Name: Genbewerking van primaire resusapen B-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Leer genbewerking van primaire resusapen B-cellen met CRISPR/Cas9 en rAAV6 voor preklinisch onderzoek naar B-celtherapieën. Deze methode is efficiënt en aanpasbaar voor andere celtypen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Harry B. Gristick en Pamela Bjorkman bedanken voor het leveren van het RC1-antigeen en de hele Nussenzweig- en Martin-laboratoria voor kritische discussie. Dit werk werd ondersteund door de Bill and Melinda Gates Foundation-subsidie INV-002777 (aan M.C.N.) en het Intramurale Onderzoeksprogramma van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. (R.G. en M.A.M). M.C.N. is een HHMI-onderzoeker.

<ol><li>Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal centers.</a> Annual Review of Immunology. 40, 413-442 (2022).</li>
<li>Plotkin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+protection+induced+by+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Correlates of protection induced by vaccination.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 17 (7), 1055-1065 (2010).</li>
<li>Brinkmann, V., Heusser, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+differentiation+of+human+B+cells+into+IgM%2C+IgG%2C+IgA%2C+or+IgE+plasma+cells%3A+High+rate+of+antibody+production+by+IgE+plasma+cells%2C+but+limited+clonal+expansion+of+IgE+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent differentiation of human B cells into IgM, IgG, IgA, or IgE plasma cells: High rate of antibody production by IgE plasma cells, but limited clonal expansion of IgE precursors.</a> Cellular Immunology. 152 (2), 323-332 (1993).</li>
<li>Chernecky, C. C., Berger, B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChernecky%2C+CC+%22Protein+Electrophoresis+-+Serum.%2C+6th+edition%22">Protein Electrophoresis - Serum., 6th edition</a>. , Elsevier Saunders. St Louis, MO. 917-920 (2013).</li>
<li>Balazs, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+protection+against+HIV+infection+by+vectored+immunoprophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis.</a> Nature. 481 (7379), 81-84 (2011).</li>
<li>Greiner, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+editing+of+the+B+cell+receptor+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated editing of the B cell receptor in primary human B cells.</a> iScience. 12, 369-378 (2019).</li>
<li>Hartweger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+humoral+immune+responses+by+CRISPR%2FCas9-edited+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1301-1310 (2019).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+elicitation+of+HIV+broadly+neutralizing+antibodies+from+engineered+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Vaccine elicitation of HIV broadly neutralizing antibodies from engineered B cells.</a> Nature Communications. 11, 5850(2020).</li>
<li>Jeske, A. M., Boucher, P., Curiel, D. T., Voss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+strategies+to+actualize+B+cell-based+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Vector strategies to actualize B cell-based gene therapies.</a> Journal of Immunology. 207 (3), 755-764 (2021).</li>
<li>Nahmad, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+engineered+B+cells+secrete+high+titers+of+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibodies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1241-1249 (2022).</li>
<li>Nahmad, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+B+cells+expressing+an+anti-HIV+antibody+enable+memory+retention%2C+isotype+switching+and+clonal+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineered B cells expressing an anti-HIV antibody enable memory retention, isotype switching and clonal expansion.</a> Nature Communications. 11, 5851(2020).</li>
<li>Voss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+antigen+specificity+of+B+cells+using+genome-editing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the antigen specificity of B cells using genome-editing technologies.</a> eLife. 8, 42995(2019).</li>
<li>Pesch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+design%2C+optimization%2C+and+genomic+integration+of+chimeric+B+cell+receptors+in+murine+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular design, optimization, and genomic integration of chimeric B cell receptors in murine B cells.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2630(2019).</li>
<li>Cheong, T. C., Compagno, M., Chiarle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+of+mouse+and+human+immunoglobulin+genes+by+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 7, 10934(2016).</li>
<li>Rogers, G. L., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+edited+B+cells%3A+A+new+frontier+in+immune+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genome edited B cells: A new frontier in immune cell therapies.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3192-3204 (2021).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li>
<li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR%2FCas9+targeted+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144(2018).</li>
<li>Wu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+primary+human+B+cells+with+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).</li>
<li>Luo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+alpha-PD-1+antibody-expressing+long-lived+plasma+cells+by+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+gene+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration.</a> Cell Death and Disease. 11 (11), 973(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+of+primary+human+B+cells+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61855(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., Johnson, M. J., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering+of+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of primary human B cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2115, 435-444 (2020).</li>
<li>Moffett, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+engineered+to+express+pathogen-specific+antibodies+protect+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li>
<li>Hartweger, H., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+comes+a-knock-in+to+reprogram+antibodies+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR comes a-knock-in to reprogram antibodies in vivo.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1183-1184 (2022).</li>
<li>Nishimura, Y., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice%2C+macaques%2C+and+men%3A+Broadly+neutralizing+antibody+immunotherapy+for+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Of mice, macaques, and men: Broadly neutralizing antibody immunotherapy for HIV-1.</a> Cell Host & Microbe. 22 (2), 207-216 (2017).</li>
<li>Shedlock, D. J., Silvestri, G., Weiner, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monkeying+around+with+HIV+vaccines%3A+Using+rhesus+macaques+to+define+%27gatekeepers%27+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monkeying around with HIV vaccines: Using rhesus macaques to define 'gatekeepers' for clinical trials.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (10), 717-728 (2009).</li>
<li>Kreuser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+methods+for+generation+and+expansion+of%2C+and+gene+delivery+to+rhesus+macaque+plasma+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient methods for generation and expansion of, and gene delivery to rhesus macaque plasma B cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Gujer, C., Sundling, C., Seder, R. A., Karlsson Hedestam, G. B., Lore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rhesus+plasmacytoid+dendritic+cell+and+B-cell+responses+to+Toll-like+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human and rhesus plasmacytoid dendritic cell and B-cell responses to Toll-like receptor stimulation.</a> Immunology. 134 (3), 257-269 (2011).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+enrichment-free+massive+ex-vivo+expansion+of+peripheral+CD20%28%2B%29+B+cells+via+CD40-CD40L+signals+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell enrichment-free massive ex-vivo expansion of peripheral CD20(+) B cells via CD40-CD40L signals in non-human primates.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 473 (1), 92-98 (2016).</li>
<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-attenuating+adenovirus+enables+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+for+high+manufacturing+yield+without+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-attenuating adenovirus enables production of recombinant adeno-associated virus for high manufacturing yield without contamination.</a> Nature Communications. 13, 1182(2022).</li>
<li>Endo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+clinical+outcomes+in+rhesus+monkeys+inoculated+with+a+highly+pathogenic+chimeric+simian%2Fhuman+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term clinical outcomes in rhesus monkeys inoculated with a highly pathogenic chimeric simian/human immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6935-6945 (2000).</li>
<li>Balaphas, A., Buchs, N. C., Meyer, J., Hagen, M. E., Morel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+splenectomy+in+the+era+of+minimally+invasive+surgery%3A+The+current+laparoscopic+and+robotic+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Endoscopy%22%5BJournal%5D)">Partial splenectomy in the era of minimally invasive surgery: The current laparoscopic and robotic experiences.</a> Surgical Endoscopy. 29 (12), 3618-3627 (2015).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+Expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+cesium+chloride-+and+iodixanol-based+purification+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+preclinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simplified+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus.</a> Journal of Virological Methods. 183 (2), 139-146 (2012).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> The CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12, 686(2021).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+neutralizing+macaque+monoclonal+antibody+against+the+HIV-1+V3-Glycan+patch%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A broadly neutralizing macaque monoclonal antibody against the HIV-1 V3-Glycan patch.</a> eLife. 9, 61991(2020).</li>
<li>Escolano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+expands+B+cells+specific+to+HIV-1+V3+glycan+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques.</a> Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).</li>
<li>Pathiraja, V., Matar, A. J., Gusha, A., Huang, C. A., Duran-Struuck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukapheresis+protocol+for+nonhuman+primates+weighing+less+than+10+kg%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Leukapheresis protocol for nonhuman primates weighing less than 10 kg.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 70-77 (2013).</li>
<li>Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+increases+efficiency+of+genome+editing+at+two+non-coding+loci%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci.</a> PLoS One. 13 (6), 0198637(2018).</li>
</ol>

Er worden geen tegenstrijdige belangen aangegeven.

De hier gepresenteerde protocollen bieden een snelle en efficiënte methode om hoge opbrengsten en titers van rAAV6's als HDRT's te genereren en nieuwe methoden om primaire resusaken B-cellen in vitro efficiënt te bewerken.
Het rAAV6-productieprotocol is relatief eenvoudig en snel, waardoor de productie en het testen van veel verschillende constructies tegelijkertijd zonder overmatige arbeid mogelijk is. Indien gewenst kan rAAV6 verder worden gezuiverd met behulp van gevestigde protocollen zoals iodixanol gradiënt ultracentrifugatie34 of waterige tweefasige partitionering35 vóór bufferuitwisseling en concentratie.
Hoewel het de totale opbrengst verminderde, kozen we ervoor om alleen serumgereduceerd celkweekmedium te gebruiken voor de rAAV6-zuivering in plaats van zuivering uit de celpellet, omdat het grootste deel van rAAV6 wordt vrijgegeven in het medium36, en zuivering van de celpellet voegt meer kosten en arbeid toe. Het gebruik van de zelfinactiverende adenovirale helper verhoogde de opbrengsten gemiddeld 30-40-voudig, waardoor het testen van constructies verpakt in AAV6 in een enkele schaal van 15 cm mogelijk was. Hoewel onze zuiveringsmethode eenvoudig is, verkrijgen we met deze methode relatief weinig batch-to-batch variatie in genbewerkingsefficiëntie of levensvatbaarheid van cellen na transductie met behulp van verschillende cellijnen of andere primaire cellen (gegevens niet getoond).
We ontwikkelden een resusapen B-celzuiveringsprotocol om onaangeroerde primaire B-cellen te verkrijgen met behulp van de negatieve uitputting van ongewenste populaties. Hoewel het niet nodig is voor het bewerken van deze cellen, biedt het een manier om een relatief zuivere populatie van primaire resusapen B-cellen te verkrijgen voor deze of andere toepassingen als andere celtypen de experimentele doelen verstoren. Zuiverheid gaat echter ten koste van verminderde totale B-celopbrengsten. Met name voor zowel de verrijkte als de niet-verrijkte B-celculturen is de fractie van B-cellen in de initiële PBMC- of splenocytenpreparaten cruciaal. Voor PBMC's in het bijzonder raden we aan om verschillende makaken te screenen op personen met een hoog percentage B-cellen in perifeer bloed om hoge aantallen B-cellen te verkrijgen voor experimenten, omdat deze waarde dramatisch kan verschillen tussen personen27. PBMC's kunnen worden verkregen door regelmatige bloedingen of leukaferese42.
Het genbewerkingsprotocol leidt tot efficiënte genbewerking, meestal tussen 60% -80% van de knock-out en 5% -20% van de knock-in B-cellen, hoewel we tot 90% BCR knock-out en 40% BCR knock-in B-cellen hebben bereikt (figuur 5 en figuur 6).
De belangrijkste parameters voor de efficiënte bewerking van resusapen B-cellen zijn de snij-efficiëntie van het sgRNA, de elektroporatieparameters, de MOI en de kwaliteit van het rAAV6-preparaat. De snij-efficiëntie van kandidaat-sgRNA's moet empirisch worden bepaald om optimale bewerking en ontwerp van de HDRT mogelijk te maken. De hier gepresenteerde elektroporatieparameters balanceren efficiëntie met levensvatbaarheid om het maximale totale aantal bewerkte B-cellen te verkrijgen in plaats van het hoogste percentage bewerkte B-cellen. Als een hoger percentage bewerkte cellen nodig is, worden verhoogde spanningen (tot 1.750 V) of veranderde pulslengtes (10-30 ms) aanbevolen, hoewel meer celdood kan worden waargenomen. We merkten ook iets hogere bewerkingsefficiënties op in milt B-cellen in vergelijking met B-cellen van PBMC's van dezelfde persoon (figuur 5); De onderliggende reden hiervoor is echter momenteel onbekend.
We ontdekten dat de toevoeging van 1% DMSO na elektroporatie de genbewerkingsefficiëntie aanzienlijk verhoogde met ~ 40% in resusapen B-cellen zonder de levensvatbaarheid van de cel te beïnvloeden (figuur 6A-C), in overeenstemming met rapporten in andere cellen43. Uitgebreide kweek in 1% DMSO moet echter worden vermeden en kan de levensvatbaarheid van cellen beïnvloeden. DMSO kan desgewenst volledig worden weggelaten.
De kweek van de cellen in een klein volume na elektroporatie gedurende enkele uren samen met de rAAV6 leidt tot hogere bewerkingsefficiënties, waarschijnlijk als gevolg van de betere transductie van HDRT door de rAAV6 en dus de hogere intracellulaire concentratie van HDRT op het relevante moment waarop Cas9 actief is. We ontdekten dat het op deze manier kweken van de cellen gedurende maximaal 8 uur de levensvatbaarheid van de cel niet beïnvloedde, maar de bewerkingsefficiëntie nam niet dramatisch toe na 5 uur (figuur 6). Als alleen knock-out in plaats van knock-in vereist is, kan deze stap worden weggelaten.
Tot slot presenteren we uitgebreide protocollen voor de genbewerking van resusapen B-cellen in vitro en de productie van rAAV6 HDRT die nodig is voor de efficiënte knock-in van gewenste constructies. Deze protocollen maken het snel, kosteneffectief testen van vele constructies verpakt als rAAV6 mogelijk en maken het preklinisch testen van de haalbaarheid en schaalbaarheid van B-celtherapieën mogelijk in een relevanter niet-menselijk primatenmodel.

B-cellen zijn de basis van humorale immuniteit. Na activering door cognaat antigeen en secundaire signalen geven naïeve B-cellen aanleiding tot kiemcentrum B-cellen, geheugen B-cellen en plasmacellen1. Dit laatste is de bron van de uitgescheiden antilichamen die de beschermende functies van de meeste momenteel beschikbare vaccins bemiddelen2. Plasmacellen zijn beschreven als antilichaamfabrieken omdat ze enorme hoeveelheden antilichamen afscheiden in het serum - ongeveer 2 ng / dag / cel3, wat neerkomt op 7-16 g / L serum, waardoor antilichamen een van de drie meest voorkomende eiwitten in serum4 zijn. B-cellen zijn rijk aan bloed en kunnen dus gemakkelijk worden verkregen en teruggegeven aan een individu.
Deze eigenschappen hebben B-cellen tot een doelwit gemaakt van celtherapie-inspanningen om de B-celreceptor (BCR) te gen-bewerken en breed neutraliserende antilichamen (bNAbs) tot expressie te brengen tegen het humaan immunodeficiëntievirus (HIV)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 en andere eiwitten 16, 17,18,19,20,21. Dergelijke benaderingen hebben potentieel aangetoond in talrijke muisstudies in vivo 7,8,10,11,16,22. Er moeten echter nog verschillende hindernissen worden overwonnen voor klinische vertaling 9,15,23, waaronder veiligheid, duur en omvang van de therapeutische werkzaamheid, evenals schaalvergroting naar grotere dieren zoals niet-menselijke primaten (NHP's). NHP's, en in het bijzonder resusapen, die een lange geschiedenis hebben in antilichaam- en HIV-onderzoek24,25, zijn inderdaad het meest geschikte model om deze parameters te testen.
Hier hebben we protocollen ontwikkeld waarmee deze problemen kunnen worden aangepakt. Tot op heden hebben weinig studies geprobeerd om resusapen B-cellen ex vivo te kweken, en alleen positieve selectie met behulp van CD20 is gemeld voor de zuivering van resusapen B-cellen26,27,28. We hebben een protocol opgesteld voor de isolatie van onaangeroerde resusapen B-cellen door de negatieve uitputting van andere celtypen. Verder worden kweekcondities gedefinieerd voor de gerichte genbewerking van resusapen B-cellen. Dit protocol schetst het gebruik van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteïnen (RNP's) en recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 6 (rAAV6) als homologie-gerichte reparatiesjabloon (HDRT) om gekweekte resusaken B-cellen te bewerken voor genbewerking. Met behulp van dit protocol werden bewerkingsefficiënties tot 40% bereikt met grote (~ 1,5 kb) inserts. We presenteren ook een snelle en kosteneffectieve methode om rAAV6 te produceren met behulp van een tetracycline-enabled, zelf-uitschakelende adenovirale helper29 om het snel testen van HDRT's in dit formaat mogelijk te maken. Gecombineerd beschrijven deze protocollen een efficiënte workflow voor de genbewerking van resusapen B-cellen (figuur 1), waardoor de evaluatie van B-celtherapieën in een NHP-model mogelijk wordt.
Om de experimenten te starten, kan donormateriaal worden besteld bij commerciële bronnen of worden verkregen door flebotomieën of splenectomie. In deze studie werden de flebotomieën en bloedafnames uitgevoerd zoals eerder beschreven30 met behulp van het antistollingsmiddel EDTA. Om milt, primaire resusapen B-cellen, werden gedeeltelijke (25% -50%) of totale splenectomieën te verkrijgen met behulp van eerder gerapporteerde technieken31. De dieren werden een nacht voor de operatie gevast. Kortom, tijdens de operatie werd de buik geknipt en drie keer bereid met afwisselend scrubs van chloorhexidine en 70% isopropylalcohol. Een incisie (5-10 cm) werd gemaakt in de buik om de milt te identificeren en te isoleren. De vasculatuur van de milt werd geligeerd met hechtingen of vaatklemmen. De incisie werd in twee lagen gesloten met 4-0 PDS polydioxanon-hechtingen. Splenectomie werd een enkele keer uitgevoerd voor een individueel dier. Eencellige suspensies werden bereid uit makakenmilten door maceratie door celzeven. Mononucleaire cellen uit bloed en miltcelsuspensies werden bereid met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie en opgeslagen in vloeibare stikstof.

```html
<table>
 <tbody>
 <tr>
 <td>1.5 mL tube steriele, Dnase, Rnase en purogen vrij</td>
 <td>Stellar Scientific</td>
 <td>T17-125</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mL serologische pipet, polystyreen, steriele, non-pyrogeen, DNase-/RNase-vrij, en Human DNA-vrij</td>
 <td>Corning</td>
 <td>4488</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 cm weefselkweekschaal</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>353025</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 mL polypropyleen conische buis</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>352097</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 mL serologische pipet, polystyreen, steriele, non-pyrogeen, DNase-/RNase-vrij, en Human DNA-vrij</td>
 <td>Corning</td>
 <td>4489</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 mL polypropyleen conische buis</td>
 <td>Corning</td>
 <td>430776</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>293AAV cellijn</td>
 <td>Cell Biolabs</td>
 <td>AAV-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-B-mercapto-ethanol, 55mM (1000x)</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21985-023</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>48-well weefselkweekplaat</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3548</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 mL serologische pipet, polystyreen, steriele, non-pyrogeen, DNase-/RNase-vrij, en Human DNA-vrij</td>
 <td>Corning</td>
 <td>4487</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 mL spuiten met Luer-Lok Tip</td>
 <td>BD</td>
 <td>309646</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 mL polypropyleen conische buis</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 mL serologische pipet, polystyreen, steriele, non-pyrogeen, DNase-/RNase-vrij, en Human DNA-vrij</td>
 <td>Corning</td>
 <td>4490</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well weefselkweekplaat</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>353046</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AAV-6 Verpakkingssysteem (plasmiden)</td>
 <td>Cell Biolabs</td>
 <td>VPK-406</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AAV6 Referentiematerialen (volledige capsiden)</td>
 <td>Charles River</td>
 <td>RS-AAV6-FL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Accu-jet S Pipet Controller</td>
 <td>Brand</td>
 <td>26350</td>
 <td>of vergelijkbare pipet controller</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibioticum/Antimycoticum 100x</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15260-062</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human CD14 AlexaFluor647</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>301812</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human CD14 biotin</td>
 <td>BioLegend</td>
 <td>301826</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human CD16 AlexaFluor700</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>557920</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human CD16 biotin</td>
 <td>BioLegend</td>
 <td>302004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human CD20 PECy7</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>302312</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human CD3 biotin</td>
 <td>Thermo Fisher</td>
 <td>APS0309</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human CD3 PE</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>552127</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human CD33 biotin</td>
 <td>Miltenyi</td>
 <td>130-113-347</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human CD64 biotin</td>
 <td>BioLegend</td>
 <td>305004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human CD66 biotin</td>
 <td>Miltenyi</td>
 <td>130-100-143</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human CD89 biotin</td>
 <td>BioLegend</td>
 <td>354112</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human CD8a biotin</td>
 <td>BioLegend</td>
 <td>301004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human HLA-DR BV605</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>307640</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human Ig lichte keten lambda APC</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>316610</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-human IgM BV421</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>314516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-Human Kappa Lichte Keten FITC</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>A18854</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Autoclaaf</td>
 <td>Steris</td>
 <td>Amsco Lab 250</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Celcultuur CO2 incubator</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>51026331</td>
 <td>of vergelijkbaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifugele Filter Unit (Amicon Ultra - 4, 100 kDa)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC810024</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge 5920 R</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>EP022628188</td>
 <td>of andere, koelbare schommelbakcentrifuge met inzetstukken voor 96-well platen, 15, 50 en 250 mL buizen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>C298SK-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cpg ODN</td>
 <td>Invivogen</td>
 <td>tlrl-2395</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34869-500ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM, Hoge Glucose</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11965092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNaseI (RNase-vrij)</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0303L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS, geen calcium, geen magnesium</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14190144</td>

genbewerking van primaire resusapen b-cellen

Gene Editing of Primary Rhesus Macaque B Cells

B-cellen en hun nakomelingen zijn de bronnen van sterk tot expressie gebrachte antilichamen. Hun hoge eiwitexpressiemogelijkheden samen met hun overvloed, gemakkelijke toegankelijkheid via perifeer bloed en ontvankelijkheid voor eenvoudige adoptieve overdrachten hebben hen een aantrekkelijk doelwit gemaakt voor genbewerkingsbenaderingen om recombinante antilichamen of andere therapeutische eiwitten tot expressie te brengen. De genbewerking van primaire B-cellen van muizen en mensen is efficiënt en muismodellen voor in vivo studies zijn veelbelovend gebleken, maar haalbaarheid en schaalbaarheid voor grotere diermodellen zijn tot nu toe niet aangetoond. We hebben daarom een protocol ontwikkeld om primaire B-cellen van rhesusmakaken in vitro te bewerken om dergelijke studies mogelijk te maken. We rapporteren voorwaarden voor in vitro kweek en genbewerking van primaire resusapen B-cellen uit perifere mononucleaire bloedcellen of splenocyten met behulp van CRISPR / Cas9. Om de gerichte integratie van grote (<4,5 kb) cassettes te bereiken, werd een snel en efficiënt protocol opgenomen voor het voorbereiden van recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 6 als een homologie-gerichte reparatiesjabloon met behulp van een tetracycline-enabled self-silencing adenoviral helper vector. Deze protocollen maken de studie van prospectieve B-cel therapieën bij resusapen mogelijk.

We presenteren een methode voor het kweken en bewerken van primaire resusapen B-cellen met behulp van CRISPR / Cas9 en recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 6 voor de studie van B-celtherapieën.

Genbewerking van primaire resusapen B-cellen

B cells and their progeny are the sources of highly expressed antibodies. Their high protein expression capabilities together with their abundance, easy ...

De methode is relatief eenvoudig en maakt efficiënte genbewerking van resusapen B-cellen mogelijk. De methode maakt het testen van gen-bewerkte B-cellen voor therapeutische doeleinden in resusapen mogelijk. Het is ook geschikt voor preklinisch B-celtherapieonderzoek.De algemene methode kan worden aangepast voor andere celtypen. Als de procedure correct wordt gevolgd, moet men geen worstelingen verwachten. Echter, als gRNA snij-efficiëntie en een goede kwaliteit batch van recombinant AAV6-verstrekken sjabloon zijn van cruciaal belang.Verwarm om te beginnen de B-celkweekmedia voor in een waterbad van 37 graden Celsius. Ontdooi de B-cel stimulerende middelen op ijs. Maak een buis van de juiste grootte met een voorverwarmd ontdooimiddel.Ontdooi één tot twee injectieflacons met primaire resusapen splenocyten of PBMC's in een waterbad van 37 graden Celsius. Decanteer de splenocyten in de voorbereide buis met een voorverwarmd ontdooimedium. Spoel de cryobuizen om alle cellen te verzamelen.Centrifugeer de cellen op 200 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspensie de cellen in 10 milliliter ontdooimedium voor het wassen. Herhaal de centrifugaties drie keer om het vriesmedium te verwijderen.Na de laatste centrifugatie resuspensie van de cellen met een geschatte vijf maal 10 tot de zes cellen per milliliter in een B-celkweekmedium. Combineer 10 microliter celsuspensie met 10 microliter 0,4% trypan blauw en tel de cellen op een hemocytometer. Pas de celconcentratie aan tot driemaal 10 tot de zes cellen per milliliter met B-celkweekmedium volgens het celgetal.Voeg vervolgens de B-cel stimulerende middelen toe aan hun uiteindelijke concentraties en meng. Breng de cellen over in een celkweekschaal en incuber ze bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 48 uur. Na bezinking moeten cellen een dichte monolaag vormen en kunnen kleine clusters van cellen al zichtbaar zijn.Na ongeveer twee dagen moeten cellen gezond en onregelmatig zijn en zichtbaar grotere clusters hebben gevormd. Na het activeren van de B-cellen, bereidt u de reagentia voor op elektroporatie en transductie. Voorwarm DMSO nucleasevrije duplexbuffer, buffer T en buffer E of E2 van de elektroporatiekit naar kamertemperatuur.Ontdooi de rAAV6 homologie-gerichte reparatiesjabloon, of HDRT, en B-celstimulerende middelen op ijs. Resuspendeer het CRISPR Cas9 single-guide RNA, of sgRNA, op 100-micromolair in duplex buffer. Reconstitueer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en meng door vortexing en flicking.Plaats het gereconstitueerde sgRNA op ijs tot gebruik. Bereid voor elektroporatie van 10 microliter 550 microliter B-celkweekmedium met stimulerende middelen en 1% DMSO. Voeg 50 microliter van dit medium met of zonder antibiotica toe aan een celkweekplaat met 48 putten.Voeg vervolgens rAAV6 HDRT toe aan het medium in de putten, tot 20% van het volume van de put. Verwarm de bereide schaal en het resterende medium in een incubator op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Bereid vervolgens voor elektroporatie van 10 microliter 1,15 microliter ribonucleoproteïne of RNP voor door 0,4 microliter 61-micromolair Cas9 te mengen met 0,75 microliter 100-micromolair sgRNA in duplexbuffer.Incubeer de RNP gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voordat u deze met de cellen mengt. Na incubatie kunnen meerdere RNP's worden gecombineerd als meer dan één locus tegelijkertijd moet worden gericht. Bereid vervolgens de cellen voor op elektroporatie.Laat de cellen op kamertemperatuur om temperatuurschokken te voorkomen. Na incubatie, oogst de cellen in een geschikt vat. Spoel de schaal af met DPBS om het maximale aantal cellen te verzamelen.Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 200 G. Gooi het supernatant weg en resuspensie de cellen in DPBS met ongeveer twee keer 10 tot de zes cellen per milliliter, op basis van het aantal cellen dat in de cultuur wordt geplaatst. Combineer gelijke volumes celsuspensie en 0,4% trypan blauw en tel met behulp van een hemocytometer.Na het centrifugeren en weggooien van het supernatant, resuspendien de cellen in voorverwarmde buffer T met 5,55 maal 10 tot de zeven cellen per milliliter, op basis van het celgetal. Stel het transfectiesysteem in door het apparaat in te schakelen en in te stellen op 1, 350 volt, 15 milliseconden en één puls. Plaats het pipetstation in de laminaire stroomkap.Bereid voor elke set van 10 elektroporaties een transfectiebuis voor met drie milliliter buffer E.Steek de buis in het pipetstation. Combineer 1,15 microliter RNP met negen microliter cellen per elektroporatie. Bereid ten minste 20% meer om bubbels te voorkomen en incuber bij kamertemperatuur gedurende één minuut vóór elektroporatie.Zuig 10 microliter RNP en celmengsel op in de elektroporatiepunt op een elektroporatiepipet. Plaats de geladen pipet in het pipetstation en start de elektroporatie. Zorg ervoor dat de uiteinden volledig vrij zijn van luchtbellen om boogvorming te voorkomen.Werp de geëlektroperde cellen onmiddellijk uit in het voorbereide voorverwarmde kleine volume medium, met of zonder rAAV6, in de 48-put. Voeg controlemonsters zonder transfectie toe aan de kweekputten. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende vier tot zes uur.Voeg aan het einde van de incubatie 450 microliter voorverwarmd B-celkweekmedium met stimulerende middelen, DMSO en met of zonder antibiotica toe aan de plaat. Voer genomische DNA-analyse uit na 24 uur. Kwantificeer de bewerkingsefficiëntie met digitale druppelpolymerasekettingreactie, of PCR, met behulp van een primer buiten de homologiearm en een primer in de insert.Voer PCR uit om de invoegsite te versterken en Sanger-sequencing om de juiste bewerking te controleren. Om de eiwitniveaus te analyseren, kweekt u de cellen gedurende 40 tot 48 uur na elektroporatie om eiwitexpressieveranderingen mogelijk te maken en voert u een analyse uit met flowcytometrie. De productie van rAAV6 met behulp van tetracycline-enabled, zelf-uitschakelende adenovirale helper resulteerde in de productie van vier keer 10 tot 10 GC per milliliter celkweekmedium, waardoor de productie met behulp van een helpervrije drievoudige transfectie 30 tot 40-voudig werd overtroffen.De optionele zuivering resulteerde in de eliminatie van de meerderheid van CD3+T-cellen en CD14+- en CD16+myeloïde cellen, waarbij routinematig zuiverheden van 80 tot 95%CD20+B-cellen werden verkregen. Genbewerking van primaire resusapen B-cellen wordt hier getoond. Deze studie handhaafde een hoge levensvatbaarheid van de cellen, terwijl tegelijkertijd de lichte ketenexpressie in 80% B-cellen werd verwijderd.Het merendeel van de B-cellen bracht nog steeds isotype IgM tot expressie. De toevoeging van rAAV6 die codeert voor het antilichaam 1485 HDRT resulteerde in genbewerking en antilichaam 1485 oppervlakte-expressie in 16 tot 21% van de B-cellen, zij het met een lagere fluorescentie-intensiteit voor antilichaamketens dan op onbewerkte B-cellen. De toevoeging van 1% DMSO en uitgebreide, geconcentreerde incubaties met de rAAV6 HDRT verhoogden over het algemeen de bewerkingsefficiëntie.Met behulp van deze methode werd meestal vijf tot 20% en tot 40% bewerkingsefficiëntie bereikt, afhankelijk van de individuele resusaap en de kwaliteit van de rAAV6 HDRT-batch. Zorg er tijdens het uitvoeren van de elektroporatie voor dat u voldoende mix hebt voor transfectie en dat er geen bubbels in de punt zitten. De cellen kunnen met elke gewenste methode worden geanalyseerd of er kan een autologe overdracht in de donor resusaap worden uitgevoerd.

gene-editing-of-primary-rhesus-macaque-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Tonen we het nut van multicolor flowcytometrie voor gedetailleerde fenotypische en functionele karakterisering van het totaal en als het geheugen subsets van CD4 + en CD8 + T-cellen in rhesus makaken, het ideale model voor HIV / AIDS-vaccin studies.

Multicolor Flow Cytometry Analyses van de cellulaire immuunreactie in resusmakaken

We beschrijven een werkwijze voor genetisch primaire humane T cellen te veranderen met een transgen via de...

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het opsommen en karakteriseren rhesus macaque CD8 + T cellen tegen het AIDS-virus. Dit artikel is niet alleen nuttig voor het gebied van immunologie HIV, maar ook op andere gebieden van biomedisch onderzoek waarbij CD8 + T cel responsen is bekend dat de ziekte uitkomst beïnvloeden.

Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8 + T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Het doel van dit protocol is het isoleren van niet-menselijke primaten CD34+ cellen uit primer beenmerg, gen-wijzigen van deze cellen met lentivirale vectoren, en voor te bereiden een product infusie in de autologe host. Het protocol van de totale lengte is ongeveer 48 uur.

Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen

Hier gepresenteerd is een protocol voor efficiënte SCHERPEr/Cas9 ribonucleoproteã-gemedieerde gen bewerken in zoogdiercellen met behulp van buis Electroporation.

SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation

We schetsen een 9-daags protocol voor de transductie en uitbreiding van rhesus macaque perifere bloedmononucleaire cellen die cellen oplevert met een uitstekende co-expressie van de genen van belang in voldoende aantal voor infusie studies van celwerkzaamheid.

Transductie en uitbreiding van primaire T-cellen in negen dagen met onderhoud van centraal geheugen Fenotype

Hier bieden we een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor CRISPR/ Cas9-gebaseerde genoomengineering van primaire menselijke B-cellen voor gen knock-out (KO) en knock-in (KI) om biologische functies van genen in B-cellen en de ontwikkeling van B-celtherapieën te bestuderen.

Genoomtechniek van primaire menselijke B-cellen met CRISPR/Cas9

Het doel van dit protocol is om naadloze CRISPR/Cas9-bewerking van het C. elegans-genoom mogelijk te maken met behulp van geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. Dit protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan genetische modificaties in C. elegans te maken, waaronder inserties, deleties, genvervangingen en codonsubstituties.

CRISPR/Cas9 Editing van het C. elegans rbm-3.2 Gen met behulp van de dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker en Geassembleerde Ribonucleoproteïne Complexen.

Dit protocol beschrijft de procedure voor genoombewerking in van beenmerg afgeleide macrofagen van muizen met behulp van Cas9-sgRNA ribonucleoproteïnecomplexen die in vitro zijn geassembleerd en door elektroporatie worden afgeleverd.

Zeer efficiënte genverstoring in primaire beenmerg-afgeleide macrofagen met behulp van geëlektropoleerde Cas9-sgRNA-complexen

De afgifte van genoomredacteuren als RNA's is een bijzonder krachtig middel om de genomen van primaire zoogdiercellen en cellijnen te modificeren. Het doel van dit protocol is om genoomeditoren als mRNA te leveren in primaire zoogdiercellen en cellenlijnen, gevolgd door gerichte Illumina-sequencing en analyse om bewerkingsuitkomsten te kwantificeren.

Genoombewerking in primaire zoogdiercellen via elektroporatie van editor-RNA

Leer genbewerking van primaire resusapen B-cellen met CRISPR/Cas9 en rAAV6 voor preklinisch onderzoek naar B-celtherapieën. Deze methode is efficiënt en aanpasbaar voor andere celtypen.

Genbewerking van primaire resusapen B-cellen

Meer video's verkennen