Ontwerp-tot-implementatiestudie voor ontwikkeling en patiëntvalidatie van op papier gebaseerde sleufschakelaardiagnostiek

Ons protocol beschrijft het ontwerp, de assemblage en de validatie van op gencircuits gebaseerde diagnostiek. Deze op papier gebaseerde moleculaire diagnostiek is goedkoop en gevoelig, kan klinisch relevante concentraties van nucleïnezuren detecteren en kan worden ontworpen om vrijwel elke sequentie te detecteren. Dit is een platformtechnologie die door gebruikers kan worden ontworpen voor hun behoeften en het potentieel heeft om diagnostiek van klinische kwaliteit in meer gedecentraliseerde tandheelkundige broninstellingen te brengen.

Celvrije toehold-schakelaarsensor kan worden ontworpen voor vrijwel elk doel op basis van nucleïnezuur. Recent werk heeft celvrije diagnostiek aangetoond voor Ebola, norovirus, SARS-CoV-2, C.difficile en tyfus veroorzakende bacteriën. De procedure wordt gedemonstreerd door Severino Jefferson Rivero da Silva, een postdoctorale fellow, en Pouriya Bayat, een promovendus uit mijn laboratorium.

Om de toehold-schakelaar te ontwerpen, identificeert u de doelsequenties uit het Zika-virusgenoom en kiest u de Zika-virusdoelsequenties uit de amplicons zoals beschreven in het tekstprotocol. Download het softwarepakket voor het ontwerpen van de toehold switch. Open MATLAB en navigeer naar de map met ontwerpsoftware.

Voer de doelreeksen in het csv-bestand van het ontwerpinvoerbestand in de invoersubmap in. Selecteer de parameters die u wilt gebruiken voor de ontwerpfunctie. Voer de ontwerpfunctie uit om de teengreepschakelaarontwerpen te genereren voor de interessante doelen.

Navigeer na voltooiing naar de map final_designs en zoek de ontwerpreeksen van de bovenste toehold-schakelaar en de bijbehorende doelreeksen in spreadsheets in csv-indeling. Zorg ervoor dat de door het algoritme gegenereerde DNA-sequenties van de toehold switch de T7-promotorsequenties aan het vijf priemeinde en een geconserveerde 21 nucleotide-linkersequentie aan het drie priemeinde bevatten. Gebruik NCBI BLAST om de ontwerpsequenties van de bovenste teengreepschakelaar te screenen tegen andere veel voorkomende virussen door te controleren op sequentie homologie.

Accepteer sequenties met minder dan 40% hemologie. Bereid oplossingen van de teengreepschakelaar haarspeld DNA-oligo's en omgekeerde amplificatieprimers in een concentratie van 10 micromolair in nucleasevrij water. Monteer reacties in PCR-buizen op ijs volgens deze tabel.

Plaats de reactiebuizen in een thermocycler, volgens de in deze tabel vermelde cyclusomstandigheden. Analyseer de PCR-producten op een agarose-gel. Zuiver de PCR-producten en elueerde het DNA in een minimaal volume nucleasevrij water om een voldoende hoge concentratie te garanderen.

Kwantificeer het DNA met behulp van een spectrofotometer. Bereid een CPRG-stamoplossing door 25 milligram van het poeder op te lossen in één milliliter nucleasevrij water. Bereid een mastermix op ijs volgens het hier getoonde standaardprotocol.

Doseer de celvrije mastermix in PCR-buizen. Voor celvrije bedieningselementen en schakelbedieningen alleen, voegt u nucleasevrij water toe aan een volume van 5,94 microliter. En voeg voor de reactie PCR-gezuiverd teenschakelaar-DNA toe om een uiteindelijke concentratie van 33 nanomolair te krijgen.

Om de toehold switch en target RNA combinatie te testen, voeg je in vitro getranscribeerd target RNA toe aan een uiteindelijke concentratie van één micromolair. Meng alle reacties grondig door te pipetteren en kort te centrifugeren. Voeg op een zwart heldere bodemplaat met 384 putten 30 microliter nucleasevrij water toe aan de putten rond de reactieputten.

Snijd vervolgens met behulp van een biopsiepons en pincet van twee millimeter BSA geblokkeerde filterpapierschijven en plaats ze in de reactieputten. Doseer 1,8 microliter van elke reactiebuis op de filtreerpapierschijven in de 384-putplaat in drievoud. Bedek de plaat met doorzichtige PCR-film en plaats deze in een platenlezer.

Meet de absorptie op 570 nanometer bij 37 graden Celsius elke minuut gedurende 130 minuten. Bereid een 25 micromolaire stockoplossing van alle voorwaartse en omgekeerde primersets in nucleasevrij water. Stel een reactie van vijf microliter in met behulp van de hier getoonde mastermix.

Meng door te pipetteren totdat het witte neerslag oplost en doseer vervolgens in PCR-buizen. Voeg de voorste en omgekeerde primers toe aan de juiste buizen, gevolgd door het toevoegen van een microliter nucleasevrij water of twee picomolar van target trigger RNA. Meng door zachtjes te pipetteren en draai kort door de buizen.

Stel het incubatieprotocol in op een thermocycler zoals hier weergegeven. Verwijder na 12 minuten de buisjes en voeg 1,25 microliter van het enzymmengsel toe aan elke buis, gevolgd door mengen en centrifugatie. Breng de buizen terug naar de thermocycler na het overslaan van de 41 graden Celsius hold-stap om de reactie-incubatie van een uur te starten.

Om vervolgens de primerprestaties te beoordelen, stelt u de op papier gebaseerde celvrije toehold-switchreacties samen en analyseert u de gegevens. Identificeer voor gevoeligheidsanalyse kandidaat-primerparen en bereid seriële verdunningen van doel-RNA voor in nucleasevrij water. Herhaal de NASBA en celvrije reacties met de geselecteerde primersets in biologische triplicaten.

Voer met behulp van één microliter geëxtraheerd patiënt-RNA de NASBA-amplificatie en op papier gebaseerde celvrije reacties uit zoals weergegeven in rubriek vijf. Na de reacties bereidt u de 384-well reactieplaat voor en voert u de test uit in een draagbare plaatlezer bij 37 graden Celsius. Monteer vervolgens de RT-qPCR-componenten en voeg de reagentia toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter volgens deze tabel.

Meng de reactie door te pipetteren. Doseer 6,5 microliter in elke put van een 96-well of 384-well PCR-plaat, gevolgd door 3,5 microliter van elke RNA-sjabloon in triplicaat. Plaats een PCR-film over de bovenkant van de plaat.

Centrifugeer de 384-putplaat op 600 maal G gedurende twee minuten. Plaats de plaat in een RT-qPCR-machine en voer de fietsomstandigheden uit zoals hier afgebeeld. Volgens het computationele ontwerp werden drie toehold-schakelaars geconstrueerd en geanalyseerd met behulp van agarose gel-elektroforese.

Een band rond de 3.000 basenparen duidde op een succesvolle reactie. De grijpschakelaars werden beoordeeld aan de hand van hun respectievelijke in vitro getranscribeerde trigger-RNA. Terwijl alle drie de sensoren een toename van de absorptie vertoonden, had sensor 27B de snelste snelheid, terwijl schakelaars 33B en 47B een lagere aan / uit-verhouding hadden die achtergrondactiviteit en verminderde specificiteit aangaf.

De vouwverandering van absorptie op 570 nanometer toonde aan dat schakelaar 27B de beste prestaties heeft met een aan/ uit-signaalverhouding. Bovendien kan het in combinatie met NASBA RNA detecteren bij concentraties zo laag als 124 moleculen per microliter, wat wijst op een hoge gevoeligheid. Monsters van Zika-viruspatiënten uit Brazilië werden getest om de klinische diagnostische nauwkeurigheid van de sensoren te beoordelen met behulp van een draagbare plaatlezer.

Een kleurverandering van geel naar paars identificeerde een positief monster. De colorimetrische respons voor elke op papier gebaseerde reactie werd in de loop van de tijd uitgezet door de geïntegreerde software op de PLUM draagbare plaatlezer. De monsters die de drempel overschreden, werden als positief beschouwd.

De klinische prestaties van de sensor werden vastgesteld in vergelijking met RT-qPCR. De monsters werden als positief beschouwd wanneer de cyclusdrempelwaarde gelijk was aan of lager was dan 38. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de resultaten van toehold-schakelschermen en NASBA-primergevoeligheid reproduceerbaar en geoptimaliseerd zijn voordat u verder gaat met patiëntenproeven.

Gezien de eenvoud en het aanpassingsvermogen heeft het hier beschreven diagnostische platform de weg vrijgemaakt voor de ontwikkeling van nieuwe point-of-care-hulpmiddelen die voordelen kunnen opleveren voor het gezondheidssysteem, vooral voor lage-inkomenslanden.