Name: Gebruik van virale vermelding testen en moleculaire docking analyse voor de identificatie van antivirale kandidaten tegen Coxsackievirus A16 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Ontdek mechanismegedreven methoden voor het identificeren van antivirale kandidaten tegen Coxsackievirus A16. Dit protocol combineert virale vermeldingstesten en moleculaire docking om effectieve entry-remmers te vinden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn dankbaar voor Dr. Joshua Beckham aan de Universiteit van Texas in Austin voor technische ondersteuning met moleculaire docking. Deze studie werd deels gesteund door de financiering van het ministerie van Wetenschappen en technologie van Taiwan (MOST107-2320-B-037-002 naar C.-J.L. en L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 en MOST107-2320-B-038-034-MY3 naar L.-T.L.).

Opmerking: Alle celkweek en virus infecties moeten worden uitgevoerd in gecertificeerde bioveiligheidskappen die geschikt zijn voor het bioveiligheidsniveau van de behandelde monsters. De twee tannine-klasse van kleine moleculen chebulagic zuur (CHLA) en punicalagin (PUG), die werden waargenomen om efficiënt te blokkeren CVA16 infectie9, worden gebruikt als voorbeelden van kandidaat-remmende agenten. Voor de basisbeginselen in virologie technieken, virusvermeerdering, bepaling van de virus titer en concepten van plaquevormende eenheden (PFU) of multipliciteit van infectie (MOI) wordt de lezer verwezen naar referentie10.
1. celkweek, virus voorbereiding, samengestelde bereiding en samengestelde cytotoxiciteit
<ol><li>Humane rabdomyosarcoom (RD) cellen zijn gastheer cellen permissieve CVA16 infectie11. Kweek de RD-cellen in 10 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 200 U/mL penicillaire G, 200 μg/mL streptomycine en 0,5 μg/mL amfotericine B in T-75 kolven bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator.</li>
	<li>Bereid CVA16 door het virus door te propageren in RD-cellen en bepaal virale titer in PFU/mL. Voor een geoptimaliseerd protocol verwijzen wij u naar referentie11.</li>
	<li>Bereid de teststoffen en controles met behulp van hun respectieve oplosmiddelen: bijvoorbeeld, los CHLA en PUG in Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO). Voor alle infectie stappen bestond het basale medium uit DMEM plus 2% FBS en antibiotica. Opmerking: De uiteindelijke concentratie van DMSO in de test samengestelde behandelingen is gelijk aan of lager dan 0,25% in de experimenten; 0,25% DMSO is opgenomen als een negatieve controle behandeling in de assays ter vergelijking.</li>
	<li>Voer cytotoxiciteitstest van de teststoffen op de RD-cellen uit met behulp van een levensvatbaarheid van de cel die de bepaling van het reagens, zoals XTT ((2, 3-bis [2-methoxy-4-Nitro-5-sulfophenyl), 5fenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide). Voor een gedetailleerd protocol verwijzen wij u naar referentie12. Bepaal de cytotoxiciteits concentraties van de teststoffen met behulp van een analytische software zoals GraphPad Prism volgens het Protocol van de fabrikant. Voor de rest van de studie worden geneesmiddelconcentraties gebruikt die de levensvatbaarheid van de cel (≥ 95% levensvatbare cellen) niet significant beïnvloeden.</li>
</ol>2. time-of-drug-additie test
<ol><li>
Om de invloed van geneesmiddelen op gastheer cellen voorafgaand aan virale infectie te evalueren (voor behandeling)
	<ol>
<li>Zaad RD cellen in 12-put platen bij een zaaien dichtheid van 2 x 105 cellen/goed. Incubate 's nachts bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 om een monolayer te verkrijgen.</li>
		<li>Behandel RD-cellen met teststoffen bij niet-cytotoxische concentraties (bepaald vanaf stap 1,4) in 1 mL basaal mediavolume gedurende 1 uur of 4 uur.</li>
		<li>Was cellen met 1-2 mL PBS voordat u 50 PFU/well van het virus toevoegt in het basale medium (het eindvolume van het entmateriaal is 300 μL) gedurende 1 uur. Rock de plaat elke 15 min.</li>
		<li>Na de infectie, was de monolagen opnieuw met PBS en vervolgens met 1 ml basale media met 0,8% Hydroxypropyl methylcellulose voor verdere incubatie bij 37 °c in een incubator van 5% Co2 .</li>
		<li>Na 72 h van incubatie, verwijder de overlay media en was de putten met behulp van 2 mL PBS.</li>
		<li>Fixeer de putjes met 0,5 mL 37% formaldehyde gedurende 15 min.</li>
		<li>Verwijder de supernatant en spoel opnieuw met PBS.</li>
		<li>Beits de putjes met 0,5 mL 0,5% kristalvioletoplossing. Verwijder vervolgens de vlek oplossing binnen 2 minuten en was de putjes met een zachte waterstroom voor het drogen van de lucht.</li>
		<li>Tel de virale plaques door de plaat op een wit-lichtbak te plaatsen. Bereken het percentage (%) CVA16 infectie als volgt: (gemiddelde # van plaque virus + drug /mean # van plaque virus + DMSO controle) × 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Om te evalueren van het effect van het toevoegen van de drugs en het virus gelijktijdig (co-toevoeging)
	<ol>
<li>Zaad RD cellen in 12-put platen bij een zaaien dichtheid van 2 x 105 cellen/goed. Incubate 's nachts bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 om een monolayer te verkrijgen.</li>
		<li>Behandel RD-cellen met de teststoffen in de juiste concentraties en 50 PFU/well van CVA16 (het eindvolume van het entmateriaal is 300 μL) tegelijkertijd gedurende 1 uur. Rock de plaat elke 15 min.</li>
		<li>Was cellen met 1 ml PBS en vervolgens bedekt met 1-2 ml basale media met 0,8% Hydroxypropyl methylcellulose voor verdere incubatie bij 37 °c in een incubator van 5% Co2 .</li>
		<li>Vlek virale plaques met kristalviolet na 72 h na infectie en bepaal de% CVA16 infectie zoals hierboven beschreven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Om het effect van medicamenteuze behandeling te evalueren na virale binnenkomst (na infectie)
	<ol>
<li>Zaad RD cellen in 12-put platen bij een zaaien dichtheid van 2 x 105 cellen/goed. Incubate 's nachts bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 om een monolayer te verkrijgen.</li>
		<li>Beënt de RD-cellen met 50 PFU/well van CVA16 (het eindvolume van het entmateriaal is 300 μL) voor 1 uur. Rock de plaat elke 15 min.</li>
		<li>Was de putjes met 1-2 ml PBS en overlay de cellen met basale media met 0,8% Hydroxypropyl methylcellulose en de juiste concentraties van teststoffen.</li>
		<li>Vlekken virale plaques met kristalviolet en tellen na 72 h na infectie en bepalen de% CVA16 infectie incubaties hierboven beschreven. Opmerking: Voer alle PBS-spoelingen zachtjes uit om te voorkomen dat de cellen worden opgeheven.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. op flow Cytometrie gebaseerde binding assay
<ol><li>Zaad RD cellen in 12-put platen bij een zaaien dichtheid van 2 x 105 cellen/goed. Incubate 's nachts bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 om een monolayer te bereiken.</li>
	<li>Pre-Chill de celmonolayer bij 4 °C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Infecteren RD-cellen met CVA16 (MOI = 100) in aanwezigheid en afwezigheid van de teststoffen voor 3 uur bij 4 °C. Opmerking: Voer de virale inoculatie op ijs uit en de daaruit voortvloeiende incubatie in een koelkast van 4 °C om de temperatuur bij 4 °C te houden, wat virale binding maar geen toegang toestaat.</li>
	<li>Verwijder Virus entmateriaal en was één keer met 1-2 ml ijskoude PBS.</li>
	<li>Hef cellen op door 1 mL ijskoude dissociatie buffer toe te voegen aan de putjes op ijs gedurende 3 minuten, voordat de cellen worden verzameld en in ijskoude stromings cytometrie buffer (1x PBS plus 2% FBS) te worden opgesuspencte.</li>
	<li>Was cellen tweemaal met behulp van de ijskoude flow cytometrie buffer en fixeer de cellen met 0,5 mL 4% Paraformaldehyde voor 20 min op ijs.</li>
	<li>Was de cellen met PBS om niet-afhankelijke of zwak gebonden virussen te verwijderen en beits vervolgens de cellen met 1 mL anti-VP1 antilichaam (1:2000; in PBS met 3% BSA) op ijs gedurende 1 uur, gevolgd door incubatie met een secundaire Alexa 488-geconjugeerde anti-muis IgG (1:250; verdund in PBS met 3% BSA) op ijs gedurende 1 uur. Voer PBS wast (3 keer) uit na elke behandeling met antilichamen.</li>
	<li>Respendeer de cellen in 0,5 mL van de ijskoude flow cytometrie buffer en voer een flow cytometrie analyse uit op een flow cytometer met behulp van standaardprocedures. Presenteer gegevens in histogrammen met behulp van de bijbehorende software en quantitate voor de weergave van staafgrafieken.</li>
</ol>4. virale inactivatie assay
<ol><li>
Voer de virale inactivatie assay uit zoals eerder beschreven12 aan de hand van de volgende voorwaarden: -Een start concentratie van 106 Pfu/ml CVA16. -RD Cell monolagen in 12-well platen van een zaaien dichtheid van 2 x 105 cellen/goed. -50-voudige verdunning voor het titreren van de geneesmiddel verbindingen, resulterend in een uiteindelijke virusconcentratie van 50 PFU/well. -Wash stappen met 1-2 mL PBS. -Overlay media met 0,8% methylcellulose.</li>
	<li>Voer definitieve uitlezen van virale infectie uit met behulp van de Crystal Violet kleuring van virale plaques procedure zoals hierboven beschreven.</li>
</ol>5. moleculaire docking analyse
<ol><li>Download 3D moleculen van teststoffen van PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Als moleculen geen 3D-structuur hebben geüpload, downloadt u de 2D-structuren of gebruikt u de reeks van de SMILES-reeks en transformeert u deze in 3D-moleculen via een moleculair programma (bijv. CORINA).</li>
	<li>Download virale biologische assemblage-eenheid van RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) en bereid het virale structuur model met behulp van een biocomputing-programma (bijv. UCSF Chimera). Bijvoorbeeld, in het geval van CVA16 volwassen virion kristalstructuur (PDB: 5C4W)3, verwijder oplosmiddelen uit het PDB-bestand, vervang onvolledige zijketens met behulp van gegevens uit de Dunbrach 2010 Rotamer Library, en voeg hydro genen en ladingen toe aan de structuur als eerder gerapporteerde13. Docking targets kunnen alle relevante virale eiwitten zijn voor de beoogde analyse met een biologische assemblage informatie (Protein Data Bank).</li>
	<li>
Dock teststoffen op de bereide virus eenheid met bijvoorbeeld UCSF Chimera, en analyseer de uitvoerbestanden met een visualisatiesoftware (bijv. autodock Vina, PyMol):
	<ol>
<li>Upload het test samengestelde bestand in UCSF Chimera als de ' ligand ' en voer blind docking uit door het hele bereide virale eiwit als de ' receptor ' te selecteren. Gebruik de computermuis of het trackpad om het formaat van het zoekvolume te wijzigen in de volledige ' receptor '. Geef in ' Geavanceerde opties ' het aantal bindings modi maximaal op. Docking frames worden automatisch gerangschikt van hoogste naar laagste bindende energie.</li>
		<li>Optionele Verder naar blind docking, beperk de docking-site tot het virale eiwit in regio's van belang afgeleid van de blind docking resultaten met behulp van de muis of het trackpad opnieuw om het zoekvolume te verminderen (bijv., 100 Å x 100 Å x 100 Å). Deze stap helpt bij het bevestigen van de blind docking resultaten en verhoogt de specificiteit.</li>
		<li>Gebruik een moleculair grafisch systeem (bijv. PyMol) om de posities van de bindings modi te analyseren door het docking-bestand te uploaden. Vind polaire contacten van de compound naar het virale eiwit door de ' ligand ' te selecteren en polaire contacten te identificeren met de optie ' naar een atomen '; Bekijk de resultaten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li>
<li>Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A16+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A16 infection.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coxsackievirus+A16+capsids+with+native+antigenicity%3A+implications+for+particle+expansion%2C+receptor+binding%2C+and+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity.</a> Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).</li>
<li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+is+a+functional+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor+B2+is+a+cellular+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+SCARB2-dependent+infection+by+coxsackievirus+A7%2C+A14%2C+and+A16+and+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71.</a> Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolyzable+tannins+%28chebulagic+acid+and+punicalagin%29+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiology. 13, 187(2013).</li>
<li>Lin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+targeting+coxsackievirus+A16+capsid+inactivate+viral+particles+and+prevent+viral+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding.</a> Emerging Microbes & Infections. 7, 162(2018).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+Virology%22">Principles of Virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Velu, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BPR-3P0128+inhibits+RNA-dependent+RNA+polymerase+elongation+and+VPg+uridylylation+activities+of+Enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71.</a> Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).</li>
<li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124(2015).</li>
<li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOCK+6%3A+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes & Infections. 6, 65(2017).</li>
<li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWISS-MODEL%3A+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.

In dit verslag hebben we de protocollen beschreven die nuttig zijn voor de identificatie van antivirale kandidaten die een virus vermelding targeten, met name tegen de niet-omhulde CVA16. De assays zijn ontworpen op manieren om de vroege gebeurtenissen tijdens virale binnenkomst te ontleden, wat nuttig is om het mechanisme (s) van actie en mogelijke doel (en) van de antivirale activiteit van de test agenten te verduidelijken. De ' time-of-drug-additie assay ' maakt het mogelijk om het potentiële doelwit van de teststoffe...

Hand-, voet-en mond ziekte (HFMD) is een ziekte die meestal wordt veroorzaakt door Coxsackievirus A16 (CVA16) en enterovirus 71 (EV71) bij jonge kinderen. Onlangs in de regio Azië-Pacific, is er een belangrijke uptick in CVA16-geïnduceerde HFMD. Terwijl de symptomen kunnen mild zijn, ernstige complicaties kunnen optreden die invloed hebben op de hersenen en het hart, met potentiële fataliteit1,2. Op dit moment zijn er geen gelicentieerde antivirale therapieën of vaccinaties beschikbaar voor CVA16, en daarom is er een dringende behoefte om antivirale strategieën te ontwikkelen om toekomstige uitbraken en de bijbehorende complicaties te beteugelen.
CVA16 is een niet-omhuld virus dat een icosahedrale capside heeft samengesteld van pentamers die elk 4 structurele eiwitten bevatten, namelijk VP1, VP2, VP3 en VP4. Het omcirkelen van elke vijf-voudige as in de pentamer is een ' kloof ' regio die toont als een depressie en staat bekend om zijn rol in receptor binding3. Aan de onderkant van deze kloof ligt een hydrofoob zak in de VP1 regio die een natuurlijke vette ligand met de naam sfingosine (SPH) bevat. Cellulaire receptoren, zoals Human P selectin glycoproteïne ligand 1 (PSGL-1) en Scavenger receptor klasse B lid 2 (SCARB2), zijn gesuggereerd om een rol te spelen in virale binding door het verplaatsen van deze ligand die resulteert in conformationele veranderingen aan de capside en de daaropvolgende uitwerpen van virale genoom in de ontvangende cel4,5,6. Identificeren van mogelijke remmers die de opeenvolgende gebeurtenissen in de virale entry proces blokkeren zou kunnen bieden potentiële therapeutische strategieën tegen CVA16 infectie.
De stappen in de levenscyclus van het virus kunnen worden ontleed door middel van experimentele benaderingen als doelen om te helpen identificeren van de modus-specifieke antivirale middelen. Een analyse van de tijd van de drug-aanvulling onderzoekt het effect van de drug behandeling op verschillende tijdstippen tijdens de virale infectie, met inbegrip van pre-entry (toegevoegd voorafgaand aan de virus infectie), binnenkomst (toegevoegd gelijktijdig aan de virus infectie), en post-entry (toegevoegd na de virus infectie)7. De impact kan worden beoordeeld aan de hand van een standaard plaque test door het aantal virale plaques dat in elk van de behandelings condities wordt gevormd te kwantificen. De flow cytometrie gebaseerde virale bindings test bepaalt of het medicijn virale gehechtheid aan cellen voorkomt. Dit wordt bereikt door de temperatuur te verschuiven van 37 °C, waarbij de meerderheid van de menselijke virus infecties optreedt, tot 4 °C, waar de virionen kunnen binden aan het hostceloppervlak, maar niet in staat zijn om de cellen7in te voeren. De celmembraan-gebonden virusdeeltjes worden vervolgens gekwantificeerd door middel van immunokleuring tegen virale antigenen en beoordeeld door flow cytometrie. De virale inactivatie test aan de andere kant helpt bij het beoordelen van mogelijke fysieke interacties van het medicijn met vrije virusdeeltjes, het afschermen of neutraliseren van de virionen, of het veroorzaken van aggregaties of conformationele veranderingen die hen inactief maken voor daaropvolgende interacties met het oppervlak van de host-cel tijdens de infectie8,9. In dit experiment mag het virale entmateriaal eerst met het medicijn worden geïnpost voordat het wordt verdund om het geneesmiddel te titreren voorafgaand aan het infecteren van de monolaag van de host-cel en het uitvoeren van een standaard plaque assay8. Tot slot is moleculair docking een krachtig hulpmiddel om mogelijke geneesmiddelinteractie sites op het virion-oppervlak te voorspellen, waaronder de virale glycoproteïnen van omhulde virussen en de virale capside-eiwitten van niet-omhulde virussen, door gebruik te maken van computationele Algoritmen. Dit helpt bij het mechanistisch lokaliseren van de doelstellingen van de werkingsmodus van de drug en bieden nuttige informatie die verder kan worden gevalideerd door downstream assays.
We hebben onlangs de hierboven beschreven methoden gebruikt om antivirale verbindingen te identificeren die een efficiënte geblokkeerde infectie door de niet-omhulde CVA169. Hierin worden de gebruikte gedetailleerde protocollen beschreven en besproken.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>AL-158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-geconjugeerd anti-muis IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VP1 antilichaam</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB979</td><td>Anti-Enterovirus 71 antilichaam, reageert kruis met Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Corina</td><td>Molecular Networks GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kristalviolet</td><td>Sigma</td><td>C3886-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparine-natriumzout</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>In vitro toxicologie assay kit, XTT-gebaseerd</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0512-100G</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PyMol</td><td>Schr&ouml;dinger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>University of California, San Francisco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik van virale vermelding testen en moleculaire docking analyse voor de identificatie van antivirale kandidaten tegen coxsackievirus a16

Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

Antivirale testen die de virale binnenkomst mechanisch onderzoeken zijn relevant om te onderscheiden in welke stap de geëvalueerde agenten het effectiefst zijn, en zorgen voor de identificatie van kandidaatvirale invoer remmers. Hier presenteren we de experimentele benaderingen voor de identificatie van kleine moleculen die een infectie kunnen blokkeren door de niet-omhulde Coxsackievirus A16 (CVA16) door de virusdeeltjes of specifieke stappen in de vroege virale invoer te targeten. Assays omvatten de tijd-van-drug-optellen analyse, flow cytometrie gebaseerde virale binding Assay, en virale inactivatie assay. We presenteren ook een moleculair docking protocol dat gebruik maakt van virus capside-eiwitten om potentiële residuen te voorspellen die zijn gericht op de antivirale verbindingen. Deze assays moeten helpen bij de identificatie van de kandidaat-antivirale middelen die op virale binnenkomst handelen. Toekomstige richtingen kunnen deze mogelijke remmers verkennen voor verdere ontwikkeling van de drug.

De tijd-van-drug-additie test is aangegeven in Figuur 1 en toont de invloed van de behandeling met behulp van de kleine moleculen CHLA en Pug op CVA16 infectie ofwel pre-virale binnenkomst (voor behandeling), tijdens virale binnenkomst (co-toevoeging), of post-virale vermelding ( na infectie). Beide kleine moleculen produceerden slechts marginale impact tegen CVA16 infectiviteit, hetzij in de voor behandeling van de gastheer cellen vóór virale infectie (<stro...

Het doel van het protocol is het illustreren van de verschillende assays met betrekking tot virale vermelding die kan worden gebruikt om kandidaat-virale invoer remmers te identificeren.

Gebruik van virale vermelding testen en moleculaire docking analyse voor de identificatie van antivirale kandidaten tegen Coxsackievirus A16

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

Dit protocol kan helpen bij de ontdekking van potentiële antivirale kleine moleculen door middel van een mechanisme-gedreven aanpak. De tijd van toevoegingstest bepaalt bij welke stap van de infectie het kleine molecuul zijn antivirale activiteit vertoont. Moleculair docking voorspelt de interactie tussen het kleine molecuul en de virale eiwitten.Om de invloed van geneesmiddelen op gastheercellen voorafgaand aan virale infectie te evalueren, zaad RD cellen in 12-well platen op een twee keer 10 tot de vijfde cellen per goed plating dichtheid. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius in een 5%kooldioxide incubator 's nachts. De volgende ochtend, behandel elke put van de RD monolayer met een test verbinding van belang, in drievoud, bij niet-toxische concentraties in een milliliter basale medium gedurende een of vier uur.Aan het einde van de behandeling incubatie, was de cellen met een milliliter PBS alvorens 50 plaque-vormende eenheden van het virus in 300 microliters van basale medium per put gedurende een uur, met schommelen om de 15 minuten. Aan het einde van de infectie incubatie, was de cellen met PBS en overlay de cellen met een milliliter vers basaal medium met 0,8% methylcellulose. Na 72 uur in de celkweek incubator, was elk goed met twee milliliter PBS en bevestig de cellen met 0,5 milliliter van 37% formaldehyde per put gedurende 15 minuten.Aan het einde van de fixatie, was de putten met PBS en bevlek de cellen met 0,5 milliliter van 0,5% kristal violet oplossing per put. Na twee minuten, was de putten met een zachte stroom van water en laat de plaat te drogen. Plaats vervolgens de plaat op een witte lichtbak voor het tellen en bereken het percentage coxsackievirus geïnfecteerde cellen volgens de formule.Voor moleculaire docking analyse, download 3D moleculen van de testverbindingen van PubChem. Als een molecuul geen 3D-structuur heeft geüpload, download dan de 2D-structuur of gebruik de SMILE-snaarsequentie om de structuur via een geschikt moleculair programma om te zetten in een 3D-molecuul. Download vervolgens een virale biologische assemblage-eenheid van RCSB Protein Data Bank.Verwijder met behulp van een geschikt bio-computingprogramma de oplosmiddelen uit het Protein Data Bank-bestand, vervang de onvolledige zijketens met behulp van gegevens uit de Dunbrack 2010 rotamerbibliotheek en voeg waterstof en kosten toe aan de structuur zoals eerder gemeld. Om de testverbindingen aan te meren op de voorbereide viruseenheid, uploadt u het bestand van de testverbinding naar de Universiteit van Californië San Francisco Chimera als ligand en selecteert u het hele voorbereide virale eiwit als de receptor om blind docking uit te voeren. Voor extra docking, beperken de docking site op het virale eiwit tot regio's van belang afgeleid van de blinde docking resultaten door het verder verminderen van het zoekvolume.Upload vervolgens het dockingbestand in een geschikt moleculair grafisch systeem om de bindingsposities te analyseren. Selecteer de ligand om polaire contacten te vinden van de verbinding naar het virale eiwit, het identificeren van de polaire contacten met de aan eventuele atomen optie. Beide kleine moleculen getest in dit representatieve experiment, alleen geproduceerd een marginaal effect tegen het coxsackievirus A16 infectiviteit, of in de voorbehandeling van de gastheercellen voorafgaand aan virale infectie of in de post-infectie behandeling.In tegenstelling, de moleculen efficiënt ingetrokken de infectie met meer dan 80% in de co-toevoeging behandeling, wat suggereert dat de twee verbindingen zijn het meest effectief wanneer ze gelijktijdig aanwezig zijn met het virus deeltjes op het oppervlak van de gastheercel tijdens de infectie. Flow cytometrie gebaseerde bindende analyse bevestigt dat de twee tannines voorkomen coxsackievirus A16 infectiviteit binnenkomst door het voorkomen van virale deeltjes binding aan de gastheercellen. Moleculaire docking van de tannines geeft aan dat ze beide worden voorspeld te binden in de canyon regio van het coxsackievirus pentamer, net boven de zak ingang die de zak factor houdt en speelt een belangrijke rol voor het bemiddelen coxsackievirus binding en binnenkomst in de host cel.In deze oppervlakteprojecties kunnen de unieke resten die worden voorspeld uit de polaire contacten van de kleine moleculen rond de zakingang worden waargenomen, met asparagine-85, lysine-257 en asparagine-417 gemeen tussen de twee tannines. Voor moleculair docking moet rekening worden gehouden met de topologie van het virale eiwit bij het rangschikken van de bindingsframes. Aanvullende experimenten kunnen onder meer het testen van de antivirale activiteit van de verbinding op recombinant virussen, met mutaties op de aminozuren ontdekt om hun belang voor de werkzaamheid van het geneesmiddel te valideren.

use-viral-entry-assays-molecular-docking-analysis-for-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the viral inactivation assay, showcasing the evaluation of the impact of antiviral agents on viral particles.

Assessing the Effectiveness of an Antiviral Test Compound through a Viral Inactivation Assay

This video demonstrates a viral attachment assay for screening antiviral compounds. Using genetically modified hepatitis C virus and luciferase, it assesses inhibitory effects on viral attachment, as indicated by lower light intensity in co-treated wells compared to wells treated with the virus alone.

A Viral Attachment Assay for Screening of Antiviral Compounds

This video demonstrates an assay to evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry into host cells and fusion with the endosome. The cells are incubated at a low temperature and then infected with HCV. The low temperature permits viral binding to host cells but inhibits internalization via endocytosis. The test antiviral compound is added, and the cells are incubated at physiological temperature. This shift to a higher temperature facilitates viral entry and allows...

An Assay to Evaluate the Effect of Test Compounds on Viral Entry and Fusion in Host Cells

Drie assays, zoals de cytopathische effect (CPE) gebaseerde bepaling, dosis-respons assay en tijd-van-toevoeging (ToA) assay ontwikkeld, geoptimaliseerd, gevalideerd en toegepast op nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus (BTV) identificeren alsmede zoals het bepalen van de mogelijke mechanisme-van-actie (MoA) voor nieuw geïdentificeerde antivirale middelen.

Testsystemen voor de identificatie van nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus

In vitro assays om virusreplicatie te meten zijn sterk verbeterd door de ontwikkeling van recombinante RNA-virussen tot expressie luciferase of andere enzymen die in staat bioluminescentie. Hier hebben we detail een high-throughput screening pijplijn dat dergelijke recombinante stammen van mazelen en chikungunya virussen breed-spectrum antivirale middelen te isoleren van chemische bibliotheken combineert.

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

Hier presenteren we een protocol dat specifieke stappen van de virale binnenkomst onderzoekt om nieuwe antivirale middelen te identificeren en te evalueren.

Early Viral Entry testsystemen voor de identificatie en evaluatie van antivirale verbindingen

De eerste stap in de arenavirus levenscyclus is het hechten van virale deeltjes aan gasthercellen. We rapporteren een kwantitatief (q)RT-PCR-gebaseerde test voor ultragevoelige detectie en kwantificering van arenavirus-hechtingsgebeurtenissen.

Zeer gevoelige test voor het meten van arenavirus-cel Attachment

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

We presenteren een algemeen protocol voor het identificeren van korte stukken van homologe gastheer-pathogen eiwit sequenties (SSHHP'S) ingebed in de virale poly eiwit. SSHHP'S worden herkend door virale proteasen en richten de gerichte vernietiging van specifieke gastheer proteïnen op door verschillende groep IV virussen.

Analyse van virale SSHHP'S in groep IV met gebruikmaking van in vitro en silico-methoden

Het huidige protocol beschrijft nieuwe hulpmiddelen voor SPR-bindingstests om CV-N-binding aan HA, S-glycoproteïne, gerelateerde hybride-type glycanen en oligosacchariden met een hoog mannosegehalte te onderzoeken. SPR wordt gebruikt om de KD te bepalen voor het binden van dimerische of monomere CV-N aan deze glycanen.

Engineering antivirale middelen via Surface Plasmon Resonance

Dit artikel beschrijft de methodologie voor het genereren van SARS-CoV-2 pseudotype-deeltjes met behulp van een luciferase-reportersysteem en het gebruik ervan om intreeremmers te identificeren. Deze protocollen worden aangetoond met behulp van twee verschillende entry-inhibitors: een recombinant humaan ACE2-Fc fusie-eiwit en de kleinmolecuulverbinding arbidool.

Procedures voor de identificatie van SARS-CoV-2 ingangsremmers als potentiële antivirale middelen met MLV-gebaseerde pseudovirussen

Ontdek mechanismegedreven methoden voor het identificeren van antivirale kandidaten tegen Coxsackievirus A16. Dit protocol combineert virale vermeldingstesten en moleculaire docking om effectieve entry-remmers te vinden.

Gebruik van virale vermelding testen en moleculaire docking analyse voor de identificatie van antivirale kandidaten tegen Coxsackievirus A16 (Video) | JoVE Journal

Gebruik van virale vermelding testen en moleculaire docking analyse voor de identificatie van antivirale kandidaten tegen Coxsackievirus A16

Meer video's verkennen