Exon Overslaan in direct geherprogrammeerd Myotubes verkregen uit menselijke urine-afgeleide cellen

We hebben een nieuw protocol opgesteld voor de directe herprogrammering van menselijke urine-afgeleide cellen in myobuizen. Deze in vitro modellering stelt ons in staat om exon overslaan in de myotubes afgeleid van patiënt met Duchenne spierdystrofie te evalueren. We ontdekten dat 3-deazaneplanocin A hydrochloride, DZnep, histon methyltransferase remmer aanzienlijk kan bevorderen directe screening van UDC's in myotube in een korte tijd.

Deze nieuwe autologe UDC gebaseerde ziekte modellering kan leiden tot de toepassing precisie geneeskunde voor verschillende spierziekten. Om te beginnen, centrifugeren het gehele urinemonster op 400 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens, aspirate de supernatant verlaten van een milliliter in de buis.

Resuspend de pellets individueel in de resterende een milliliter urine. Verzamel die in een enkele 50 milliliter buis en voeg 10 milliliter wasbuffer aan de buis. Centrifugeren de monsters op 200 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Aspirate de supernatant verlaten 0,2 milliliter in de buis. Resuspend de cel pellets in 4,5 milliliter van primaire medium. Zaad de cellen in drie putten van gelatine-gecoate zes-put plaat, 1,5 milliliter cel suspensie per put.

Cultuur op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Gedurende drie dagen voeg 1,5 milliliter van het primaire medium per dag. Op dag vier, vervang het medium met 1,5 milliliter groeimedium aangevuld zoals beschreven in het manuscript.

Na dag vier, vervang het aangevulde groeimedium om de andere dag tot de UDC cultuur is 80 tot 90%confluent. Verwijder vervolgens het medium en was de cellen met PBS. Splits de cellen met 0,25% trypsin-EDTA.

Zaad de cellen op een dichtheid van 3.000 tot 5.000 cellen per vierkante centimeter op een nieuwe gelatine-gecoate 60 millimeter schotel. Zaad de UDC's op 3.000 tot 5.000 cellen per vierkante centimeter op een gelatinegecoate 60 millimeter schotel en plaats de schotel in de couveuse. 24 uur na het zaaien, infecteren de cellen met ontdooid retrovirus bij een veelheid van infectie van 200.

Gebruik vers medium met een hexadimethrine bromideconcentratie van 8 microgram per milliliter. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Om de MYOD1-getransduceerde cellen te selecteren, vervangt u het kweekmedium door vers groeimedium dat één microgram per milliliter puromycine bevat.

Blijf het medium om de andere dag gedurende zeven tot tien dagen wijzigen. Plaat de MYOD1-getransduceerde UDC's in een collageen gecoate multi-well plaat. Na het uitbroeden van de cellen gedurende 24 uur, verander het groeimedium naar differentiatiemedium beschreven in het manuscript.

Verander na drie dagen het differentiatiemedium in vers differentiatiemedium zonder DZNep. Blijf het medium om de drie dagen veranderen. Om de antisense oligonucleotide te transfecteren in de MYOD1-getransduceerde UDC's, meng ASO transfection reagens en differentiatiemedium tot een uiteindelijke concentratie van één tot 10 micromolar.

En gebruik dit mengsel om het medium in de putten te vervangen. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius en 5%vochtigheid. Na 72 uur incubatie met ASO, verander het medium naar vers differentiatie medium zonder ASO.

Drie tot zeven dagen na aso-transfectie, verwijder het differentiatiemedium. Was de UDC's één keer met PBS en voeg de cellysebuffer toe. Oogst het totale RNA met behulp van een RNA extractiekit.

Meet de RNA-concentratie met een spectrofotometer. Zoals beschreven in het manuscript, combineren de reagentia voor een stap RT-PCR in PCR buizen. Plaats de PCR-buizen in de thermocycler en voer de thermocycler uit.

Voer microchip elektroforese uit en bereken de exon overslaan efficiëntie. UDC's werden gemakkelijk en niet-invasief verzameld en vormden kolonies binnen een week na de primaire cultuur. MYOD1 transfected UDC's in differentiatiemedium met DZNep konden naar elkaar fuseren en multinucleated myotubes efficiënt vormen.

RT-PCR detecteerde duidelijk exon overslaan in MYOD1-UDC's afgeleid van patiënten met Duchenne spierdystrofie. Het overslaan van efficiëntie was afhankelijk van de dosis ASO. Dosis-afhankelijke exon overslaan werd ook gedetecteerd door westerse vlek.

Intensiteiten van dystrofie werden gemeten met fluorescerende microscoop een week na ASO-transfectie. Aanzienlijk hogere fluorescerende signalen werden waargenomen in MYOD1-UDC's behandeld met ASO dan in de controle. We kunnen elke spierziekte modelleren die leidt tot het begrijpen van pathofysiologie van die ziekten.