Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten

Het algemene doel van deze procedure is om de fagocytische functie van retinale microglia in vivo te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de oogheelkunde, zoals de vraag of bepaalde verbindingen de fagocytische functie van microglia in een fysiologische setting beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van flowcytometrie, waardoor een snelle en nauwkeurige kwantitatieve analyse van microgliële fagocytose mogelijk is.

Susumu Sakimoto, een postdoc uit mijn laboratorium, zal me helpen bij het demonstreren van de procedure. Begin met het laden van een 33-gauge naald en spuit met 0,5 µL fluorescerend gelabelde partikeloplossing. Plaats vervolgens een geanestheseerde muis zijwaarts op zacht materiaal onder een chirurgische microscoop en bevestig de juiste mate van sedatie door het ontbreken van een reactie op een knijpreflex in de teen.

Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig druk uit te oefenen rondom één ooglid, zodat de oogbol iets uit de oogkas komt. Pak vervolgens de kop vast met twee vingers net boven het oor en bij de kaak van het dier, en rek de huid voorzichtig parallel aan de oogleden om het oog licht uit de oogkas te laten steken. Intravitreale injecties zijn uitdagend en zullen, indien niet correct uitgevoerd, leiden tot bevooroordeelde en variabele resultaten.

Om trauma aan het oog te verminderen, houdt u het dier in een stabiele positie met minimale hoofdbeweging. Om de oogbol te ponceren, grijpt u de muis voorzichtig met één hand vast. Lokaliseer vervolgens de corneaal limbus waar het hoornvlies en de sclera samenkomen, wat bij gepigmenteerde muizen zichtbaar is als een grijze cirkel.

Houd de spuit in de andere hand en voer de naald in de limbus in. Trek de naald vervolgens iets terug om een klein volume vitreusvocht te laten ontsnappen en druk langzaam de zuiger in om de deeltjes te injecteren. Wanneer alle beads zijn toegediend, trek de spuit langzaam terug om reflux van het geïnjecteerde materiaal te voorkomen en breng bevochtigende druppels aan om het oog gehydrateerd te houden zodra het oog weer op zijn plaats is teruggevallen.

Plaats het dier vervolgens op een warmtemat in een eigen kooi en houd het onder toezicht tot het volledig is hersteld. Drie uur na de intravitreale injectie worden een pincet onder een hoek van 45 graden gebruikt om voorzichtig tegen het ooglid te drukken om de oogbol naar voren te laten treden. Positioneer het pincet achter de oogbol en trek deze naar buiten.

Verplaats vervolgens de oogbol onder een dissectiemicroscoop naar het droge gedeelte van een petrischaal die een klein volume PBS met calcium en magnesium bevat. Gebruik één punt van een superfijne pincet om het oog bij de hoornvlieslimbus te doorboren. Houd vervolgens de oogbol vast met een fijne pincet met een hoek van 45 graden en gebruik veerscharen om rond de hoornvlieslimbus te knippen totdat ongeveer de helft van de omtrek is doorgesneden.

Breng de oogbol over naar PBS en gebruik een tweede paar fijne forceps onder een hoek van 45 graden om het hoornvlies en het sclera van elkaar te scheuren. De lens en het netvlies zullen intact naar buiten komen. Zorg ervoor dat de lens en het netvlies gescheiden zijn en breng het netvlies over naar een polystyreen testbuis van 5,4 milliliter, die twee milliliter PBS met calcium en magnesium bevat.

Om een enkelcel-suspensie van de retinale cellen te verkrijgen, gebruikt u een kit voor de dissociatie van neuraal weefsel volgens de instructies van de fabrikant en resuspendeert u de cellen in 200 microliters kleuringsbuffer. Breng het monster vervolgens over naar één putje van een 96-wells U-bodemplaat. Keer de plaat na centrifugatie om om het supernatant weg te gooien en blokkeer de FC-receptoren gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met 25 microliters kleuringsbuffer die CD16- en CD32-antilichamen bevat per putje.

Label vervolgens de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker met de gewenste antilichamen. Pelleteer daarna de cellen en volg dit met een wasbeurt in 200 µL verse kleuringsbuffer per putje. Resuspendeer de pellets nu in 200 µL kleuringsbuffer en levensvatbaarheidskleurstof en breng de monsters over in microtiterbuisjes van 1,2 ml.

Was vervolgens de wells met nog eens 100 µL kleuringsbuffer en levensvatbaarheidskleurstof en voeg de wasstappen samen met de overeenkomstige monsters voor analyse via flowcytometrie. Deze methode kan worden gebruikt bij postnatale muizen van 10 tot 20 dagen oud of bij volwassen muizen en kan worden aangepast om het effect van verbindingen en/of genetische manipulatie van de fagocytose door microgliacellen te testen. In dit experiment werd bijvoorbeeld, na intraperitonele uitdaging met variërende doses LPS, vastgesteld dat een dosis van 1,42 mg/kg LPS een statistisch significante toename induceerde in het percentage fagocyterende microglia, vergeleken met controles die met het vehikel waren uitgedaagd.

Eenmaal beheerst, kan deze techniek in zes uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals cel sortering gevolgd door qPCR of proteomische analyse, worden gebruikt om verdere vragen te beantwoorden over de verschillen tussen fagocytische en niet-fagocytische microglia in het netvlies. Bij de ontwikkeling van deze techniek is het onze verwachting dat we het nu mogelijk kunnen maken voor visueel en neurowetenschappers om de fagocytische functie van microglia verder te onderzoeken in situ en in een fysiologisch relevante context.