Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten In Vivo Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test
October 18th, 2016
Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.
Het algemene doel van deze procedure is om de fagocytische functie van retinale microglia in vivo te beoordelen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het oogheelkundegebied te beantwoorden, zoals of bepaalde verbindingen de fagocytische functie van microglia in een fysiologische omgeving veranderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het flowcytometrie gebruikt, waardoor een snelle en nauwkeurige kwantitatieve analyse van microgliale fagocytose mogelijk is.
Susumu Sakimoto, een postdoc uit mijn laboratorium, zal me helpen om de procedure te demonstreren. Begin door een 33-gauge naald en spuit te laden met 0,5 microliter van een fluorescerend gelabelde deeltjesoplossing. Plaats vervolgens een verdoofde muis zijwaarts op zacht materiaal onder een chirurgische microscoop en bevestig het juiste niveau van sedatie door een gebrek aan reactie op teenprik.
Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig druk uit te oefenen rond één ooglid, zodat het oogbolletje licht uit de holte komt. Grijp vervolgens het hoofd met twee vingers net boven het oor en bij de kaak van het dier en rekt voorzichtig de huid parallel aan de oogleden uit om het oog licht uit de holte te laten uitpuilen. Intravitreale injecties zijn uitdagend en als ze niet correct worden uitgevoerd, leiden ze tot bevooroordeelde en variabele resultaten.
Om trauma aan het oog te verminderen, houd het dier in een stabiele positie met minimale hoofdbeweging. Om het oogbolletje te puncteren, grijpt u voorzichtig de muis met één hand. Lokaliseer vervolgens de cornale limbus waar het hoornvlies en de sclera verbonden zijn, wat zichtbaar is als een grijze cirkel bij gepigmenteerde muizen.
Houd de spuit in de andere hand en steek de naald in de limbus. Trek de naald vervolgens licht terug om een kleine hoeveelheid glasvocht te verdrijven en druk langzaam op de zuiger om de deeltjes te injecteren. Wanneer alle kralen zijn afgegeven, trekt u de spuit langzaam terug om reflux van het geïnjecteerde materiaal te voorkomen en brengt u bevochtigende druppels aan om het oog gehydrateerd te houden zodra het oog zich weer op zijn plaats heeft teruggetrokken.
Plaats het dier vervolgens op een verwarmingskussen in zijn eigen kooi met monitoring totdat het volledig is hersteld. Drie uur na intravitreale injectie gebruikt u 45 graden hoekige pincetten om zachtjes tegen het ooglid te drukken om het oogbolletje te protroseren. Plaats de pincetten achter het oogbolletje en trek er aan.
Breng vervolgens het oogbolletje over naar het droge gebied van een petrischaal, dat een kleine hoeveelheid PBS met calcium en magnesium bevat onder een dissectiescoop. En gebruik een punt van een superfijne pincet om het oog in de cornale limbus te doorboren. Houd vervolgens het oogbolletje vast met fijne 45-graads hoekige pincetten en gebruik springende scharen om rond de cornale limbus te snijden tot ongeveer de helft van de omtrek is doorgesneden.
Breng het oogbolletje over in PBS en gebruik een tweede paar fijne 45-graads hoekige pincetten om het hoornvlies en de sclera uit elkaar te scheuren. Het lens en de retina zullen intact naar buiten komen. Zorg ervoor dat de lens en de retina gescheiden zijn en breng de retina over naar een 5,4 milliliter polystyreen testbuisje, dat twee milliliter PBS met calcium en magnesium bevat.
Om een enkele cel suspensie van de retinale cellen te verkrijgen, gebruikt u een neuronaal weefsel dissociatie kit volgens de instructies van de fabrikant en resuspendeert u de cellen in 200 microliters kleuring buffer. Breng vervolgens het monster over naar één putje van een 96-well U-bodem plaat. Na centrifugatie, keert u de plaat om om het supernatant weg te gooien en blokkeert u de FC receptoren met 25 microliters kleuring buffer bevattend CD16, CD32 antilichaam per putje gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.
Label vervolgens de cellen met de antilichamen van belang gedurende 15 minuten op kamertemperatuur in het donker. Pellet vervolgens de cellen en volg dit op met een wassing in 200 microliters verse kleuring buffer per putje. Resuspendeer nu de pellets in 200 microliters kleuring buffer en levensvatbaarheidskleurstof en breng de monsters over naar 1,2 milliliter microtiterbuisjes.
Was vervolgens de putjes met een extra 100 microliters kleuring buffer en levensvatbaarheidskleurstof en verzamel de wassingen met de overeenkomstige monsters voor analyse door flowcytometrie. Deze methode kan worden gebruikt bij 10 tot 20 dagen oude postnatale of volwassen muizen en kan worden aangepast om het effect van verbindingen en/of de genetische manipulatie van microgliale fagocytose te testen. In dit experiment werd bijvoorbeeld na intraperitoneaal uitdagen met verschillende doses LPS, een dosis van 1,42 milligram per kilogram LPS vastgesteld om een statistisch significante toename in het percentage fagocytische microglia te induceren, vergeleken met voertuig uitgedaagde controles.
Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in zes uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals celsortering gevolgd door qPCR of proteomische analyse worden gebruikt om verdere vragen te beantwoorden over de verschillen tussen fagocytische en niet-fagocytische microglia in het netvlies. Bij het ontwikkelen van deze techniek verwachten we dat we het nu mogelijk maken voor visionaire en neurowetenschappers om microgliale fagocytische functie verder te onderzoeken in situ en in een fysiologisch relevante context.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe techniek voor het beoordelen van de fagocytische functie van retinale microglia in vivo. Door middel van flowcytometrie kunnen onderzoekers een snelle en nauwkeurige kwantitatieve analyse van microgliale fagocytose bereiken, wat essentieel is voor het begrijpen van weefselhomeostase en pathologie.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oogheelkunde
- Celbiologie
Achtergrond
- Microgliale fagocytose is vitaal voor het handhaven van weefselhomeostase.
- Onvoldoende fagocytische functie is gekoppeld aan verschillende pathologieën.
- Het beoordelen van microgliale functie in vivo brengt technische uitdagingen met zich mee.
- Flowcytometrie biedt een robuuste methode voor analyse.
Doel van het onderzoek
- Om de fagocytische functie van retinale microglia in een fysiologische omgeving te evalueren.
- Om de impact van specifieke verbindingen op microgliale fagocytose te bepalen.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor toekomstig onderzoek in de oogheelkunde.
Gebruikte methoden
- Een 33-gauge naald vullen met een oplossing van fluorescentie-gelabelde deeltjes.
- Gebruik maken van een chirurgisch microscoop voor nauwkeurige observatie.
- Bewaken van de verdoofde muis om een goede sedatie te garanderen.
- Gebruik van flowcytometrie voor kwantitatieve analyse.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt nauwkeurige meting van microgliale fagocytose mogelijk.
- Flowcytometrie biedt snelle resultaten in vergelijking met traditionele methoden.
- Mogelijke effecten van verbindingen op de fagocytische functie kunnen worden beoordeeld.
- Deze methode verbetert het begrip van de rollen van microglia in gezondheid en ziekte.
Conclusies
- De ontwikkelde techniek is een belangrijke vooruitgang voor het bestuderen van microgliale functie.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek naar neuro-inflammatie en retinale gezondheid.
- Toekomstig onderzoek kan deze methode gebruiken om therapeutische interventies te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of retinal microglial phagocytic function using flow cytometry addresses a critical gap in CNS target validation and mechanistic de-risking for neuroinflammatory and neurodegenerative disease pipelines. This approach enables precise, reproducible measurement of microglial activity in physiologically relevant settings, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. The method's adaptability and speed facilitate robust compound evaluation and portfolio triage for CNS and ophthalmology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial phagocytic function in vivo for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying functional responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates predictive confidence in CNS and retinal disease models by providing quantitative readouts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, physiologically relevant microglial systems for downstream compound screening.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative phagocytosis measurements via flow cytometry.
- Enables rapid assessment of compound effects on microglial function, supporting scalable screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker development in neurodegeneration and retinal disorders.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling in vivo functional assays.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative microglial activity data.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, compound screening, and translational research in CNS and ophthalmology pipelines.
- Discovery Biology: Quantifies microglial phagocytosis to clarify pathway function and de-risk biological hypotheses.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated in vivo systems.
- Analytics: Generates statistically robust measurements for comparing experimental conditions and compound effects.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling functional biomarker alignment in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to various CNS and retinal research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microglial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, rapid, and scalable phagocytosis assays for cross-team use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of CNS and ophthalmology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent ocular procedures and flow cytometry analysis.
- Needs access to surgical microscopes, flow cytometers, and validated antibody panels.
- Demands cross-team standardization of injection and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to different rodent ages and potentially other CNS tissues with protocol optimization.
- Dependent on precise intravitreal injection technique to minimize variability and bias.
