Intravitreale injectie en kwantificering van infectieparameters in een muismodel van bacteriële endoftalmitis

Ons protocol maakt de reproduceerbare introductie van micro-organismen en therapeutische middelen in het oog van de muis mogelijk om de pathogenese van intraoculaire infectie en nieuwe behandelingseffectiviteit te bestuderen. Onze techniek maakt het mogelijk intraoculaire infecties te vestigen in een muismodel en vergemakkelijkt de kwantificering van micro-organismen, gastheer immuunreacties, infectie gerelateerde gastheer en pathogene genexpressie, en nieuwe behandeling effectiviteit. Visualisatie van de injectieplaats, naaldhoek en levering zijn van cruciaal belang voor een succesvolle uitvoering van deze techniek en een goede oogoogst is essentieel voor kwantificering van de infectieparameters.

Voeg in een bioveiligheidsniveau twee faciliteit vijf milliliter BHI-bouillon toe aan een snap cap-buis van 10 milliliter en gebruik een steriele lus om een enkele B.cereus-kolonie van een vijzelplaatkweek over te brengen in vijf milliliter bouillon. Na korte vortexen, incubeer het monster in een 37 graden Celsius roterende incubator op 200 omwentelingen per minuut gedurende 18 uur. Verdun de cultuur aan het einde van de incubatie tot een 200 kolonievormende eenheden per microliterconcentratie in 10 milliliter verse BHI, en voeg na het vortexen een milliliter van de vers verdunde cultuur toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter op ijs.

Voor intravitreale injectie schakelt u de microinjector in en open u de gasklep op de persluchttank die aan de microinjector is bevestigd. Druk op de modus op de microinjector totdat het scherm Balance weergeeft. Druk op Balans en plaats de computermuis op de operatietafel.

Sluit de roestvrijstalen pipethouder aan op de slang die op de vuloutput op de injector is bevestigd en schroef de pipethouderconnector stevig rond een afgeschuinde glazen capillaire pipetpuntaald om het inbrengen van de capillaire naald in het andere uiteinde van de pipethouder mogelijk te maken. Zet de oogheelkundige microscoop aan en stel de lichtintensiteit in op 50%Plaats de microscoop over de procedureplaats en pas de microscoop aan de gewenste focus aan. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex, plaats de verdoofde muis aan de linkerkant op de medische onderpads met de neus naar rechts gericht.

Zoek het rechteroog door de oogheelkundige microscoop doelstelling en plaats de tang van omgekeerde actie tangen aan weerszijden van het oog om de injectieplaats bloot te leggen. Klik links op de muis aangesloten op de microinjector om de voorbereide capillaire naald te vullen met de verdunde bacterieoplossing, en het hoofd met de linkerhand vast te zetten, plaats het puntje van de naald, schuine kant omhoog, bij de limbus van het oog. Met de naald in een hoek van 45 graden, punctie het oog, zorg ervoor dat slechts 0,5 millimeter van de scherpe punt van de naald wordt ingevoegd.

Zodra de naaldpunt is ingebracht, gebruikt u de linkerhand om met de rechtermuisknop op de muismat te klikken om 0,5 microliter van de B.cereus-oplossing te injecteren. Om lekkage te voorkomen, laat de naaldpunt twee tot drie seconden in het oog van de muis voor het verwijderen, laat dan de tangen los en het oog gaat vanzelf terug in de socket. Breng de muis naar een herstelkooi op een warmhoudblok met monitoring tot volledige recumbency.

Voeg op het juiste experimentele eindpunt 400 microliter PBS toe, aangevuld met proteaseremmer in één gelabelde, automatisch geschatte oogstbuis per oog op ijs en plaats open fijne puntkrachten aan weerszijden van het geïnfecteerde oog. Duw de tips naar beneden naar het hoofd om het oog te proptose. Zodra de tang zijn achter de oogbol, knijp de tang samen en trek de tang uit de buurt van het hoofd om de oogbol los te maken.

Plaats vervolgens onmiddellijk de oogbol in de juiste gelabelde oogstbuis. Binnen 60 minuten na de monsterverzameling, plaats de gesloten oogstbuizen in een weefselhomogenisator en homogeniseer de monsters gedurende twee, één minuut homogenisatieperiodes met een rustperiode van 30 seconden ertussen. Na homogenisatie, plaats de monsters op ijs en gebruik 20 microliter aliquots homogenaat om de monsters in 180 microliter pbs per verdunning serieel te verdunnen, totdat een factor van één keer 10 tot de negatieve acht is bereikt.

Vervolgens labelt u elke rij van een vierkante voorverwarmde BHI-plaat met de juiste verdunningsconcentratie en voeg met de plaat gekanteld in een hoek van 45 graden 10 microliters van elke verdunning toe aan afzonderlijke rijen aan de bovenkant van de plaat. Laat elk monster lopen totdat het bijna de onderkant van de plaat bereikt voordat u de plaat plat legt. Wanneer de monsters zijn geabsorbeerd in de agar, breng de plaat naar een 37 graden Celsius incubator.

Kolonies moeten zichtbaar beginnen te zijn na acht uur incubatie. Voor een nauwkeurige weergave van de concentratie in het monster, tel de rij die tussen de 10 tot 100 kolonies heeft. De constructie van een schuine glazen naald tip is van cruciaal belang voor het leveren van de bacteriën in het midden glasvocht van de muis oog.

In deze beelden, Bacillus cereus groeien op een bloed agar plaat en in bouillon cultuur buizen worden getoond. Zoals geïllustreerd in deze grafiek van interoculaire bacteriële tellingen van vijf verschillende muisogen op 10 uur na infectie tussen een keer 10 tot de vijfde en een keer 10 tot de zevende kolonie vormen eenheden van bacteriën kan meestal worden hersteld uit een enkel geïnfecteerd oog. Het belangrijkste om te onthouden bij een poging deze procedure is het injecteren van dat juiste volume van bacteriën in het oog van de muis.

Na deze procedure kunnen we ontstekingen bestuderen door histologie, ontstekingsbemiddelaars door ELISA en genexpressie door RNA-sequencing met een hoge doorvoer om een beter begrip van de pathogenese van deze ziekte te vergemakkelijken.