Implementatie van minimaal invasieve hersentumorresectie bij knaagdieren voor weefselverzameling met hoge levensvatbaarheid

Dit is een hersentumorresectieparadigma dat hard nodig is in preklinisch onderzoek naar therapieën voor hersentumoren. Het maakt een gestandaardiseerde resectie mogelijk door middel van een minimaal invasieve aanpak, terwijl het tegelijkertijd ook is gekoppeld aan een geautomatiseerd weefselconserveringssysteem. Dit protocol stelt het dier in staat om te overleven na een operatie en helpt dus bij het begrijpen van de veranderingen in de ziektetoestand na therapie bij hetzelfde dier.

Dit helpt bij sequentiële en time-lapse therapeutische toepassingen. Met behulp van deze techniek kunnen we de biologie van de ziekte evalueren en plannen maken voor mogelijk vervolgbeheer. Dit heeft belangrijke implicaties en kansen bij het ontdekken van geneesmiddelen en nieuwe therapieën.

De concepten van gestandaardiseerde resectie, een minimaal invasieve aanpak en geautomatiseerd weefselbehoud kunnen worden uitgebreid naar andere soorten tumoren in verschillende orgaansystemen, zoals levertumoren en hoofd-halskankers. Het protocol is eenvoudig en het systeem is gebruiksvriendelijk. Het is het beste om het gepubliceerde protocol te lezen, dat alle noodzakelijke stappen en probleemoplossing bevat.

Begin het experiment door de muis te beoordelen op sedatie door in de teen te knijpen. Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Plaats de muis vervolgens op een stereotactisch frame.

Verwijder het nietje van de vorige operatie en desinfecteer de huid met afwisselende cycli van een scrub op basis van chloorhexidine of betaïne en alcohol. Maak vervolgens een longitudinale middellijnincisie van één centimeter langs het vorige chirurgische litteken met behulp van een steriel scalpel. Bevestig het MIRS-handstuk aan de stereotactische arm via de podiumadapter.

Om de MIRS-machine in te stellen, plaatst u het netsnoer op het achterpaneel in het netsnoerrecipiënt. Schakel de stroom naar het systeem in of uit door te schakelen tussen nul en één. Steek het ene uiteinde van de stikstofslang in de mannelijke fitting op het achterpaneel van de console.

Draai de verbindingsmoer met de klok mee om deze vast te draaien. Zorg ervoor dat de toevoerdruk niet hoger is dan 100 PSIG en bevestig de slang aan de stikstoftoevoer. Sluit het deksel van de vacuümpoort af om lekkage te voorkomen.

Controleer of de aspiratieknop aan de voorkant van de console is ingesteld op 100, of er geen lekkage is in het afzuigsysteem en of de toevoerdruk van de stikstofinvoer correct is. Steek de grijze voetpedaalconnector in de grijze houder totdat deze klikt. Steek op dezelfde manier de blauwe handstukconnector in de blauwe houder.

Primeer elk handstuk door steriele vloeistof in de opening te zuigen via de buis en het handstuk en vervolgens in de bus om ervoor te zorgen dat de binnenkant van de buis en het handstuk worden gesmeerd. Selecteer de modus voor aspiratie op het voorpaneel van de console en begin met het voetpedaal. Steek de 23-G MIRS canule in het braamgat tot een diepte van 2,5 millimeter.

Start het resectieproces door op het voetpedaal te drukken dat is aangesloten op de canule. Voer volledige resectiecycli uit met behulp van de bedieningsknop in het handstuk. Trek na het resectieproces de 23-gauge MIRS-canule op en voeg vijf milliliter 1X PBS toe om de slang te spoelen en eventuele resterende restresten los te maken.

Sluit vervolgens de wond met een nietmachine en verwijder de muis uit het stereotactische frame. Breng de muis terug naar het verwarmingskussen om te herstellen van de anesthesie voordat u hem terug in de kooi plaatst. Na het experiment reinigt u de canule met gekoelde media en lucht om al het gereseceerde weefsel terug te duwen naar de opvangbus.

Verwijder de opvangbus uit het systeem en plaats een dop. Plaats vervolgens de distale punt van de canule in 3% waterstofperoxide en zuigkracht toe om de zuigleiding terug naar de zuigbus te vullen. Laat het 60 tot 90 seconden staan en pulseer met tussenpozen lucht en media om het te spoelen.

Dompel het tumormonster onder in een weefselkweekschaal met RBC-lysismedium gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens een filter van 70 micron op een conische buis van 50 milliliter en gebruik een spuitzuiger om het tumormonster door het filter te leiden. Gebruik met een transferpipet de RPMI 1640-media om de cellen en eventuele weefselmassa door het filter te leiden.

Centrifugeer op 428 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en resuspenseer elk monster in vijf milliliter bereid RPMI 1640 medium. Plaats de monsters in een shaker incubator gedurende 20 minuten bij 200 RPM bij 37 graden Celsius.

Na incubatie centrifugeer je de monsters op 428 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi je het supernatant weg. Filter enkele cellen door een celzeef van 70 micron en centrifugeer op 274 maal G gedurende drie minuten bij vier graden Celsius. Voer een analyse van de levensvatbaarheid van cellen uit met trypan blue en een hemocytometer.

Chirurgische resectie bij muizen die MIRS gebruikten, veroorzaakte een significante afname van de tumorlast, zoals aangegeven door de vermindering van het gemiddelde baseline bioluminescente signaal voor groepen met zowel grote als kleine tumorbelasting. Vergeleken met de pre-resectie MRI-beelden van tumoren, kan de resectieholte op de post-resectiescans worden geïdentificeerd als een groot, rond hypointense-gebied op de tumorinentingsplaats. In H &E-gekleurde secties werd een duidelijke cirkelvormige resectieholte met een rand van bloedproducten, ontsteking en resterende tumorcellen waargenomen.

Het resectievolume nam aanzienlijk toe wanneer twee rotaties van de snijopening werden uitgevoerd, waardoor het resectievolume per tumorlast kon worden geoptimaliseerd. Vergelijking van overleving bij muizen met onbehandelde tumoren versus muizen die resectie van tumoren door MIRS ondergingen, toonde een toename van de overleving van 16 tot 22 dagen in de kleine tumorgroep. Evenzo nam in de groep met een grotere tumorlast de mediane overleving toe van 12 tot 19 dagen.

Lichtmicroscopiebeelden van de monsters uit het weefselconserveringssysteem verschenen als afzonderlijke cellen met de aanwezigheid van een paar kleine stukjes weefsel op dag nul. Na zeven dagen vertoonden de cellen geoogst met MIRS neurosfeervorming in suspensieculturen, wat hun tumorinitiatiepotentieel aangaf. Het is belangrijk om het slangsysteem direct na de procedure te zuiveren en door te spoelen om verstopping van het systeem te voorkomen.

Na deze procedure kunnen werkzaamheidsstudies van therapeutica en studies naar diagnostische en prognostische markers worden gebruikt bij overlevende dieren na chirurgische resectie met het minimaal invasieve resectiesysteem.