Longitudinale intravitale beeldvorming door heldere siliconenvensters

Deze procedure voor het gieten en inbrengen van siliconen ramen verlaagt de technische barrières voor longitudinale intravitale beeldvorming. Ons protocol produceert stevige, gemakkelijk aanpasbare ramen die goed worden verdragen door de dieren. Met behulp van deze techniek hebben we kanker en immuuncellen in de lever, alvleesklier en borstklier in beeld gebracht.

Met minimale aanpassingen kon het worden aangepast aan vele anatomische locaties en biologische vragen. Voor degenen die deze techniek voor de eerste keer proberen, oefen met het vrijgeven van kleine hoeveelheden lijm uit de spuit. Het aanbrengen van te veel lijm zal het beeldvormingsveld vertroebelen en het operatiegebied moeilijk maken om mee te werken.

Begin met het gieten van het siliconenvenster door een kleine hoeveelheid van het vers bereide siliconenpolymeer, polydimethylsiloxaan, van PDMS, op een schoon glad oppervlak te deponeren en pas de verhouding tussen volume en oppervlakte aan om de gewenste dikte te krijgen. Zodra het PDMS op het gewenste gietoppervlak is afgezet, drukt u lichtjes op een roestvrijstalen rooster in de siliconen om oriëntatiepunten te bieden voor herhaalde beeldvorming van dezelfde weefselgebieden. Om de luchtbellen te verwijderen en het siliconenpolymeer te ontgassen, plaatst u het gecoate oppervlak gedurende 45 minuten in een vacuümsiccator.

Als je klaar bent, laat je het polymeer in een oven uitharden op 75 tot 80 graden Celsius gedurende 45 minuten. Scoor het polymeer aan de randen van de mal en gebruik een tang om de uitgeharde ramen voorzichtig af te pellen van het oppervlak dat wordt gebruikt voor het gieten. Plaats de muis op de linker zijwaartse decubituspositie.

Bereid de verdoofde muis voor op een operatie door 10% volume povidon jodiumoplossing en 70% volume volume ethanol driemaal achter elkaar op de geschoren operatieplaats aan te brengen. Er moet voor worden gezorgd dat een steriel chirurgisch veld wordt onderhouden. Gebruik vervolgens een steriele schaar en tang om een incisie van 10 millimeter te maken op de rechterflank op drie millimeter onder de ribbenboog.

Verwijder een deel van de huid van één vierkante centimeter en gebruik een tweede steriele schaar en tang om een deel van het peritoneum te verwijderen dat iets kleiner is dan het deel van de huid. Deponeer een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op een steriele putplaat en trek deze op met een spuit van 31 gauge om op het oppervlak van de lever rond de randen van het af te beelden gebied aan te brengen, plaats vervolgens het venster op het gewenste gebied en houd het stevig tegen de lever gedurende ongeveer twee minuten totdat de lijm is opgedroogd. Na het vouwen van de randen van het raam onder het peritoneum deponeert u een kleine hoeveelheid van de chirurgische lijm op de randen van het raam die zich nu onder het peritoneum bevinden, drukt u met een tang op het peritoneum om het aan het raam te bevestigen.

Sluit op dezelfde manier het peritoneum af door een kleine hoeveelheid van de chirurgische lijm af te zetten voordat u de huid naar beneden duwt en breng vervolgens lijm aan rond de randen van het venster om een rand te creëren die voorkomt dat de huid teruggroeit over het raam. Om het venster in de alvleesklier in te brengen, plaatst u de muis op de rechter laterale decubituspositie en maakt u de incisie op de linkerflank voordat u een deel van het peritoneum verwijdert zoals eerder is aangetoond. Met behulp van steriele wattenstaafjes gedrenkt in steriele zoutoplossing, trok voorzichtig aan de milt om de alvleesklier te visualiseren.

Verplaats de alvleesklier met de bevochtigde wattenstaafjes om meer oppervlak zichtbaar te maken door de incisie. Zodra de alvleesklier toegankelijk is, plaatst en verzegelt u het beeldvormingsvenster op het gewenste gebied zoals eerder uitgelegd. Om toegang te krijgen tot de borstklier, plaatst u de muis in rugligging en maakt u een mediale incisie van 10 millimeter in een van de lieshalzen met behulp van een steriele schaar en tang.

Verwijder een gedeelte van 0,5 vierkante centimeter van de huid boven de borstklier en scheid vervolgens voorzichtig de borstklier van de huid door de steriele schaar tussen de twee oppervlakken te verspreiden om de hechting te verstoren. Gebruik een spuit van 31 gauge om een kleine hoeveelheid van de chirurgische lijm aan te brengen op het oppervlak van de borstklier rond de randen van het in beeld te brengen gebied. Plaats en houd het raam stevig tegen de borstklier totdat de lijm droogt.

Nadat u de randen van het venster onder de huid hebt gevouwen, deponeert u een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op de randen van het venster die zich nu onder de huid bevinden en drukt u met een tang op de huid om de huid aan het raam te bevestigen. Breng de lijm aan rond de randen van het venster om een rand te creëren die voorkomt dat de huid teruggroeit over het raam. Voordat u aan de beeldvormingssessie begint, reinigt u het raam van achtergebleven vuil door het voorzichtig af te vegen met een wattenstaafje gedompeld in 70% ethanol.

Wanneer u een onderdompelingslens in water gebruikt, brengt u de ultrasone gel aan op het venster om bubbels te vermijden. Om de beeldvorming te starten, lokaliseer en plaats het raster in focus door de oculairen. Bepaal vervolgens de geschatte weefselbeeldvormingsdiepte door de onderkant van het raster op nul te zetten.

De informatie zal helpen bij het lokaliseren van het overeenkomstige Z-vlak in volgende beeldvormingssessies. Als u dezelfde locatie wilt identificeren tijdens meerdere beeldbewerkingssessies, gebruikt u de vierkanten op het raster als referentiepunt. Noteer tijdens de beeldbewerkingssessie de rasteroriëntatie en de locatie van elk gezichtsveld dat binnen het raster wordt afgebeeld.

Het raster kan worden gebruikt om terug te navigeren naar specifieke rastergebieden en beeldvormingsvelden in het succes van beeldvormingssessies. Verwijder na elke opnamesessie het resterende onderdompelingsmedium en vuil van de lens door het raam voorzichtig af te vegen met een wattenstaafje gedompeld in 70% ethanol. Het siliconenvenster maakt het mogelijk om de dynamische infiltratie van immuuncellen in de loop van de tijd vast te leggen.

De representatieve analyse illustreert de neutrofiele infiltratie in het remodellererende borstklierweefsel op dag twee en vier. Het siliconenvenster maakt het mogelijk tumoren op meerdere tijdstippen te visualiseren gedurende weken na het inbrengen van het venster. De ramen gegoten met 200 milligram PDMS zijn over het algemeen beter voor chirurgische implantatie omdat ze een aanzienlijk grotere taaiheid vertoonden dan de ramen gegoten met 150 milligram.

Van belang is dat de PDMS-ramen niet zo stijf waren als standaard glas, vertegenwoordigd door de Modulus van de Young van de glazen ramen die aanzienlijk groter waren dan PDMS. Het inbrengen van het venster in verschillende organen werd goed verdragen omdat de meeste muizen in de loop van de tijd bleven aankomen. Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is om het raam volledig af te dichten met lijm.

Dit voorkomt infectie, het uitdrogen van het weefsel en de verplaatsing van het raam. Na de procedure kunnen orthotopische injecties worden gedaan via het siliconenvenster, waardoor onderzoekers een breed scala aan onderwerpen kunnen bestuderen, zoals celproliferatie, cel-celinteracties en therapeutische werkzaamheid.