio's van belang afgeleid van de blinde docking resultaten door het verder verminderen van het zoekvolume.

Upload vervolgens het dockingbestand in een geschikt moleculair grafisch systeem om de bindingsposities te analyseren. Selecteer de ligand om polaire contacten te vinden van de verbinding naar het virale eiwit, het identificeren van de polaire contacten met de aan eventuele atomen optie. Beide kleine moleculen getest in dit representatieve experiment, alleen geproduceerd een marginaal effect tegen het coxsackievirus A16 infectiviteit, of in de voorbehandeling van de gastheercellen voorafgaand aan virale infectie of in de post-infectie behandeling.

In tegenstelling, de moleculen efficiënt ingetrokken de infectie met meer dan 80% in de co-toevoeging behandeling, wat suggereert dat de twee verbindingen zijn het meest effectief wanneer ze gelijktijdig aanwezig zijn met het virus deeltjes op het oppervlak van de gastheercel tijdens de infectie. Flow cytometrie gebaseerde bindende analyse bevestigt dat de twee tannines voorkomen coxsackievirus A16 infectiviteit binnenkomst door het voorkomen van virale deeltjes binding aan de gastheercellen. Moleculaire docking van de tannines geeft aan dat ze beide worden voorspeld te binden in de canyon regio van het coxsackievirus pentamer, net boven de zak ingang die de zak factor houdt en speelt een belangrijke rol voor het bemiddelen coxsackievirus binding en binnenkomst in de host cel.

In deze oppervlakteprojecties kunnen de unieke resten die worden voorspeld uit de polaire contacten van de kleine moleculen rond de zakingang worden waargenomen, met asparagine-85, lysine-257 en asparagine-417 gemeen tussen de twee tannines. Voor moleculair docking moet rekening worden gehouden met de topologie van het virale eiwit bij het rangschikken van de bindingsframes. Aanvullende experimenten kunnen onder meer het testen van de antivirale activiteit van de verbinding op recombinant virussen, met mutaties op de aminozuren ontdekt om hun belang voor de werkzaamheid van het geneesmiddel te valideren.