Een protocol voor immunohistochemie en RNA-in-situ distributie binnen vroege drosophila-embryo's

Als een organisme met een korte draagtijd zijn de embryo's van Drosophila melanogaster de belangrijkste proefpersonen voor het onderzoeken van de distributie en lokalisatie van eiwitten en hun regulatoren tijdens de ontwikkeling. Vanwege hun lipiderijke embryo's en chitinerijke chorion wordt hun nut echter beperkt door de moeilijkheid om embryo's op glazen oppervlakken te monteren. In dit werk introduceren we een praktische methode die de hechting van drosophila-embryo op dia's aanzienlijk verbetert en onze methoden voor succesvolle histochemie, immunohistochemie en in-situ hybridisatie beschrijft.

Voorafgaand aan de hier getoonde stappen moeten dia's worden gewassen met afwasmiddel en vervolgens worden gespoeld in leidingwater en gedestilleerd water voordat ze in de oven worden geplaatst om te drogen. Droge glaasjes moeten 24 uur voorzichtig in kaliumdichromaat weken voordat ze worden gespoeld en opnieuw gedroogd en vervolgens gedurende ten minste twee uur in 95% ethanol worden geplaatst. Tijdens deze stap kunt u verdere dia's of de chroom-aluingelatine volgens onze methoden bereiden.

Gelatine kan dan voor gebruik in 60 graden badwater worden bewaard. Om dia's te coaten, laat u een kleine hoeveelheid gelatine op een rand van de dia vallen. Gebruik vervolgens een andere glasplaat om de gelatine langzaam en gelijkmatig over het oppervlak van de te coaten dia te slepen.

Hierdoor ontstaat een dunne, egale laag. Voordat u in een rek of droogapparaat wordt geplaatst om in een oven te worden bewaard om nog een nacht of 48 uur volledig te drogen. Embryo's worden verzameld met behulp van een druivensap agar plaat, eenmaal klaar, kan de druivensap agar plaat dan worden verwijderd.

Overspoel de plaat met PBS en borstel voorzichtig met een zachte borstel om eventuele gehechte embryo's te verwijderen. Verwijder embryo's met PBS in een centrifugebuis van 1,5 milliliter en laat op ijs rusten. Zodra het embryo op ijs is neergedaald, verwijdert u voorzichtig het supernatant PBS.

Zorg ervoor dat u het embryo aan de onderkant van de buis niet verstoort. Voeg 1 ml 50% bleekmiddel toe aan het monster en schud voorzichtig gedurende twee minuten. Verwijder het bleekmiddel door filtratie en was embryo's in PBS drie keer.

Bereid n-heptaan voor. Zodra u klaar bent, wast u de embryo's van het filterpapier in n-heptaan door het filtreerpapier voorzichtig in de oplossing te schudden. Laat embryo's zich op de bodem van de n-heptaanplaat nestelen en verzamel dit n-heptaan in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter.

Voeg één milliliter methanol toe aan de buis, laat de oplossing neerslaan en zuig vervolgens de n-heptaan methanol aan. Was het embryo in PBS drie tot vijf keer om resterende methanol te verwijderen. Verwijder deze extra PBS en voeg Bouin's fixatief toe en laat 30 tot 60 minuten bezinken om de embryo's te fixeren.

Verwijder bouin's fixatief en was de embryo's drie keer opnieuw in PBS. Bereid 1,2% agarose in PBS en houd warm in een waterbad van 60 graden en bereid de embryo's vervolgens voor op inbedding door voorzichtig extra PBS aan te zuigen waarin het is opgeslagen. Zorg ervoor dat u de embryo's aan de onderkant niet verstoort en zuig vervolgens de embryoplug aan de onderkant van de oplossing op en plaats deze voorzichtig in een flesdopvorm.

Zuig eventuele extra PBS uit deze mal voordat u 1,2% agarose-gel toevoegt. Bereid een oplossing van PBS voor om deze agarosepluggen op te slaan. Zodra de agarose is gestold, kunnen individuele pluggen vervolgens in deze PBS worden verplaatst voor opslag.

Hier laten we het sequentiële uitdrogingsproces zien. Laat elke keer 15 minuten voor incubatie. Verwijder vervolgens de 100% ethanol en bevestig in een één-op-één oplossing van ethanol en xyleen gedurende nog eens 15 minuten.

Eenmaal verwijderd uit deze één-op-één oplossing, verwijder in zuiver xyleen gedurende één minuut. Nu is het weefselmonster klaar om te worden verplaatst naar een verwarmde één-op-één xyleenparaffine-oplossing. Laat 30 minuten zitten voordat je het definitief insluit in 100% paraffine.

Ga naar de eerste van 100% paraffine en rust twee uur. Herhaal dit proces in zijn twee en drie paraffines. Het monster is nu klaar om in een mal te worden verplaatst en de mal wordt gevuld met was om het inbeddingsproces te voltooien.

Inbedding van Drosophila embryo's. Plaats bereide paraffinesecties van Drosophila-embryo's gedurende 15 minuten in een oven van 60 graden. Plaats ze in een 100% oplossing van xyleen.

We beginnen dan met rehydratatie. Plaats de dia's in elk van deze oplossingen gedurende drie minuten. Zodra de dia in gedestilleerd water is, plaatst u deze gedurende twee minuten in de hematoxyline-oplossing.

Als u klaar bent, zorg er dan voor dat u zoveel mogelijk van de oplossing van de dia aftapt. Zodra de dia in gedestilleerd water is gewassen, bevlekt u de dia gedurende één minuut in eosine. Verwijder ten slotte de dia van de eosine en was in gedestilleerd water.

Zodra deze dia schoon is, beginnen we nu aan ons laatste uitdrogingsproces. Uiteindelijk gedurende vijf minuten in 100% xyleen geplaatst. Dit proces wordt herhaald in twee nieuwe oplossingen van 100% xyleen en laat een kleine hoeveelheid neutrale gom langs een rand van de dia vallen.

Neem deze afdekslip en plaats deze voorzichtig op een rand van de dia. Deparaffineer eerst de dia's door ze in 100% xyleen te plaatsen. Zodra de glaasjes uit gedestilleerd water zijn verwijderd, moeten ze worden bedekt met 1% periodieke zuuroplossing.

Vervolgens gooien we de overtollige oplossing weg en spoelen we in gedestilleerd water. Door de schuif direct in een voorverwarmde oplossing te plaatsen. Zodra dit is voltooid, spoelen we de glaas in gedestilleerd water en kleuren we de oplossing vervolgens gedurende één tot twee minuten met 0,2% goudchloride.

Vervolgens fixeren we het weefsel met 3% natriumthiosulfaat gedurende drie minuten met gedestilleerd water. En dan counteren met hematoxyline. Na het counterstainen kan de vlek worden gewassen met beide buizen gedestilleerd water, zoals hier weergegeven.

Daarna gaan we verder met het uitdrogingsproces. Volg dit door de dia's rechtstreeks in 100% xyleen te plaatsen en vervolgens een kleine hoeveelheid neutrale gom op de hoek van de dia aan te brengen. Dek voorzichtig af met een afdekslip.

Begin met het voorbereiden van de dia's zoals voorheen door te deparaffiniseren en xyleen. En dan in één-op-één xyleenethanol. Zodra de dia's zijn gedeparaffineerd, beginnen we met het rehydrateren van hun weefsel en uiteindelijk in PBS.

Plaats de glaasjes gedurende 10 minuten in 0,3% waterstofperoxide gemaakt in methanol. Vervolgens worden de dia's bedekt met 20 ml doelophaaloplossing. De dia's kunnen vervolgens in de beitsdoos worden geplaatst.

Plaats de spuitdoos in een stomer, zodat er geen oplossing ontsnapt en de dia's nog steeds volledig bedekt zijn. Merk op dat het deksel van de vlekkendoos niet volledig moet worden gesloten, zodat waterdamp kan ontsnappen tijdens het stomen. En dan drie keer zachtjes in PBS-T spoelen.

Gooi de overtollige oplossing weg en herhaal het proces, dit keer met PBS. Vervolgens incuberen we de glaasjes vijf tot 10 minuten in een peroxideblok en spoelen dan nog een paar keer in PBS-T en vervolgens in PBS. Bereid het antilichaam voor en laat het direct op het weefsel vallen.

Deze weefsels kunnen vervolgens vier uur lang worden geïncubeerd of bij kamertemperatuur. Het secundaire antilichaam moet gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur worden geïncubeerd, wat gedurende twee tot 10 minuten kleuring is met 5% DAB. Nadat de juiste kleur is verkregen, spoelt u in gedestilleerd water en countert u vervolgens hematoxyline.

Na deze hematoxylinevlek kunnen de dia's vervolgens achtereenvolgens worden uitgedroogd. Plaats de glaasjes in 100% xyleen en laat drie minuten weken. Laat vervolgens kleine hoeveelheden neutrale kauwgom op een rand van de dia vallen.

Zodra een kauwgom is geplaatst, neemt u de schuifafdekking en plaatst u deze voorzichtig vanaf een rand van de glijbaan. Voeg één microgram gezuiverd gelineariseerd sjabloon-DNA toe aan een steriele RNase-vrije reactieflacon. Voeg vervolgens voldoende steriel RNase-vrij DEPC-behandeld dubbel gedestilleerd water toe om een totaal monstervolume van 13 microliter te maken.

Centrifugeer dan kort en incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Voor RNase-beschermingsexperimenten raden we aan om gedurende 15 minuten te broeden met twee microliter Dnase-1, RNase-vrij om sjabloon-DNA te verwijderen. Zodra de incubatiestap is voltooid, stop de reactie door twee microliter van 0,2 molaire EDTA toe te voegen bij een pH van acht.

Voorafgaand aan de stappenshow hier werden de dia's gedeparaffiniseerd en gerehydrateerd, volgens ons eerder gedemonstreerde protocol. Na rehydratatie incubeer de glaasjes in 0,01 mol per liter PBS bij een pH van 7,4 gedurende vijf minuten elk om de fixatieve oplossing uit het weefsel te verwijderen. Na het spoelen in PBS spoelen we vervolgens twee keer vijf minuten lang met 100 millimolar per liter glycine-oplossing om vrije aldehydegroepen uit het weefsel te verwijderen.

Spoel na deze stap de glijden met PBS gedurende vijf minuten. Incubeer vervolgens in PBS met 0,3% triton X-100 gedurende 15 minuten voorafgaand aan het spoelen en broed vervolgens opnieuw met één microgram per microliter proteïnase K.Vervolgens fixeert u dia's met 4% paraformaldehyde en PBS bij een pH van 7,2 gedurende drie minuten. Was vervolgens de glaasjes voor het broeden met 0,1 molaire triethanolaminebuffer pH 8, die 0,25% azijnzuuranhydride bevat.

U kunt ervoor kiezen om de doos in dit stadium te kantelen om volledige dekking met de oplossing te garanderen. De doos wordt bereid door 20% glycerol of DEPC-water toe te voegen aan de bodem van een droge hybridisatiedoos. Bedek vervolgens de dia's in 20 microliter pre-hybridisatieoplossing.

Het sperma-DNA van zalm in een concentratie van 100 microgram per milliliter aan elke dia. En dan vier uur lang incuberen bij 42 graden Celsius. Dit gebeurt in een voorbereide bevochtigde doos om ervoor te zorgen dat de oplossing tijdens dit proces niet droogt.

In de post-hybridisatiefase is het erg belangrijk dat de hybridisatieoplossing volledig uit uw monsters wordt gespoeld. Dit kan worden gedaan in opeenvolgende spoelingen van 15 minuten bij 37 graden, met behulp van vier keer concentratie SSC, twee keer concentratie één keer concentratie, 0,5 keer concentratie en 0,1 keer concentratie SSC-oplossing. Elk broeden gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.

Nadat dit is gebeurd, wast u drie keer met PBS gedurende vijf minuten voordat u de wasbuffer toevoegt. Wasbuffer moet gedurende één minuut voorafgaand aan de volgende stappen worden gespoeld Zorg ervoor dat de wasbuffer volledig droog is van de dia's voordat u de volgende oplossing toevoegt. Voeg 100 milliliter blokkeringsoplossing toe aan elke dia en incubeer de dia gedurende 30 minuten.

Dit kan het beste in een lichtvrije omgeving om een goede vlek te garanderen. Incubeer vervolgens de dia's opnieuw gedurende 30 minuten in 20 ml antilichaamoplossing. Breng de antilichaamoplossing rechtstreeks op dia's aan voor volledige dekking van uw weefsel.

Zodra de incubatie is voltooid, brengt u 100 milliliter wasbuffer aan. Incubeer gedurende 15 minuten in lichtvrije omstandigheden om ongebonden antilichaamconjugaten te verwijderen. Verwijder de wasbuffer.

Breng vervolgens 20 milliliter detectiebuffer aan en laat ongeveer vier minuten incuberen. Verwijder na vier minuten de detectiebuffer. Droog de glaasjes om geen extra oplossing te garanderen en voeg 10 milliliter vers bereide kleursubstraatoplossing toe.

Deze reactie begint binnen een paar minuten, maar is na 16 uur voltooid. Laat dus voor die periode in een lichte vrije toestand incuberen. Zodra de gewenste plekken waar banden worden gedetecteerd, wast u de dia met 50 milliliter TE-buffer om de reactie te stoppen.

En voltooi vervolgens ons eerder getoonde uitdrogingsproces en montageproces voor neutrale gom. Figuur één en twee demonstreren de chroomaluminiumgelatine coating methode voor paraffine secties en de inbeddingsmethode voor expressieprofiel van FKBP12 en DmFKBP12 bij de ontwikkeling van Drosophila embryo's. Figuur drie toont de eiwitverdeling van antilichaam gedetecteerd FKBP12 in de syncytiele cellulaire blastodermstadia.

Uit deze histochemische resultaten kan worden gezien dat FKBP12-expressie minder gepolariseerd is in het syncytiele blastoderm en vervolgens begint te lokaliseren in het keldermembraan onder het trophectoderm-epitheel informeert de gradiënt met meer expressie in de voorste en achterste polen. Figuur vier, die de vroege en late gasrelatiestadia van het Drosophila-embryo volgt, laat zien dat het FKBP12-eiwit beperkt raakt tot bepaalde architecturale componenten van het primitieve embryonale weefsel. Met minder extracellulaire verdeling dan die waargenomen in vroege en late gastro-embryonale stadia.

Interessant is dat de hierboven beschreven dynamische eiwitverdeling niet gepaard gaat met overeenkomstige veranderingen in MRI-niveaus van FKBP12 zoals te zien in figuur vijf. Dit wijst erop dat eiwitexpressie het resultaat is van een nog onbekend posttransioneel moleculair mechanisme. Ryanodine receptor gemedieerde calcium signalering is een fundamentele route in vele fysiologische en pathologische processen van zowel gewervelde als ongewervelde dieren.

Van mutaties in dit gen is bekend dat ze veel fysiologische stoornissen veroorzaken die leiden tot ziekte of vroege hartdood. De rol die dit gen speelt in de vroege ontwikkeling van Drosophila is echter moeilijk te bestuderen. Als doorvoercomponent van het embryo, lipide-rijk embryo en chitine-rijk chorion, maken studies van eiwit en embryonale expressie in de vroege Drosophila ontwikkeling moeilijk.

De diacoating, embryo-inbedding en immunohistochemische technieken die in dit artikel worden beschreven, hebben ons in staat gesteld om de dynamische verdeling van ryanodinereceptoreceptoreiwit en mRNA in detail te bestuderen. We delen deze technieken en de hoop dat ze anderen in staat zullen stellen om andere eiwitten te bestuderen tijdens vroege ontwikkelingsstadia van Drosophila.