Name: Een protocol voor immunohistochemie en RNA-in-situ distributie binnen vroege drosophila-embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: Leer immunohistochemie en RNA-in-situ-hybridisatie voor ontwikkelingsbiologie met Drosophila melanogaster-embryo's. Dit protocol verbetert hechting aan objectglaasjes voor betere visualisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (#31771377 / 31571273/31371256), het Foreign Distinguished Scientist Program van het National Department of Education (#MS2014SXSF038), het National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) en XZ wordt ondersteund door Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), het Natural Science Basic Research Program Youth Project van Shaanxi Provincial Science and Technology Department (#2020JQ-885).

1. Bereiding van druivensap agar borden
<ol><li>Voeg 5 g agar en 5 g sucrose toe aan 150 ml gedestilleerd water. Kook het in de magnetron tot de agar en sucrose volledig zijn opgelost. Meng 50 ml 100% druivensap en de oplossing door elkaar.</li>
	<li>Voeg 1 ml 100% propionzuur toe om de uiteindelijke concentratie tot 0,5% propionzuur te maken. Giet 25 ml van de bereide oplossing in elke plaat. Nadat de agar is gestold, bewaart u de media in 4 °C.</li>
</ol>2. Coating dia's
<ol><li>Voorbehandeling glijdt met reinigingsmiddel. Was de glaasjes 3 keer met kraanwater en één keer met gedestilleerd water. Droog vervolgens de glaasjes 2 uur in een oven van 45 °C.</li>
	<li>Dompel de dia's gedurende 24 uur onder in ongeveer 450 ml kaliumdichromaat zwavelzuuroplossing (20 g kaliumdichromaat, 40 ml gedestilleerd water en 400 ml geconcentreerd zwavelzuur). Was de glaasjes 3 keer met kraanwater en één keer met gedestilleerd water.<ol>
<li>Droog de glaasjes twee uur in een oven van 45 °C. Dompel meer dan 2 uur onder in 95% ethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 0,5 g chroomkaliumsulfaat en 5 g gelatine toe aan 1 l gedestilleerd water. Los voor gebruik op in een waterbad van 60 °C. De chroomalumgelatine kan langdurig bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Laat 10 μL van de chroomalumgelatine op de dia vallen en bedek het volledige oppervlak van de dia volledig en gelijkmatig met de oplossing. Plaats de dia met de gelatinezijde naar boven in een oven bij 42 °C gedurende 48 uur. De voorbereide platen kunnen bij 4 °C worden bewaard voor later gebruik. OPMERKING: Dit is een cruciale stap. De volledige coating is noodzakelijk. Voor fruitvlieg en zijn embryo lijkt deze diacoatingbenadering efficiënter dan poly-lysinecoating.</li>
</ol>3. Inbedding van drosophila-embryo's
<ol><li>
Drosophila embryo collectie OPMERKING: We verzamelden Drosophila-embryo's in vier perioden van 0-2 uur (syncytieel blastoderm), 2-3 uur (cellulair blastoderm), 3-12 uur (vroege gastrula) en 12-24 uur (late gastrula)18. Het aandeel van de belangrijkste embryotypen in elke periode is weergegeven in tabel 1.<ol>
<li>Doe 400-500 vliegen in een plastic opvangfles en dek de fles af met de druivensap agarplaat met gistextract. Drosophila-embryo's worden bij kamertemperatuur op de druivensap-agar gelegd.</li>
		<li>Verzamel vier perioden embryo's en voeg voorzichtig 2 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) toe aan elke plaat om de embryo's te laten drijven. Breng ongeveer 200 embryo's over in een centrifugebuis van 50 ml en houd deze gedurende 2 minuten op ijs om de embryo's te laten bezinken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vooraf insluiten<ol>
<li>Breng 200 Drosophila-embryo's over in een centrifugebuis van 1,5 ml. Houd de buis 2 minuten op ijs om de embryo's te laten bezinken en gooi het supernatant voorzichtig met pipet weg. Voeg 1 ml 50% bleekmiddel toe in de tube en schud het voorzichtig gedurende 2 minuten. OPMERKING: Het bleekmiddel moet vers worden bereid en de hoeveelheid bleekmiddel kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid embryo's die worden verzameld.</li>
		<li>Verzamel embryo's voorzichtig door ze op filterpapier te gieten en was ze 3 keer met 1 ml PBS per keer.</li>
		<li>Breng de embryo's met filterpapier terug tot ongeveer 5 ml n-heptaan.</li>
		<li>Breng het mengsel over in een verse centrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 1 ml methanol toe en schud het voorzichtig. Verzamel embryo's na sedimentatie.</li>
		<li>Verwijder supernatant en was de embryo's 3-5 keer in 1 ml PBS.</li>
		<li>Fixeer de embryo's met 400 μL Bouin's oplossing (71% verzadigd picrinezuur, 24% formaline, 5% azijnzuur) gedurende 30 min. Was de vaste embryo's 3 keer in 1 ml PBS gedurende 5 minuten elke keer.</li>
		<li>Om embryo's te aggregeren, brengt u de monsters over in een rubberen stop en verwijdert u de PBS.</li>
		<li>Bereid 1,2% agarose-PBS-oplossing en bewaar de oplossing bij 60 °C. Voeg 200 μL 1,2% agarose-PBS-oplossing toe aan embryo's om ze in een agarblok te fixeren.</li>
		<li>Haal het blok uit de stop en bewaar het blok in PBS. OPMERKING: Tijdens de pre-embedding-benadering is pro-warming van cruciaal belang voor succes. We raden ten zeerste aan dat de centrifugebuizen en micropipette-tips, die in deze stap worden gebruikt, volledig voorverwarmd zijn voordat ze worden gebruikt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paraffine inbedding<ol>
<li>Dompel het vooraf ingebedde agarblok gedurende 15 minuten onder in 35% ethanol, 50% ethanol, 75% ethanol en 85% ethanol. Dompel vervolgens 2 keer in 95% ethanol en 100% ethanol. OPMERKINGEN: Ongeveer 5-10x blokvolume van elk gevolgd door een gegradeerd fixatief gedurende 15-30 minuten is nodig, afhankelijk van het aantal embryo's in het blok.</li>
		<li>Dompel het embryoblok gedurende 15 minuten onder in 100% ethanol en xyleen (1:1 verhouding) oplossing.</li>
		<li>Breng het blok gedurende 1 minuut over op xyleen om het embryoweefsel transparant te maken.</li>
		<li>Dompel het blok onder in xyleen en paraffine (1:1 verhouding) gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Dompel het blok onder in paraffine I, paraffine II en paraffine III gedurende 2 uur elke keer.</li>
		<li>Vul het insluitvak vooraf met paraffine en breng het blok vervolgens voorzichtig en horizontaal over naar de onderkant van het insluitvak. Nadat de paraffine op natuurlijke wijze stolt, kan het gestolde paraffineblok bij 4 °C worden bewaard. OPMERKINGEN: Het vooraf ingesloten monster kan worden gebruikt in cryosectie door de volgende stappen te volgen. Nadat de embryo's vooraf zijn ingebed met agarose zoals hierboven beschreven, worden de monsters eenvoudigweg ingebed in OCT Compound. Daarna kan cryosectie worden uitgevoerd volgens het routinematige cryosectieprotocol. Vervolgens kunnen regelmatige kleuringsbenaderingen op de secties worden gebruikt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Hematoxyline-eosine kleuring
<ol><li>Bereid Drosophila embryo secties voor. Plaats bereide secties gedurende 15 minuten in een oven bij 60 °C en dompel de secties vervolgens 2 keer gedurende 10 minuten onder in xyleen. Dompel de secties eenmaal in 100% ethanol en xyleen (1:1 verhouding) gedurende 2 minuten onder.</li>
	<li>Hydrateer de secties in 100% ethanol I, 100% ethanol II, 95% ethanol, 85% ethanol, 75% ethanol, 50% ethanol en in gedestilleerd water gedurende 3 minuten.</li>
	<li>Kleur de secties met hematoxyline-oplossing gedurende 2 minuten. Dompel de glaasjes snel in 1% zure alcoholoplossing (1 ml zoutzuur, 100 ml 70% ethanol) en was de glaasjes in gedestilleerd water.</li>
	<li>Doop de glaasjes achtereenvolgens in 50% ethanol, 75% ethanol, 85% ethanol en 95% ethanol.</li>
	<li>Kleur de secties met eosine-oplossing gedurende 1 min.</li>
	<li>Droog de glaasjes uit in 95% ethanol I, 95% ethanol II, 95% ethanol III, 100% ethanol I, 100% ethanol II en 100% ethanol III gedurende telkens 1 minuut.</li>
	<li>Verwijder de dia's in 100% xyleen I, 100% xyleen II en 100% xyleen III gedurende 5 minuten elke keer.</li>
	<li>Monteer de glijbanen met neutrale balsem volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>5. Periodieke zuur-zilver methenamine kleuring
<ol><li>Deparaffiniseren en hydrateren van paraffinesecties van Drosophila embryo tot gedestilleerd water.</li>
	<li>Oxideer de secties in 1% periodiek zuur gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Spoel de glaasjes 3 keer in gedestilleerd water gedurende 1 min.</li>
	<li>Incubeer de glaasjes in ongeveer 40 ml vers gefilterde zilvermethenamine werkoplossing (3% methenamine, 5% zilvernitraat, 5% natriumboraatoplossing) gedurende 1 uur en 20 minuten bij 60 °C. Spoel de glaasjes vervolgens gedurende 1 min af in gedestilleerd water.</li>
	<li>Toon de glaasjes gedurende 2 minuten in 0,2% goudchloride en spoel de glaasjes vervolgens gedurende 1 min af in gedestilleerd water.</li>
	<li>Plaats de glaasjes gedurende 3 min in 3% natriumthiosulfaat en spoel de glaasjes vervolgens gedurende 1 min af in gedestilleerd water.</li>
	<li>Counterstain de dia's in hematoxyline voor 30 s. Was de glijbanen gedurende 3-5 minuten in stromend kraanwater.</li>
	<li>Droog de glaasjes uit in 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol I, 95% ethanol II, 95% ethanol III, 100% ethanol I en 100% ethanol II gedurende elk 5 minuten.</li>
	<li>Verwijder de dia's in 100% xyleen I, 100% xyleen II en 100% xyleen III gedurende elk 5 minuten.</li>
	<li>Monteer de glaasjes in neutrale balsem volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>6. Immunohistochemie
<ol><li>Paraffinesecties van Drosophila-embryo deparaffiniseren en rehydrateren tot PBS volgens het standaardprotocol19.</li>
	<li>Behandel dia's met 0,3% H2O2 in methanol gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en vermijd licht.</li>
	<li>Verwarm de juiste antigeenophaalbuffer tot ongeveer 100 °C in een container met de glaasjes in de groentestomer. De container moet ook een deksel hebben. Doe de dia's in de container. Sluit het deksel van de stomer.<ol>
<li>Houd de container vanaf dit punt 20 minuten in de stomer. Merk op dat het deksel van de schuifcontainer niet volledig moet worden aangedraaid, zodat waterdamp tijdens het stomen kan binnendringen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laat de dia's terugkeren naar kamertemperatuur voordat u deze voorzichtig spoelt in PBS-T (PBS met Tween-20, pH 7,2) 3 keer gedurende 5 minuten elk, en spoel de dia's vervolgens 3 keer in PBS gedurende 1 minuut elk.</li>
	<li>Blokkeer de dia's met 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubeer de dia's met primair antilichaam (anti-FKBP12 om 1:1000) 's nachts bij 4 °C of bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.</li>
	<li>Was de dia's in PBS-T 4 keer gedurende 5 minuten elk.</li>
	<li>Breng de dia's met HRP-gelabeld polymeer geconjugeerd met secundaire antilichamen (anti-Konijn, 1:5.000) gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur aan. Doe dit in het donker om te voorkomen dat foto's bleken.</li>
	<li>Was de dia's in PBS-T 3 keer gedurende 5 minuten elk.</li>
	<li>Incubeer de dia's met 5% 3,3'-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) gedurende 2-10 minuten totdat de kleur van reactieproducten geschikt is onder microscoop.</li>
	<li>Houd de glaasjes 30 s in hematoxyline en was de glaasjes 2 keer gedurende 5 minuten in gedestilleerd water.</li>
	<li>Droog de glaasjes uit in 50% ethanol, 70% ethanol, 90% ethanol, 95% ethanol en 100% ethanol gedurende elk 1 minuut.</li>
	<li>Verwijder de dia's in 100% xyleen I, 100% xyleen II en 100% xyleen III gedurende elk 5 minuten.</li>
	<li>Monteer de glaasjes in neutrale balsem volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>7. In-situ hybridisatie
OPMERKING: Drosophila embryo secties werden bereid met 0,01% diethyl pyrocarbonaat (DEPC) behandeld water. Alle accessoires die worden gebruikt voor in situ hybridisatie passen DEPC 's nachts behandeling vooraf toe.
<ol><li>Riboprobe voorbereiding<ol>
<li>Lineariseer sjabloon-DNA door te knippen op een restrictie-enzymplaats stroomafwaarts van de gekloonde insert met behulp van een restrictie-enzym dat 5 'overhangen creëert. Na linearisatie zuivert u het sjabloon-DNA via fenol / chloroform-extractie en daaropvolgende ethanolprecipitatie. Gebruik standaardprotocollen.</li>
		<li>Voeg 1 μg gezuiverd sjabloon-DNA toe aan een RNase-vrije centrifugebuis. Plaats de centrifugebuis op ijs. Voeg voldoende DEPC-behandeld water toe aan het totale volume 13 μL.<ol>
<li>Voeg vervolgens de volgende reagentia toe in volgorde: 2 μL 10x NTP-etiketteringsmengsel, 2 μL 10x transcriptiebuffer, 1 μL protector RNase-remmer, 2 μL RNA Polymerase SP6 of RNA Polymerase T7.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Meng de reactie door te pipetteren en centrifugeer kort. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C. OPMERKING: Langere incubaties verhogen de opbrengst van gelabeld RNA niet. Een korte spin (~ 800 rpm) toegepast op de reactiebuis is van cruciaal belang voordat u doorgaat naar de volgende stap. Met deze spin kan alle inhoud, die uit de incubatie kan ontstaan, naar de bodem van de buis komen.</li>
		<li>Voeg 2 μL RNase-vrije DNase I toe om sjabloon-DNA te verwijderen en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.</li>
		<li>Voeg 2 μL van 200 mM EDTA (pH 8,0) toe om de reactie te stoppen. OPMERKING: DIG-gelabelde RNA-sondes kunnen gedurende één jaar bij -15 tot -25 °C in ethanol worden bewaard.</li>
	</ol></li>
	<li>Pre-hybridisatie van drosophila embryo sectie<ol>
<li>Plaats delen van het Drosophila-embryo gedurende 48 uur in een oven van 42 °C.</li>
		<li>Deparaffiniseer de glaasjes tweemaal in 100% xyleen gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Hydrateer de glaasjes door ze gedurende 5 minuten achtereenvolgens onder te dompelen in 100% ethanol, 95% ethanol, 90% ethanol, 70% ethanol en 50% ethanol.</li>
		<li>Incubeer de dia's in PBS gedurende 5 min 3 keer om de fixatieve oplossing / Bouin's oplossing uit het weefsel te verwijderen.</li>
		<li>Was de glaasjes met 100 mmol/L glycine/PBS-oplossing 2 keer gedurende 5 minuten elk.</li>
		<li>Was de dia's met PBS 2 keer gedurende 5 minuten elk.</li>
		<li>Incubeer de dia's met 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten om de membranen te permeabiliseren.</li>
		<li>Was de dia's met PBS 3 keer gedurende 5 minuten elk.</li>
		<li>Incubeer de glaasjes in 15 μg/ml RNase-vrij proteïnase K gedurende 30 minuten bij 37 °C.</li>
		<li>Incubeer de glaasjes met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 3 minuten om de spijsvertering te stoppen.</li>
		<li>Was de dia's met PBS 2 keer gedurende 5 minuten elk.</li>
		<li>Incubeer de dia's in 100 mM triethanolamine buffer (pH 8,0) met 0,25% (v/v) azijnzuuranhydride 2 keer gedurende 5 minuten elk.</li>
		<li>Voeg DEPC-water toe aan de vochtkamer van de dia. Voeg 20 μL pre-hybridisatieoplossing (met 100 μg/ml zalmsperma-DNA) toe aan de dia's. Plaats de dia's in de schuifvochtkamer. Incubeer de glijbanen bij 42 °C gedurende 4 uur. OPMERKING: Het is noodzakelijk om de dichtheid van het deksel van de natte doos te waarborgen en dat de natte doos altijd horizontaal wordt gehouden om vervluchtiging en afwijking van het weefsel van de pre-hybridisatieoplossing en de gevolgde hybridisatieoplossing te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Hybridisatie van drosophila embryo sectie<ol>
<li>Verwijder de pre-hybridisatieoplossing en was de dia's met 0,2x SSC (150 mM natriumchloride, 15 mM natriumcitraat, pH 7,0) 3 keer gedurende 5 minuten elk. Veeg overtollige 0,2x SSC rond de weefselmonsters af.</li>
		<li>Breng 30 μL sondehybridisatieoplossing (met 2-6 ng digoxine-gelabelde RNA-sonde door verdunning in pre-hybridisatieoplossing) aan met een pipet. Incubeer de glaasjes in de schuifvochtkamer bij 42 °C gedurende ongeveer 20 uur. OPMERKING: Zorg ervoor dat de dop strak is als de suggestie van de laatste noot. Anders zal de opdroging veroorzaakt door het lekken van pre-hybridisatie of pre-hybridisatie vuile achtergrond genereren, inclusief pseudo-positieve in dia's.</li>
	</ol></li>
	<li>Kruising<ol>
<li>Verwijder de hybridisatieoplossing en was de glaasjes met 4x SSC-oplossing 4 keer gedurende 15 minuten elk bij 37 °C.</li>
		<li>Was de glaasjes in 2x SSC-oplossing met 20 μg/ml RNase A gedurende 30 minuten bij 37 °C.</li>
		<li>Was de glaasjes gedurende 15 min in 1x SSC-oplossing op 37 °C.</li>
		<li>Was de glaasjes gedurende 15 minuten in 0,5x SSC-oplossing op 37 °C.</li>
		<li>Was de glaasjes gedurende 15 minuten in 0,1x SSC-oplossing op 37 °C.</li>
		<li>Was de dia's met PBS 3 keer gedurende 5 minuten elk.</li>
		<li>Was de glaasjes in wasbuffer (100 mM maleïnezuur, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) gedurende 1 min.</li>
		<li>Incubeer de glaasjes in 100 ml vers bereide blokkerende oplossing (2% schapenserum in maleïnezuurbuffer zonder Tween 20) gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Incubeer de dia's in 20 ml antilichaamoplossing gedurende 45 minuten.<ol>
<li>Centrifugeer het antilichaam gedurende 5 minuten bij 10.000 tpm in de oorspronkelijke injectieflacon vóór elk gebruik en pipetteer de benodigde hoeveelheid zorgvuldig van het oppervlak. Verdun anti-digoxigenine-AP 1:5000 (150 mU/ml) in blokkerende oplossing.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Was de glaasjes in 100 ml wasbuffer 2 keer gedurende 15 minuten elk om ongebonden antilichaamconjugaat te verwijderen.</li>
		<li>Breng de dia's in evenwicht in 20 ml detectiebuffer (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) gedurende 2-5 minuten.</li>
		<li>Incubeer de dia's met 10 ml vers bereide kleursubstraatoplossing in de diavochtkamer. De reactie begint binnen enkele minuten en is na 16 uur voltooid. Niet schudden of mengen terwijl de kleur zich ontwikkelt.</li>
		<li>Was de glaasjes gedurende 5 minuten met 50 ml gedestilleerd water om de reactie te stoppen.</li>
		<li>Droog het monster een nacht in het donker.</li>
		<li>Droog de glaasjes uit in 70% ethanol, 80% ethanol, 90% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol I en 100% ethanol II gedurende elk 3 minuten.</li>
		<li>Verwijder de dia's in 100% xyleen I, 100% xyleen II en 100% xyleen III gedurende elk 20 minuten.</li>
		<li>Monteer de glijbanen met neutrale balsem.</li>
		<li>Documenteer afbeeldingen en analyseer met de omgekeerde microscopie en fabrikantsoftware. Voer distributieanalyse uit met ImageJ op basis van de dichtheid van het positieve signaal langs de lengteas of binnen de differentiële zone van embryo's. OPMERKING: Tijdens de incubatie met de vers bereide kleursubstraatoplossing in stap 7.4.12 kan de reactiekleur zelfs met een met het blote oog worden gezien. Deze observatie over hoe kleurontwikkeling kan worden geïnspecteerd onder stereoscoop. Zodra de reactiekleur redelijk is en de stap 7.4.13 kan worden uitgevoerd om de reactie te stoppen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Ca2%2B+sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium Sparks.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+Receptors%3A+Functional+Structure+and+Their+Regulatory+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors.</a> Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).</li>
<li>Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%3A+an+underlying+link+between+cardiac+disease+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis.</a> Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).</li>
<li>Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+cDNA+encoding+a+Drosophila+ryanodine+receptor+and+functional+studies+of+the+carboxyl-terminal+calcium+Release+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).</li>
<li>George, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+FKBP+family+protein%3A+evaluation%2C+structure%2C+and+function+in+mammals+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster.</a> BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syncytium+calcium+signaling+and+macrophage+function+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+CaSR%2FIP3R+in+prostate+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).</li>
<li>Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+examination+of+calcium+signaling+in+cancer-+from+tumorigenesis%2C+to+immune+evasion%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+defects+and+altered+ryanodine+receptor+function+in+mice+lacking+FKBP12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12.</a> Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrogen+protects+FKBP12.6+null+mice+from+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy.</a> Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).</li>
<li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li>
<li>Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+calcium+increases+explosively+in+activating+medaka+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Free calcium increases explosively in activating medaka eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).</li>
<li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).</li>
<li>Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+health+span+and+life+span+in+Drosophila+by+S107+requires+the+calstabin+homologue+FK506-BP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).</li>
<li>Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ryanodine+receptor+is+essential+for+larval+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).</li>
<li>Feng, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+expression+of+DmFKBP12%2FCalstabin+during+embryonic+early+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster.</a> Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The embryonic development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer. 633-645 (1958).</li>
<li>Xu, X., Dong, C., Vogel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemicentins+Assemble+on+Diverse+Epithelia+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+%28ryanodine+receptor%29+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+cardiac+arrhythmia+through+ryanodine+receptor-stabilizing+protein+calstabin2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2.</a> Science. 304 (5668), 292-296 (2004).</li>
<li>Bellinger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+ryanodine+receptor+complex+causes+%26%2334%3Bleaky%26%2334%3B+channels%3A+a+molecular+mechanism+for+decreased+exercise+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Remodeling of ryanodine receptor complex causes &#34;leaky&#34; channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).</li>
<li>Maruyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12+is+a+critical+regulator+of+the+heart+rhythm+and+the+cardiac+voltage-gated+sodium+current+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice.</a> Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12+is+the+only+FK506+binding+protein+mediating+T-cell+inhibition+by+the+immunosuppressant+FK506%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506.</a> Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).</li>
<li>Zalk, R., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+release+channels+join+the+%27resolution+revolution%27%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

RyRs en IP3Rs gemedieerde calciumsignalering is een fundamentele route in veel fysiologische en pathologische processen van zowel gewervelde als ongewervelde dieren1,2,3,4. Bij mensen leiden puntmutaties, zoals CPVT-geassocieerde R4496C-mutatie, in het RyR2-gen tot calciumlekkage uit het sarcoplasmatisch reticulum van cardiomyocyten, wat resulteert in cardiale disfunctie. Deze mutaties presente...

Calcium geïnduceerde calciumafgiftesignalering (CICR) speelt een cruciale rol in veel biologische processen, zoals skelet- / gladde spieren en cardiale vasculaire functie, celproliferatie en apoptose, ontwikkeling, veroudering, neuronale synaptische plasticiteit en regeneratie1,2,3,4,5,6 . Ryanodinereceptoren (RyRs) en inositol 1,4,5-trisfosfaatreceptoren (IP3R's) zijn belangrijke spelers in de calciumsignaleringsroute die wordt gecontroleerd door hun regulatoren eiwitkinase A (PKA), Ca2 + / calmodulin-afhankelijk eiwitkinase II (CaMKII), FK506-bindende eiwitten (FKBPs), calsequestrin (CSQ), triatidine en junctin1, 2,3,4,5,6 . Abnormale menselijke expressie en mutaties in deze eiwitten kunnen leiden tot pathologische fysiologie zoals aritmieën7 en oncogene proliferatie8,9.
FKBPs reguleren de calciumafgifte uit de endoplasmatische reticulaire (ER) door RyRs. Dit proces is essentieel voor het mechanisme van contractie en dus verantwoordelijk voor alle mechanische bewegingen die worden gegenereerd door myosine-actinecontractie door calcium-geïnduceerde calciumafgifte samen met embryonale RyRs1,2. In muismodellen is het ontbreken van RyR2 en zijn regulator FKBP12 /Calstabin steevast dodelijk, hetzij tijdens de embryonale ontwikkeling of in de vroege postnatale periode10,11,12. FKBP12/Calstabin knock-out muizen vertonen kritieke hartafwijkingen met onregelmatige excitatie-contractiekoppeling (EC) en hersenoedeem tijdens de embryonale ontwikkeling. Dit geeft aan dat FKBP12/Calstabin een essentiële rol speelt bij het reguleren van RyR2-kanaalexpressie, wat belangrijk is voor zowel de cardiale als de cerebrale ontwikkeling10.
RyR uitgevoerde calciumvonken werden aanvankelijk ontdekt in de zygote-vormingsfase van bevruchte Medaka-eieren13,14. Er zijn echter weinig onderzoeken uitgevoerd naar de functie van calciumsignalering in de vroege embryonale ontwikkeling. In Drosophila melanogaster leveren de resultaten verkregen van DmFKBP12 S107-mutanten sterk bewijs ter ondersteuning van het belang van dit gen voor de ontwikkeling van larven en een gezonde levensduur, die wordt toegeschreven aan zijn functie tegen oxidatieve stress15,16. Onlangs identificeerden we de dynamische lokalisatie van FKBP12 / Calstabin-eiwit en boodschapper-RNA tijdens de vroege ontwikkeling van Drosophila melanogaster17. Met behulp van de benaderingen die in deze methodologie worden beschreven, konden we de expressie van FKBP12 / Calstabin in D. melanogaster volgen tijdens het syncytiele blastoderm (0-2 uur), cellulair blastoderm (2-3 uur), vroege gastrula (3-12 uur) en late gastrula (12-24 uur). In dit artikel presenteren we de gedetailleerde protocollen van elke benadering in de vorige studie, inclusief pre-embryo-inbedding voor klassieke paraffinesectie, pre-coating diabehandeling voor embryonale secties, histo-chemie kleuring en immunostaining, en mRNA in-situ hybridisatie voor identificatie van genexpressie.

<table><tbody><tr><td>-20&deg;C Koelkast</td><td>Meiling Biology &amp;Medical</td><td>DW-YL270</td><td>Geschikt voor reagensopslag</td></tr><tr><td>-80&deg;C Ultra lage temperatuur koelkast</td><td>Thermo</td><td>Forma 90 Series</td><td>Geschikt voor reagensopslag</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBB6360V</td><td>Bereiding van druivensap-agar platen</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmenten</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>Voor de detectie van digoxigenine-gelabelde verbinding</td></tr><tr><td>Biochemische incubator</td><td>Shanghai Bluepard Instruments</td><td>LRH-250</td><td>In-situ Hybridisatie</td></tr><tr><td>Bouin's oplossing</td><td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td><td>69945460</td><td>Drosophila Embryo Inbedding</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>540BH07808</td><td>In-situ Hybridisatie</td></tr><tr><td>Centrifugebuis</td><td>Denville</td><td>C-2170</td><td>Drosophila Embryo Verzameling</td></tr><tr><td>Chrome Alum</td><td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td><td>10001018</td><td>Bekleden van dia's</td></tr><tr><td>Constant temperatuur waterbad</td><td>Jintan Henfeng Instruments</td><td>KW-1000DC</td><td>Hematoxyline-Eosine Kleuring, Immunohistochemie, In-situ Hybridisatie en Periodieke Zuur-Zilver Methenamine Kleuring</td></tr><tr><td>Dako REAL EnVision Detectiesysteem</td><td>Dako</td><td>K5007</td><td>In immunohistochemische reactie of in situ hybridisatiereactie, het bindt aan het primaire antigeenantilichaam, en het doelwit wordt gelabeld door kleuring.</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>In-situ Hybridisatie</td></tr><tr><td>DIG RNA Labelling Kit</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>RNA labelen met diagoxigenine-UTP door in vitro transcriptie met SP6 en T7 RNA polymerase</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664</td><td>De voorraden van Drosophila melanogaster mutant</td></tr><tr><td>Elektrisch blaasdrogenkast</td><td>Tianjin Taiste Instruments</td><td>101-0AB</td><td>Voor het bekleden van dia's en paraffine-inbedding</td></tr><tr><td>Eosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251</td><td>Hematoxyline-Eosine Kleuring</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td><td>100092680</td><td>Paraffine Inbedding, Hematoxyline-Eosine Kleuring, Immunohistochemie, In-situ Hybridisatie en Periodieke Zuur-Zilver Methenamine Kleuring</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td><td>10010328</td><td>Bekleden van dia's</td></tr><tr><td>Goudchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379948</td><td>Periodieke Zuur-Zilver Methenamine Kleuring</td></tr><tr><td>Hematoxyline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td>Hematoxyline-Eosine Kleuring</td></tr><tr><td>High Pure PCR Product Purification Kit</td><td>Roche</td><td>11732668001</td><td>Voor zuivering van PCR-producten</td></tr><tr><td>Intelligente constant temperatuur en vochtigheidskast</td><td>Ningbo Jiangnan Instruments</td><td>HWS</td><td>Voor vliegenonderhoud</td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>HyAgarose</td><td>14190108029</td><td>Voor-inbedding</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td><td>10014108</td><td>Drosophila Embryo Verzameling</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>ZEISS</td><td>Observer.A1</td><td>Hematoxyline-Eosine Kleuring, Immunohistochemie, In-situ Hybridisatie en Periodieke Zuur-Zilver Methenamine Kleuring</td></tr><tr><td>Microscoop dia's</td><td>MeVid Labware Manufacturing</td><td>P105-2001</td><td>Bekleden van dia's</td></tr><tr><td>Neutrale Gum</td><td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td><td>10004160</td><td>Hematoxyline-Eosine Kleuring</td></tr><tr><td>N-heptaan</td><td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td><td>40026768</td><td>Drosophila Embryo Verzameling</td></tr><tr><td>Paraffine snijder</td><td>Huahai science instrument</td><td>HH-2508III</td><td>In-situ Hybridisatie</td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td><td>69019461</td><td>Paraffine Inbedding</td></tr><tr><td>pH/mV Meter</td><td>Sartorius</td><td>PB-10</td><td>Voor het bepalen van de pH-waarde van een oplossing</td></tr><tr><td>Zilvernitraat</td><td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td><td>10018461</td><td>Periodieke Zuur-Zilver Methenamine Kleuring</td></tr><tr><td>Ultrapuur watermeter</td><td>Thermo</td><td>AFXI-0501-P</td><td>In-situ Hybridisatie</td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td><td>10023418</td><td>Paraffine Inbedding</td></tr></tbody></table>

een protocol voor immunohistochemie en rna-in-situ distributie binnen vroege drosophila-embryo's

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium geïnduceerde calciumafgiftesignalering (CICR) speelt een cruciale rol in veel biologische processen. Elke cellulaire activiteit van celproliferatie en apoptose, ontwikkeling en veroudering, tot neuronale synaptische plasticiteit en regeneratie zijn in verband gebracht met Ryanodine-receptoren (RyRs). Ondanks het belang van calciumsignalering is het exacte mechanisme van zijn functie in vroege ontwikkeling onduidelijk. Als organisme met een korte draagtijd zijn de embryo's van Drosophila melanogaster de belangrijkste proefpersonen voor het onderzoeken van de distributie en lokalisatie van CICR-geassocieerde eiwitten en hun regulatoren tijdens de ontwikkeling. Vanwege hun lipiderijke embryo's en chitinerijke chorion wordt hun nut echter beperkt door de moeilijkheid om embryo's op glazen oppervlakken te monteren. In dit werk introduceren we een praktisch protocol dat de hechting van drosophila-embryo op dia's aanzienlijk verbetert en gedetailleerde methoden voor succesvolle histochemie, immunohistochemie en in-situ hybridisatie. De chroomalum gelatine slide-coating methode en embryo pre-embedding methode verhoogt dramatisch de opbrengst bij het bestuderen van Drosophila embryo-eiwit en RNA-expressie. Om deze aanpak aan te tonen, bestudeerden we DmFKBP12/Calstabin, een bekende regulator van RyR tijdens de vroege embryonale ontwikkeling van Drosophila melanogaster. We identificeerden DmFKBP12 al in de syncytiele blastodermfase en rapporteerden het dynamische expressiepatroon van DmFKBP12 tijdens de ontwikkeling: aanvankelijk als een gelijkmatig verdeeld eiwit in het syncytiele blastoderm, vervolgens preliminaal lokaliserend naar de kelderlaag van de cortex tijdens cellulair blastoderm, voordat het zich verspreidde in de primitieve neuronale en spijsverteringsarchitectuur tijdens de drie-gem laagfase in vroege gastrulatie. Deze verdeling kan de cruciale rol verklaren die RyR speelt in de vitale orgaansystemen die afkomstig zijn van deze lagen: het subo-oesofageale en supra-oesofageale ganglion, ventraal zenuwstelsel en het bewegingsapparaat.

De cijfers beschrijven protocollen die worden gebruikt om de uitdaging van het bevestigen van hoge lipide- en chitinebevattende chorion Drosophila-embryo's (tabel 1) aan het glasplaatoppervlak te overwinnen voor onderzoek en experimenten. Met behulp van de chroomalum gelatine slide-coating methode getoond in figuur 1, hebben we de hechting van Drosophila embryo's op het oppervlak van dia's verbeterd, terwijl de embryo pre-embedding methode getoond in <stron...

Hier beschrijven we een protocol voor detectie en lokalisatie van Drosophila embryo-eiwit en RNA van verzameling tot pre-embedding en embedding, immunostaining en mRNA in situ hybridisatie.

Een protocol voor immunohistochemie en RNA-in-situ distributie binnen vroege drosophila-embryo's

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Als een organisme met een korte draagtijd zijn de embryo's van Drosophila melanogaster de belangrijkste proefpersonen voor het onderzoeken van de distributie en lokalisatie van eiwitten en hun regulatoren tijdens de ontwikkeling. Vanwege hun lipiderijke embryo's en chitinerijke chorion wordt hun nut echter beperkt door de moeilijkheid om embryo's op glazen oppervlakken te monteren. In dit werk introduceren we een praktische methode die de hechting van drosophila-embryo op dia's aanzienlijk verbetert en onze methoden voor succesvolle histochemie, immunohistochemie en in-situ hybridisatie beschrijft.Voorafgaand aan de hier getoonde stappen moeten dia's worden gewassen met afwasmiddel en vervolgens worden gespoeld in leidingwater en gedestilleerd water voordat ze in de oven worden geplaatst om te drogen. Droge glaasjes moeten 24 uur voorzichtig in kaliumdichromaat weken voordat ze worden gespoeld en opnieuw gedroogd en vervolgens gedurende ten minste twee uur in 95% ethanol worden geplaatst. Tijdens deze stap kunt u verdere dia's of de chroom-aluingelatine volgens onze methoden bereiden.Gelatine kan dan voor gebruik in 60 graden badwater worden bewaard. Om dia's te coaten, laat u een kleine hoeveelheid gelatine op een rand van de dia vallen. Gebruik vervolgens een andere glasplaat om de gelatine langzaam en gelijkmatig over het oppervlak van de te coaten dia te slepen.Hierdoor ontstaat een dunne, egale laag. Voordat u in een rek of droogapparaat wordt geplaatst om in een oven te worden bewaard om nog een nacht of 48 uur volledig te drogen. Embryo's worden verzameld met behulp van een druivensap agar plaat, eenmaal klaar, kan de druivensap agar plaat dan worden verwijderd.Overspoel de plaat met PBS en borstel voorzichtig met een zachte borstel om eventuele gehechte embryo's te verwijderen. Verwijder embryo's met PBS in een centrifugebuis van 1,5 milliliter en laat op ijs rusten. Zodra het embryo op ijs is neergedaald, verwijdert u voorzichtig het supernatant PBS.Zorg ervoor dat u het embryo aan de onderkant van de buis niet verstoort. Voeg 1 ml 50% bleekmiddel toe aan het monster en schud voorzichtig gedurende twee minuten. Verwijder het bleekmiddel door filtratie en was embryo's in PBS drie keer.Bereid n-heptaan voor. Zodra u klaar bent, wast u de embryo's van het filterpapier in n-heptaan door het filtreerpapier voorzichtig in de oplossing te schudden. Laat embryo's zich op de bodem van de n-heptaanplaat nestelen en verzamel dit n-heptaan in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter.Voeg één milliliter methanol toe aan de buis, laat de oplossing neerslaan en zuig vervolgens de n-heptaan methanol aan. Was het embryo in PBS drie tot vijf keer om resterende methanol te verwijderen. Verwijder deze extra PBS en voeg Bouin's fixatief toe en laat 30 tot 60 minuten bezinken om de embryo's te fixeren.Verwijder bouin's fixatief en was de embryo's drie keer opnieuw in PBS. Bereid 1,2% agarose in PBS en houd warm in een waterbad van 60 graden en bereid de embryo's vervolgens voor op inbedding door voorzichtig extra PBS aan te zuigen waarin het is opgeslagen. Zorg ervoor dat u de embryo's aan de onderkant niet verstoort en zuig vervolgens de embryoplug aan de onderkant van de oplossing op en plaats deze voorzichtig in een flesdopvorm.Zuig eventuele extra PBS uit deze mal voordat u 1,2% agarose-gel toevoegt. Bereid een oplossing van PBS voor om deze agarosepluggen op te slaan. Zodra de agarose is gestold, kunnen individuele pluggen vervolgens in deze PBS worden verplaatst voor opslag.Hier laten we het sequentiële uitdrogingsproces zien. Laat elke keer 15 minuten voor incubatie. Verwijder vervolgens de 100% ethanol en bevestig in een één-op-één oplossing van ethanol en xyleen gedurende nog eens 15 minuten.Eenmaal verwijderd uit deze één-op-één oplossing, verwijder in zuiver xyleen gedurende één minuut. Nu is het weefselmonster klaar om te worden verplaatst naar een verwarmde één-op-één xyleenparaffine-oplossing. Laat 30 minuten zitten voordat je het definitief insluit in 100% paraffine.Ga naar de eerste van 100% paraffine en rust twee uur. Herhaal dit proces in zijn twee en drie paraffines. Het monster is nu klaar om in een mal te worden verplaatst en de mal wordt gevuld met was om het inbeddingsproces te voltooien.Inbedding van Drosophila embryo's. Plaats bereide paraffinesecties van Drosophila-embryo's gedurende 15 minuten in een oven van 60 graden. Plaats ze in een 100% oplossing van xyleen.We beginnen dan met rehydratatie. Plaats de dia's in elk van deze oplossingen gedurende drie minuten. Zodra de dia in gedestilleerd water is, plaatst u deze gedurende twee minuten in de hematoxyline-oplossing.Als u klaar bent, zorg er dan voor dat u zoveel mogelijk van de oplossing van de dia aftapt. Zodra de dia in gedestilleerd water is gewassen, bevlekt u de dia gedurende één minuut in eosine. Verwijder ten slotte de dia van de eosine en was in gedestilleerd water.Zodra deze dia schoon is, beginnen we nu aan ons laatste uitdrogingsproces. Uiteindelijk gedurende vijf minuten in 100% xyleen geplaatst. Dit proces wordt herhaald in twee nieuwe oplossingen van 100% xyleen en laat een kleine hoeveelheid neutrale gom langs een rand van de dia vallen.Neem deze afdekslip en plaats deze voorzichtig op een rand van de dia. Deparaffineer eerst de dia's door ze in 100% xyleen te plaatsen. Zodra de glaasjes uit gedestilleerd water zijn verwijderd, moeten ze worden bedekt met 1% periodieke zuuroplossing.Vervolgens gooien we de overtollige oplossing weg en spoelen we in gedestilleerd water. Door de schuif direct in een voorverwarmde oplossing te plaatsen. Zodra dit is voltooid, spoelen we de glaas in gedestilleerd water en kleuren we de oplossing vervolgens gedurende één tot twee minuten met 0,2% goudchloride.Vervolgens fixeren we het weefsel met 3% natriumthiosulfaat gedurende drie minuten met gedestilleerd water. En dan counteren met hematoxyline. Na het counterstainen kan de vlek worden gewassen met beide buizen gedestilleerd water, zoals hier weergegeven.Daarna gaan we verder met het uitdrogingsproces. Volg dit door de dia's rechtstreeks in 100% xyleen te plaatsen en vervolgens een kleine hoeveelheid neutrale gom op de hoek van de dia aan te brengen. Dek voorzichtig af met een afdekslip.Begin met het voorbereiden van de dia's zoals voorheen door te deparaffiniseren en xyleen. En dan in één-op-één xyleenethanol. Zodra de dia's zijn gedeparaffineerd, beginnen we met het rehydrateren van hun weefsel en uiteindelijk in PBS.Plaats de glaasjes gedurende 10 minuten in 0,3% waterstofperoxide gemaakt in methanol. Vervolgens worden de dia's bedekt met 20 ml doelophaaloplossing. De dia's kunnen vervolgens in de beitsdoos worden geplaatst.Plaats de spuitdoos in een stomer, zodat er geen oplossing ontsnapt en de dia's nog steeds volledig bedekt zijn. Merk op dat het deksel van de vlekkendoos niet volledig moet worden gesloten, zodat waterdamp kan ontsnappen tijdens het stomen. En dan drie keer zachtjes in PBS-T spoelen.Gooi de overtollige oplossing weg en herhaal het proces, dit keer met PBS. Vervolgens incuberen we de glaasjes vijf tot 10 minuten in een peroxideblok en spoelen dan nog een paar keer in PBS-T en vervolgens in PBS. Bereid het antilichaam voor en laat het direct op het weefsel vallen.Deze weefsels kunnen vervolgens vier uur lang worden geïncubeerd of bij kamertemperatuur. Het secundaire antilichaam moet gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur worden geïncubeerd, wat gedurende twee tot 10 minuten kleuring is met 5% DAB. Nadat de juiste kleur is verkregen, spoelt u in gedestilleerd water en countert u vervolgens hematoxyline.Na deze hematoxylinevlek kunnen de dia's vervolgens achtereenvolgens worden uitgedroogd. Plaats de glaasjes in 100% xyleen en laat drie minuten weken. Laat vervolgens kleine hoeveelheden neutrale kauwgom op een rand van de dia vallen.Zodra een kauwgom is geplaatst, neemt u de schuifafdekking en plaatst u deze voorzichtig vanaf een rand van de glijbaan. Voeg één microgram gezuiverd gelineariseerd sjabloon-DNA toe aan een steriele RNase-vrije reactieflacon. Voeg vervolgens voldoende steriel RNase-vrij DEPC-behandeld dubbel gedestilleerd water toe om een totaal monstervolume van 13 microliter te maken.Centrifugeer dan kort en incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Voor RNase-beschermingsexperimenten raden we aan om gedurende 15 minuten te broeden met twee microliter Dnase-1, RNase-vrij om sjabloon-DNA te verwijderen. Zodra de incubatiestap is voltooid, stop de reactie door twee microliter van 0,2 molaire EDTA toe te voegen bij een pH van acht.Voorafgaand aan de stappenshow hier werden de dia's gedeparaffiniseerd en gerehydrateerd, volgens ons eerder gedemonstreerde protocol. Na rehydratatie incubeer de glaasjes in 0,01 mol per liter PBS bij een pH van 7,4 gedurende vijf minuten elk om de fixatieve oplossing uit het weefsel te verwijderen. Na het spoelen in PBS spoelen we vervolgens twee keer vijf minuten lang met 100 millimolar per liter glycine-oplossing om vrije aldehydegroepen uit het weefsel te verwijderen.Spoel na deze stap de glijden met PBS gedurende vijf minuten. Incubeer vervolgens in PBS met 0,3% triton X-100 gedurende 15 minuten voorafgaand aan het spoelen en broed vervolgens opnieuw met één microgram per microliter proteïnase K.Vervolgens fixeert u dia's met 4% paraformaldehyde en PBS bij een pH van 7,2 gedurende drie minuten. Was vervolgens de glaasjes voor het broeden met 0,1 molaire triethanolaminebuffer pH 8, die 0,25% azijnzuuranhydride bevat.U kunt ervoor kiezen om de doos in dit stadium te kantelen om volledige dekking met de oplossing te garanderen. De doos wordt bereid door 20% glycerol of DEPC-water toe te voegen aan de bodem van een droge hybridisatiedoos. Bedek vervolgens de dia's in 20 microliter pre-hybridisatieoplossing.Het sperma-DNA van zalm in een concentratie van 100 microgram per milliliter aan elke dia. En dan vier uur lang incuberen bij 42 graden Celsius. Dit gebeurt in een voorbereide bevochtigde doos om ervoor te zorgen dat de oplossing tijdens dit proces niet droogt.In de post-hybridisatiefase is het erg belangrijk dat de hybridisatieoplossing volledig uit uw monsters wordt gespoeld. Dit kan worden gedaan in opeenvolgende spoelingen van 15 minuten bij 37 graden, met behulp van vier keer concentratie SSC, twee keer concentratie één keer concentratie, 0,5 keer concentratie en 0,1 keer concentratie SSC-oplossing. Elk broeden gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.Nadat dit is gebeurd, wast u drie keer met PBS gedurende vijf minuten voordat u de wasbuffer toevoegt. Wasbuffer moet gedurende één minuut voorafgaand aan de volgende stappen worden gespoeld Zorg ervoor dat de wasbuffer volledig droog is van de dia's voordat u de volgende oplossing toevoegt. Voeg 100 milliliter blokkeringsoplossing toe aan elke dia en incubeer de dia gedurende 30 minuten.Dit kan het beste in een lichtvrije omgeving om een goede vlek te garanderen. Incubeer vervolgens de dia's opnieuw gedurende 30 minuten in 20 ml antilichaamoplossing. Breng de antilichaamoplossing rechtstreeks op dia's aan voor volledige dekking van uw weefsel.Zodra de incubatie is voltooid, brengt u 100 milliliter wasbuffer aan. Incubeer gedurende 15 minuten in lichtvrije omstandigheden om ongebonden antilichaamconjugaten te verwijderen. Verwijder de wasbuffer.Breng vervolgens 20 milliliter detectiebuffer aan en laat ongeveer vier minuten incuberen. Verwijder na vier minuten de detectiebuffer. Droog de glaasjes om geen extra oplossing te garanderen en voeg 10 milliliter vers bereide kleursubstraatoplossing toe.Deze reactie begint binnen een paar minuten, maar is na 16 uur voltooid. Laat dus voor die periode in een lichte vrije toestand incuberen. Zodra de gewenste plekken waar banden worden gedetecteerd, wast u de dia met 50 milliliter TE-buffer om de reactie te stoppen.En voltooi vervolgens ons eerder getoonde uitdrogingsproces en montageproces voor neutrale gom. Figuur één en twee demonstreren de chroomaluminiumgelatine coating methode voor paraffine secties en de inbeddingsmethode voor expressieprofiel van FKBP12 en DmFKBP12 bij de ontwikkeling van Drosophila embryo's. Figuur drie toont de eiwitverdeling van antilichaam gedetecteerd FKBP12 in de syncytiele cellulaire blastodermstadia.Uit deze histochemische resultaten kan worden gezien dat FKBP12-expressie minder gepolariseerd is in het syncytiele blastoderm en vervolgens begint te lokaliseren in het keldermembraan onder het trophectoderm-epitheel informeert de gradiënt met meer expressie in de voorste en achterste polen. Figuur vier, die de vroege en late gasrelatiestadia van het Drosophila-embryo volgt, laat zien dat het FKBP12-eiwit beperkt raakt tot bepaalde architecturale componenten van het primitieve embryonale weefsel. Met minder extracellulaire verdeling dan die waargenomen in vroege en late gastro-embryonale stadia.Interessant is dat de hierboven beschreven dynamische eiwitverdeling niet gepaard gaat met overeenkomstige veranderingen in MRI-niveaus van FKBP12 zoals te zien in figuur vijf. Dit wijst erop dat eiwitexpressie het resultaat is van een nog onbekend posttransioneel moleculair mechanisme. Ryanodine receptor gemedieerde calcium signalering is een fundamentele route in vele fysiologische en pathologische processen van zowel gewervelde als ongewervelde dieren.Van mutaties in dit gen is bekend dat ze veel fysiologische stoornissen veroorzaken die leiden tot ziekte of vroege hartdood. De rol die dit gen speelt in de vroege ontwikkeling van Drosophila is echter moeilijk te bestuderen. Als doorvoercomponent van het embryo, lipide-rijk embryo en chitine-rijk chorion, maken studies van eiwit en embryonale expressie in de vroege Drosophila ontwikkeling moeilijk.De diacoating, embryo-inbedding en immunohistochemische technieken die in dit artikel worden beschreven, hebben ons in staat gesteld om de dynamische verdeling van ryanodinereceptoreceptoreiwit en mRNA in detail te bestuderen. We delen deze technieken en de hoop dat ze anderen in staat zullen stellen om andere eiwitten te bestuderen tijdens vroege ontwikkelingsstadia van Drosophila.

a-protocol-for-immunohistochemistry-rna-situ-distribution-within

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol wordt beschreven hoe u immunohistochemie uit te voeren op ontleed Drosophila larve.

Drosophila larven NMJ Immunohistochemie

Beschrijven we de procedure voor te bereiden...

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

Drosophila popstadium Buik Immunohistochemie

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

We beschrijven een multi-target chromogene whole-mount in situ hybridisatie (MC-WISH) procedure in intacte Drosophila embryo's toestaan ​​gelijktijdige en specifieke detectie van drie verschillende mRNA distributie patronen door contrasterende kleur neerslagen.

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Deze studie presenteert een vereenvoudigd protocol voor weefselverwerking met onthoofding, fixatie, cryosectie, fluorescentiekleuring, immunokleuring en beeldvorming, dat kan worden uitgebreid tot confocale en multifotonbeeldvorming. De methode behoudt een werkzaamheid die vergelijkbaar is met complexe dissecties, waarbij de noodzaak van geavanceerde motorische vaardigheden wordt omzeild. Kwantitatieve beeldanalyse biedt een uitgebreid onderzoekspotentieel.

Directe cryosectie van Drosophila-koppen voor verbeterde kleuring en immunokleuring van de hersenen

Deze protocollen beschrijven hoe de organisatie en occluderende functie van geplooide septaatverbindingen in controle- en mutante Drosophila-embryonale epitheel karakteriseerd kunnen worden.

Immunokleuring en kleurstofpenetratie-experimenten om kerngeplooide septaat-junction-eiwitten te definiëren in het embryonale epitheel van Drosophila

Leer immunohistochemie en RNA-in-situ-hybridisatie voor ontwikkelingsbiologie met Drosophila melanogaster-embryo's. Dit protocol verbetert hechting aan objectglaasjes voor betere visualisatie.

Een protocol voor immunohistochemie en RNA-in-situ distributie binnen vroege drosophila-embryo's

Meer video's verkennen