Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

Kinetic CRAC kan worden gebruikt om temporele associaties tussen RNA en RNA-bindende eiwitten te bestuderen op een ongekend korte tijdschaal. In combinatie met onze crosslinker kan kinetic CRAC live cellen binnen enkele seconden crosslinken. Dit vermindert UV-schadereacties en vergemakkelijkt de studie van stressreacties op minutenschaalresolutie.

Kinetic CRAC is een zeer lang protocol dat voor nieuwe gebruikers uitdagend kan zijn. Bovendien stelt het werken met RNA zijn eigen uitdagingen. Om RNA-degradatie te voorkomen, moet men alle oplossingen filtersteriliseren en ervoor zorgen dat de pipetten en laboratoriumbank schoon worden gehouden.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat sommige stappen niet erg intuïtief zijn. Dit omvat UV-crosslinking en het oogsten van cellen, evenals het extraheren van gecrosslinkte RNA's uit de gel. Om UV-crosslinking uit te voeren op micro-organismen in oplossing, inoculeert u 3,5 liter van het gewenste medium met gist tot een start OD 600 van 0,05 en laat u de cultuur overnacht groeien bij 30 graden Celsius met continu schudden bij 180 rpm.

Zodra de cellen de gewenste OD bereiken, giet u 500 milliliter van de cultuur direct in de Vari-X-linker crosslinker en bestraalt u deze met 250 millijoule van 254 nanometer UV.Na crosslinking, gebruikt u een vacuümfiltratieapparaat om de cellen te filteren. Rolt u de membraan met de gefilterde cellen op en plaatst u deze in een 50 milliliter kegelbuis gelabeld T0.Filter de resterende cellen over zes verschillende filters en laat de membranen in drie liter voorverwarmd stress-inducerend medium vallen, terwijl u ze gedurende 50 seconden krachtig met een pipet mengt. Ga door met het crosslinken van de cellen in volumes van 500 milliliter op de gewenste tijdstippen en bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius.

Om adherante cellen te crosslinken, brengt u de kwarts kweekschaal met de cellen over naar de gespecialiseerde lade en bestraalt u deze met 300 millijoule van 254 nanometer UV.Plaats de schaal onmiddellijk op ijs. Verwijder het groeimedium uit de schaal en voeg 10 milliliter ijskoud PBS toe. Verzamel de cellen door te schrapen en breng ze over in een 15 milliliter kegelbuis.

Pellet de cellen vervolgens door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 300 G bij vier graden Celsius. Na het wassen van de cellen met PBS, verwijdert u het PBS en vriest u de cellenpellet snel in op droogijs. Bewaar het monster indien nodig bij min 80 graden Celsius.

Stel de centrifuge in op vier graden Celsius en bereid twee rijen van 1,5 milliliter buisjes per monster voor voor elutie. Draai de kolommen met de nikkelparels snel rond om van het lege volume af te komen. Plaats vervolgens de kolommen in de eerste rij elutiebuizen en vul ze met 200 microliter elutiebuffer.

Na twee minuten, draait u snel de kolommen en brengt u ze over naar de tweede rij buizen. Herhaal vervolgens de elutie zoals eerder aangetoond. Wanneer u klaar bent, combineert u alle eluaten in een vijf milliliter buis en voegt u twee microliter van 20 milligram per milliliter glycogeen toe.

Voeg vervolgens 100 microliter trichloroazijnzuur toe aan het monster en klopt u het gedurende 30 seconden. Na het wassen van het monster met aceton, suspendeert u het in 30 microliter eiwitlaadbuffer. Controleer vervolgens de radioactiviteit met behulp van de Geigerteller.

Verwarm het monster gedurende 10 minuten bij 65 graden Celsius en laad het op een 1 millimeter vier tot 12% voorgebakken Bis-Tris gel. Laat de gel 90 minuten bij 125 volt in MOPS buffer lopen. Wanneer u klaar bent, wikkelt u de gel in kleeffolie en bevestigt u deze aan de binnenkant van een lichtdichte cassette met tape.

Nadat de gel is blootgesteld aan de auto radiografische film, ontwikkelt u de film door de kleeffolie rond de gel weg te snijden, zorg ervoor dat u de gel niet verplaatst en het beeld verschuift. Plaats de film over de gel en snijdt u de band van belang uit. Leg het gelsegment in een twee milliliter buis en breek het met een P1000 pipettip.

Voeg vervolgens proteinase K-buffer en proteinase K toe.Incubeer het monster bij 55 graden Celsius met krachtig schudden. Laat de cDNA een uur lang lopen op een voorgebakken 6% TBE gel bij 100 volt, met behulp van een geschikte ladder voor de kwantificering van korte DNA-fragmenten. Wanneer u klaar bent, plaatst u de gel in een vloeistofdichte container met voldoende TBE om deze te bedekken en voegt u een geschikte hoeveelheid SYBR Safe kleurstof toe.

Laat de gel 15 minuten bij kamertemperatuur inkleur. Vervang vervolgens de SYBR bevattende buffer door verse TBE. Was de gel gedurende 10 minuten met zacht schudden.

Laat de TBE weglopen en plaats de gel in een transparante map. Knip de map op een geschikte grootte en beeld de gel af met een image quant. Snijd de DNA-fragmenten tussen 175 en 400 basenparen uit en plaats het gelsegment in een 1,5 milliliter buis.

Sla de gel in met een P1000 pipettip en voeg 400 microliter water toe. Bewaar het monster gedurende een uur bij 37 graden Celsius terwijl u schudt. Vries het monster 10 minuten in op droogijs.

Herhaal vervolgens de incubatie bij 37 graden Celsius. Plaats twee glasmicrovezelfilters in een filterkolom die in een buis is geplaatst. Gebruik vervolgens een afgeknipte P1000 pipettip om de TBE gel suspensie over te brengen in de filtereenheid en draai deze 30 seconden bij 17.000 G.

Dit protocol werd gebruikt om Nrd1-RNA interacties in gistcellen te bewaken die werden onderworpen aan een glucose-uithongerde omgeving. Steken werden gecrosslinkt vóór de overgang naar medium zonder glucose, evenals één, twee, vier, acht, 14 en 20 minuten daarna. De autoradiografieën uit het experiment toonden een intense signaal op het verwachte moleculaire gewicht van Nrd1, wat het eiwit vertegenwoordigt dat gebonden is aan korte radiogelabelde RNA's die niet geschikt zijn voor sequencing.

Het signaal boven de