Name: Ontwikkeling en optimalisatie van een humaan hepatocellulair carcinoom-patiënt-afgeleid organoïdemodel voor potentiële doelidentificatie en ontdekking van geneesmiddelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Ontdek geoptimaliseerde protocollen voor hepatocellulair carcinoom-organoïden uit patiënten. Deze methode verbetert de grootte en levensvatbaarheid voor therapeutische doelidentificatie en geneesmiddelontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82122048; 82003773; 82203380) en Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011416).

Menselijke biopsieweefsels werden verkregen van de betreffende patiënt in het Affiliated Cancer Hospital and Institute van de Guangzhou Medical University, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Het vaststellen van HCC-organoïden van patiënten uit chirurgische monsters
OPMERKING: De oprichting van HCC-organoïden omvat verschillende stadia, namelijk weefseldissociatie, organoïdeplating, kweek, passaging, cryopreservatie en reanimatie. Het proces van weefseldissociatie duurt 2 uur, terwijl het zaaien van organoïden op een plaat ongeveer 40 minuten duurt. Hierna ondergaat de eerste generatie HCC-organoïden een kweekperiode van 10-14 dagen met behulp van HCC-isolatiemedium. Zodra een bevredigende dichtheid is bereikt, worden organoïdepassages uitgevoerd, wat 1 uur duurt. De volgende culturen van de organoïden worden vervolgens gedurende 7-10 dagen in stand gehouden met behulp van HCC-expansiemedium, wat kan variëren afhankelijk van de groeisnelheid en conditie van de organoïden.
<ol><li>Weefsel dissociatie<ol><li>Voorbereiding van benodigdheden en materialen<ol><li>Verzamel 1-2cm3 HCC-weefsel van patiënten die vóór de operatie geen eerdere lokale of systemische behandeling hebben ondergaan. Houd het weefsel na chirurgische resectie bij 4 °C in weefselconserveringsoplossing (tabel 1) tot verwerking. OPMERKING: Verse weefselmonsters van hoge kwaliteit zijn essentieel voor het succesvol opzetten van organoïden. Het is belangrijk om monsters snel te verwerken, idealiter binnen 1-4 uur na chirurgische resectie om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden. Voer alle volgende procedures uit in een aseptische omgeving met behulp van steriele materialen en reagentia.</li>
			<li>Verwarm ultralage oppervlaktecelkweekplaten (24 putjes) gedurende 1 uur voor in een incubator bij 37 °C. Ontdooi het bevroren basaalmembraanextract (BME) een nacht bij 4 °C tot vlak voor gebruik. NOTITIE: Om ervoor te zorgen dat de BME volledig ontdooit, moet deze minimaal 3 uur op ijs worden geplaatst. Het volledig smelten van de BME is essentieel voor een succesvolle organoïdekweek in de volgende stappen.</li>
			<li>Zorg er vóór gebruik voor dat de digestieoplossing (tabel 1) is opgewarmd tot een temperatuur van 37 °C. NOTITIE: Bereid de digestieoplossing vers in een aseptische omgeving en gebruik deze onmiddellijk.</li>
		</ol></li>
		<li>Organisatorische verwerkingsstroom<ol><li>Knip in een laminaire flowkast het tumorweefsel in kleine stukjes (0,5-1mm3) met een chirurgische schaar op een petrischaaltje. Breng het geknipte weefsel over in een conische buis van 15 ml en voeg 5-10 ml basaal medium toe (tabel 1). OPMERKING: Het basale medium (tabel 1) kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard.</li>
			<li>Gebruik een barotrope pipet om zoveel mogelijk bloed weg te spoelen en laat het 1-2 minuten staan om een deel van het supernatant te verwijderen, inclusief eventuele bloedcellen en zwevende vetstolsels. Herhaal deze procedure twee keer.</li>
			<li>Centrifugeer het mengsel bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig het supernatant. Voeg 5 ml van de voorverwarmde digestieoplossing (tabel 1) toe aan het bijgesneden weefsel.</li>
			<li>Draai de buis op 37 °C voor de spijsvertering.</li>
			<li>Zoek na 30 minuten van de eerste vertering naar kleine clusters van cellen onder de microscoop. Controleer elke 5-10 minuten om overdigestie te voorkomen. OPMERKING: De tijd die nodig is voor weefselvertering is afhankelijk van de grootte en het type weefsel. De weefselvertering mag niet langer duren dan 90 minuten. Oververteerd weefsel zal onder de microscoop verschijnen als een groot vel individuele cellen. Het juiste verteringsniveau wordt aangegeven door het feit dat de meeste hiervan celclusters zijn en een druifachtig uiterlijk hebben.</li>
			<li>Stop de vertering door koud basaal medium toe te voegen (tabel 1) en filtreer in een nieuw buisje van 50 ml met een celfilter van 100 μm. Voeg koud basaal medium toe tot een volume van 50 ml.</li>
			<li>Centrifugeer de cellen bij 2 × g gedurende 10 minuten bij 8 °C. Verwijder voorzichtig het supernatans en resuspendeer de pellet door nog eens 50 ml koud basaal medium toe te voegen (tabel 1). Herhaal deze stap twee keer. OPMERKING: Centrifugeren met lage snelheid wordt gebruikt om kleine celclusters te laten bezinken, terwijl bloedcellen en celresten nog steeds in het supernatant zweven; Het proces wordt meerdere keren herhaald om een relatief zuivere weefselcelmassa te verkrijgen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Organoïde beplating<ol><li>Verwijder na de tweede wasbeurt zoveel mogelijk van het supernatans en resuspendeer het gewenste aantal cellen (1.000-5.000 cellen per putje van een plaat met 24 putjes) in de juiste BME voor plating. NOTITIE: Houd de BME voor gebruik altijd op 4 °C.</li>
		<li>Voeg BME toe en suspendeer kleine celclusters in Advanced DMEM/F-12 door BME toe te voegen en zachtjes op en neer te pipetteren totdat de celaggregaten volledig zijn opgeschort. Controleer de concentratie van de BME tussen 30% en 50%.</li>
		<li>Zaad 50 μL BME-druppeltjes gemengd met celclusters in het midden van kweekplaten met 24 putjes. NOTITIE: Laat de druppels zich zoveel mogelijk niet verspreiden naar de zijwand van de putplaat. De zijwand van de adsorptiearme plaat bevindt zich niet in een lage adsorptietoestand en contact tussen de druppels en de zijwand zal leiden tot adhesie, wat niet bevorderlijk is voor de daaropvolgende incubatie.</li>
		<li>Laat de platen met de toegevoegde druppels gedurende 20 minuten stollen bij 37 °C. Voeg aan het einde van de incubatie 500 μl voorverwarmd medium (tabel 1) toe aan elk putje en incubeer in een celincubator bij 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Organoïde cultuur<ol><li>Ververs het kweekmedium (tabel 1) eens in de 2-3 dagen. Kweek aan het begin van de kweek de HCC-organoïden gedurende 2 weken in HCC-isolatiemedium (tabel 1).</li>
		<li>Vervang het medium na 2 weken incubatie met HCC-isolatiemedium door HCC-organoïde-expansiemedium (tabel 1) (maximaal 2 weken bewaard bij 4 °C).</li>
		<li>Ververs het kweekmedium eens in de 3 dagen.</li>
		<li>Na 7-10 dagen kweken met HCC-expansiemedium, wanneer de organoïde de juiste dichtheid of grootte heeft bereikt, start u experimentele interventies of passeert of lyofiliseert u de organoïden indien nodig.</li>
	</ol></li>
	<li>Organoïde passaging<ol><li>Voorbereiding van benodigdheden en materialen<ol><li>Verwarm ultralage oppervlaktecelkweekplaten (24 putjes) gedurende 1 uur voor in een incubator bij 37 °C. Ontdooi bevroren BME 's nachts bij 4 °C tot vlak voor gebruik.</li>
			<li>Verwarm de organoïde-oogstoplossing en trypsinevervanger bij 37 °C gedurende 30 min.</li>
		</ol></li>
		<li>passeerproces<ol><li>Nadat u het kweekmedium van de putplaat hebt verwijderd, brengt u de organoïdussuspensie over in een buis van 15 ml.</li>
			<li>Voeg organoïde-oogstoplossing toe volgens de hoeveelheid BME (500 μL organoïde-oogstoplossing per 50 μL BME) door op en neer te schrapen en pipetteren met een pipetpistool van 1.000 μL. OPMERKING: Vermijd luchtbellen tijdens het hele proces om verlies van organoïden te voorkomen, aangezien de aanwezigheid van luchtbellen duidt op een hogere pipetteerdruk.</li>
			<li>Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Zuig de BME voorzichtig op met een pipet van 1.000 μl en controleer of de BME volledig is opgelost. Observeer elke 10 minuten totdat een heldere organoïdecelcluster wordt waargenomen, centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 400 × g en verwijder zoveel mogelijk van het supernatans. OPMERKING: In dit stadium kan de organoïde worden ingevroren en geconserveerd.</li>
			<li>Voeg voor de enzymatische vertering van organoïden 1-5 ml trypsinevervanger toe (afhankelijk van het aantal organoïden) en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 °C. Observeer onder de microscoop de mate van enzymatische vertering om te bepalen of de organoïden uiteenvallen in kleine clusters van 2-10 cellen; Als dit niet het geval is, ga dan door met de enzymatische vertering. OPMERKING: Overdigestie zal resulteren in de lysis van organoïde celclusters in afzonderlijke cellen, waardoor hun levensvatbaarheid afneemt en de daaropvolgende kweektijd wordt verlengd.</li>
			<li>Voeg het juiste volume koud basaal medium toe (tabel 1) om de vertering te stoppen.</li>
			<li>Centrifugeer de organoïden bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 8 °C; Verwijder het supernatans zoveel mogelijk.</li>
			<li>Resuspendeer het gewenste aantal organoïden (1.000-5.000 organoïden per putje van een plaat met 24 putjes) in de juiste matrix voor plating. Volg dezelfde stappen als in paragraaf 1.2. OPMERKING: De dichtheid van de beplating moet worden geoptimaliseerd op basis van de groeisnelheid en de grootte van de organoïden.</li>
			<li>Passage de organoïden elke 10 dagen in een verhouding van 1:3 of 1:4, afhankelijk van de dichtheid van de organoïdegroei.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Cryopreservatie en reanimatie van organoïden<ol><li>Cryopreservatie van organoïden<ol><li>Bereid vriesdroogbuisjes voor, waarbij elke buis samenvloeit met twee putjes van een plaat met 24 putjes die organoïden bevat.</li>
			<li>Volg de stappen 1.4.2.1 tot en met 1.4.2.4 voor het passeren van organoïden om organoïden zonder BME te verkrijgen, en resuspendeer de organoïden voorzichtig door 500 μL/putje organoïde-vriesdroogoplossing toe te voegen aan een plaat met 24 putjes. OPMERKING: Afhankelijk van de groeistatus en grootte van de organoïden wordt aanbevolen om de organoïden tot de derde generatie in cultuur te cryopreserveren.</li>
			<li>Breng de suspensie over in vriesdroogbuizen en plaats deze in een gradiëntgekoelde doos bij -80 °C. Na gradiëntafkoeling bij -80 °C gedurende ten minste 24 uur, de buizen overbrengen naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.</li>
		</ol></li>
		<li>Reanimatie van organoïden<ol><li>Incubeer gevriesdroogde buizen in een waterbad van 37 °C en stop de incubatie wanneer er nog maar een klein blokje ijs overblijft.</li>
			<li>Centrifugeer bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 8 °C om het supernatans volledig te verwijderen.</li>
			<li>Volg de paragrafen 1.2 en 1.3 voor de volgende bewerkingen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Optimalisatie van de vorming van HCC-organoïden voor doelwitidentificatie en medicijnontwikkeling

<ol><li>Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).</li>
<li>Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution in hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (3), 139-152 (2020).</li>
<li>Yang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+view+of+hepatocellular+carcinoma%3A+trends%2C+risk%2C+prevention+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).</li>
<li>Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy for hepatocellular carcinoma.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146(2020).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+and+Integrative+Genomic+Characterization+of+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li>
<li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li>
<li>Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+organoids+and+cell+transplantation%3A+What+the+future+holds%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds.</a> Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).</li>
<li>Nuciforo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+liver+cancers+derived+from+tumor+needle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies.</a> Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hepatocyte+differentiation+model+reveals+two+subtypes+of+liver+cancer+with+different+oncofetal+properties+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).</li>
<li>Kong, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+lineage+plasticity+in+hepatocellular+carcinoma+using+an+anti-CLDN6+antibody-drug+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate.</a> Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282(2021).</li>
<li>Li, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+potential+oncofetal+targets+in+human+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101921(2022).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell-mediated+therapeutic+resistance+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatoma+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatoma Research. 8, 36(2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Een opmerkelijk voordeel van van patiënten afgeleide organoïdemodellen ligt in hun vermogen om de biologische kenmerken van tumoren getrouw na te bootsen, inclusief weefselstructuur en genoomlandschap. Deze modellen vertonen een opmerkelijk niveau van nauwkeurigheid en weerspiegelen effectief de heterogeniteit en progressie van tumoren, zelfs over langere perioden van cultivatie 6,8,9. Door het gebruik van dit verfijnde organoïd...

Hepatocellulair carcinoom (HCC), een veel voorkomende en zeer diverse tumor1, heeft veel aandacht gekregen binnen de medische gemeenschap. De aanwezigheid van afstammingsplasticiteit en substantiële heterogeniteit in HCC suggereert dat tumorcellen afkomstig van verschillende patiënten en zelfs verschillende laesies binnen dezelfde patiënt ongelijke moleculaire en fenotypische eigenschappen kunnen vertonen, waardoor formidabele obstakels worden gevormd bij de vooruitgang van innovatieve therapeutische benaderingen 2,3,4,5 . Bijgevolg is er een dringende behoefte aan een beter begrip van de biologische kenmerken en mechanismen van geneesmiddelresistentie bij HCC om de formulering van effectievere behandelingsstrategieën te informeren.
In de afgelopen decennia hebben onderzoekers hun inspanningen gewijd aan de ontwikkeling van in vitro modellen met het oog op het bestuderen van HCC 3,4. Ondanks enkele vorderingen blijven er beperkingen bestaan. Deze modellen omvatten een reeks technieken, zoals het gebruik van cellijnen, primaire cellen en van patiënten afgeleide xenotransplantaten (PDX). Cellijnen dienen als in vitro modellen voor langdurige kweek van tumorcellen verkregen van HCC-patiënten, en bieden de voordelen van gemak en gemakkelijke uitbreiding. Primaire celmodellen omvatten directe isolatie en kweek van primaire tumorcellen uit tumorweefsels van patiënten, waardoor een weergave wordt verkregen van biologische kenmerken die sterk lijken op die van de patiënten zelf. PDX-modellen omvatten de transplantatie van tumorweefsels van patiënten in muizen, met als doel de tumorgroei en -respons getrouwer te simuleren. Deze modellen hebben een belangrijke rol gespeeld in HCC-onderzoek, maar ze hebben bepaalde beperkingen, waaronder de heterogeniteit van cellijnen en het onvermogen om in vivo omstandigheden volledig te repliceren. Bovendien kan langdurige in-vitrokweek leiden tot een verslechtering van de oorspronkelijke kenmerken en functionaliteiten van de cellen, wat een uitdaging vormt bij het nauwkeurig weergeven van de biologische eigenschappen van HCC. Bovendien is het gebruik van PDX-modellen zowel tijdrovend als kostbaar3.
Om deze beperkingen aan te pakken en de fysiologische eigenschappen van HCC nauwkeuriger te repliceren, is het gebruik van organoïdetechnologie geïntroduceerd als een veelbelovend onderzoeksplatform dat in staat is om eerdere beperkingen te overtreffen. Organoïden, driedimensionale celmodellen die in vitro worden gekweekt, hebben het vermogen om de structuur en functionaliteit van echte organen na te bootsen. In de context van HCC bestaan er echter bepaalde uitdagingen bij het opstellen van organoïdemodellen. Deze uitdagingen omvatten onvoldoende gedetailleerde beschrijvingen van HCC-organoïdeconstructieprocedures, een gebrek aan uitgebreide protocollen voor het hele proces van HCC-organoïdeconstructie en de typisch kleine omvang van gekweekte organoïden 6,7,8. In het licht van de doorgaans beperkte afmetingen van gekweekte organoïden, hebben we geprobeerd deze uitdagingen aan te pakken door de ontwikkeling van een uitgebreid protocol dat de volledige HCC-organoïdenconstructie omvat6. Dit protocol omvat weefseldissociatie, organoïdeplating, kweek, passaging, cryopreservatie en reanimatie. Door de procedurele stappen te optimaliseren en de samenstelling van het kweekmedium te verfijnen, hebben we met succes HCC-organoïdemodellen ontwikkeld die in staat zijn tot duurzame groei en langdurige passaging 6,8. In de volgende paragrafen zal een uitgebreid verslag worden gegeven van de operationele fijne kneepjes en relevante factoren die betrokken zijn bij de constructie van HCC-organoïden.

<table><tbody><tr><td>[Leu15]-gastrin I human</td><td>Merck</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Microtubes</td><td>Merck</td><td>AXYMCT150LC</td><td></td></tr><tr><td>A8301 (TGF&beta; inhibitor)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (503), minus vitamin A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (503), serum-free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP7</td><td>Peprotech</td><td>120-03P</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer size 100 &mu;m</td><td>Merck</td><td>CLS352360</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Merck</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Merck</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp;Costar Ultra-Low</td><td>Merck</td><td>CLS3473</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td><td>R&amp;D SYSTEMS</td><td>3700-100-01</td><td>Organoid harvesting solution</td></tr><tr><td>Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)</td><td>Merck</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Merck</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Merck</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>C6164</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Merck</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634028</td><td>Advanced DMEM/F-12</td></tr><tr><td>Earle&rsquo;s balanced salt solution (EBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24010043</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement (1003)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Merck</td><td>A0737-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Merck</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human FGF19</td><td>Peprotech</td><td>100-32</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride</td><td>Merck</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>R-spodin1-conditioned medium</td><td>(Broutier et al.)</td><td>N/A</td><td>Secretion of cell lines</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Surgical specimen of tumor removed from HCC patients</td><td>Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>Peprotech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td>Trypsin substitute</td></tr><tr><td>Wnt-3a-conditioned medium</td><td>(Broutier et al.)</td><td>N/A</td><td>Secretion of cell lines</td></tr></tbody></table>

ontwikkeling en optimalisatie van een humaan hepatocellulair carcinoom-patiënt-afgeleid organoïdemodel voor potentiële doelidentificatie en ontdekking van geneesmiddelen

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is wereldwijd een veel voorkomende en dodelijke tumor en de late ontdekking en het gebrek aan effectieve specifieke therapeutische middelen maken verder onderzoek naar de pathogenese en behandeling ervan noodzakelijk. Organoïden, een nieuw model dat sterk lijkt op inheems tumorweefsel en in vitro kan worden gekweekt, hebben de afgelopen jaren veel belangstelling gewekt, met tal van rapporten over de ontwikkeling van organoïdemodellen voor leverkanker. In deze studie hebben we met succes de procedure geoptimaliseerd en een kweekprotocol opgesteld dat de vorming van grotere HCC-organoïden met stabiele passaging en kweekomstandigheden mogelijk maakt. We hebben elke stap van de procedure uitgebreid geschetst, waarbij we het hele proces van HCC-weefseldissociatie, organoïdeplating, kweek, passaging, cryopreservatie en reanimatie hebben behandeld, en in dit artikel gedetailleerde voorzorgsmaatregelen hebben gegeven. Deze organoïden vertonen genetische gelijkenis met de originele HCC-weefsels en kunnen worden gebruikt voor diverse toepassingen, waaronder de identificatie van potentiële therapeutische doelen voor tumoren en de daaropvolgende ontwikkeling van geneesmiddelen.

Na implementatie van de bovengenoemde procedure is de opkomst van HCC-organoïde sferoïden doorgaans waarneembaar binnen een tijdsbestek van 3 dagen (Figuur 1). Figuur 1A,B toont de gevestigde HCC-organoïde, die op de eerste dag van vestiging onmiddellijk compacte sferoïden ontwikkelt die worden gekenmerkt door afgeronde randen en permeabel cytosol. Tijdens de groei van HCC-organoïden had het gebruik van verschillende concentraties BME verschille...

We bieden een uitgebreid overzicht en verfijning van bestaande protocollen voor de vorming van hepatocellulair carcinoom (HCC), die alle stadia van de organoïdeteelt omvatten. Dit systeem dient als een waardevol model voor de identificatie van potentiële therapeutische doelwitten en de beoordeling van de effectiviteit van kandidaat-geneesmiddelen.

Ontwikkeling en optimalisatie van een humaan hepatocellulair carcinoom-patiënt-afgeleid organoïdemodel voor potentiële doelidentificatie en ontdekking van geneesmiddelen

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...

Ons lab heeft tot doel de moleculaire pathogenese van leverkanker te onderzoeken en nieuwe therapeutische doelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen te identificeren. We willen graag antwoord geven op de vraag hoe kanker ontstaat, uitzaait en vordert naar medicijntolerantie met behulp van nieuwe ziektemodellen zoals van patiënten afgeleide organoïden. De huidige experimentele uitdagingen liggen in twee aspecten.Ten eerste is er een gebrek aan een volledige set protocollen voor het construeren van hepatocellulair carcinoomorganoïden voor het hele proces. Ten tweede is de grootte van gekweekte HCC-organoïden te klein voor latere experimentele verwerking. In dit protocol geven we de details van de geoptimaliseerde organoïdenkweek en de daaropvolgende overdrachts- en invriesprocedures, evenals de voorzorgsmaatregelen die tijdens alle procedures moeten worden genomen.We optimaliseerden de samenstelling van het organoïdemedium voor organoïden met bijna de oorspronkelijke weefselkenmerken. We kunnen de evolutie van de tumor volgen met behulp van de van de patiënt afgeleide organoïden en proberen nieuwe moleculaire en therapeutische doelen voor HCC-behandeling te identificeren.

development-optimization-human-hepatocellular-carcinoma-patient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Dit protocol presenteert een 3D biomimetisch model met bijbehorend fibrotisch stromaal compartiment. Bereid met fysiologisch relevante hydrogels in verhoudingen die de biofysische eigenschappen van de stromale extracellulaire matrix nabootsen, een actieve bemiddelaar van cellulaire interacties, tumorgroei en uitzaaiingen.

Een biomimetisch model voor leverkanker om tumor-stroma-interacties te bestuderen in een 3D-omgeving met afstembare bio-fysische eigenschappen

Een langdurig ex vitro 3D-organoïde kweeksysteem werd opgezet uit muizenhepatocyten. Deze organoïden kunnen worden gepasseerd en genetisch gemanipuleerd door lentivirusinfectie van shRNA / ectopische constructie, siRNA-transfectie en CRISPR-Cas9-engineering.

Vaststelling en genetische manipulatie van Murine Hepatocyte Organoïden

Dit protocol beschrijft het genereren van snelle en reproduceerbare endodermale leverorganoïden (eHEPO's). Met dit protocol kunnen eHEPO's binnen 2 weken worden geproduceerd en op lange termijn (meer dan 1 jaar) worden uitgebreid zonder hun differentiatie en functionaliteit te verliezen.

Genereren van functionele endodermale leverorganoïden

Organoïden die worden gegenereerd uit tumoren van patiënten worden orthotopisch in de lever van de muis geïnjecteerd. De resectie van niet-tumorachtig leverweefsel leidt tot een regeneratieve omgeving in het leverweefsel waar de tumor zich bevindt.

Een van patiënten afgeleide organoïde xenotransplantaatmodel voor hepatocellulaire kanker om de impact van leverregeneratie op tumorgroei te onderzoeken

Dit protocol schetst een gestroomlijnde methode voor het genereren van hepatocellulaire carcinoomorganoïden, het toepassen van medicamenteuze behandeling en het uitvoeren van single-cell RNA-sequencing voor en na de behandeling om therapiegerelateerde transcriptieveranderingen te karakteriseren.

Generatie en eencel-transcriptomische analyse van hepatocellulaire carcinoomorganoïden na medicamenteuze behandeling

Gebruik makend van de patiënt afgeleide tumoren in een subcutane preklinisch model is een uitstekende manier om de effectiviteit van nieuwe therapieën, voorspellende ontdekking van biomarkers, en resistente paden te bestuderen. Dit model, in de ontwikkeling van geneesmiddelen, is essentieel voor het bepalen van het lot van vele nieuwe anti-kankerbehandelingen voorafgaand aan klinisch onderzoek.

Ontwikkeling en onderhoud van een preklinisch Patient Afgeleid Tumor xenograft model voor onderzoek naar nieuwe anti-Cancer Therapies

Dit protocol beschrijft de generatie van door patiënten afgeleide orthotopic xenotransplantaatmodellen is-modellen door intra-vesisch bijbrengen van hoogwaardige urotheelcelcarcinoom cellen of intra-rectale injectie van colorectale kankercellen in niet-zwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD/SCID) muizen voor primaire tumorgroei en spontane metastasen onder invloed van lymfeklier stromale cellen, die de progressie van humane gemetastaseerde ziekten nabootst.

Patiënt-afgeleide Orthotopic xenograft modellen voor humaan Urotheelcelcarcinoom en colorectale kanker tumor groei en spontane metastasen

Dit protocol beschrijft de optimalisatie procedures in een virus-gebaseerde Dual fluorescentie-gelabelde tumor xenotransplantaatmodellen is model met behulp van larvale zebravis als gastheren. Dit heterogene xenotransplantaatmodellen is-model bootst de weefsel samenstelling van de micro-omgeving van pancreaskanker na in vivo en dient als een preciezer hulpmiddel voor het beoordelen van geneesmiddel responsen in gepersonaliseerde zpdx (Zebrafish patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is)...

Door patiënten afgeleid heterogeen xenograft-model van pancreaskanker met behulp van zebravis larven als gastheer voor vergelijkende geneesmiddelenbeoordeling

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Patiënt-afgeleide organoïde culturen van pancreas ductaal adenocarcinoom zijn een snel gevestigde 3-dimensionale model dat epitheliale tumor cel compartimenten met hoge getrouwheid vertegenwoordigen, waardoor translationeel onderzoek naar deze dodelijke maligniteit. Hier bieden we gedetailleerde methoden om organoïden te vestigen en door te geven en om relevante biologische testen uit te voeren met behulp van deze modellen.

Isolatie en karakterisering van patiënt-afgeleide pancreatic Ductal adenocarcinoom Organoid modellen

Ontdek geoptimaliseerde protocollen voor hepatocellulair carcinoom-organoïden uit patiënten. Deze methode verbetert de grootte en levensvatbaarheid voor therapeutische doelidentificatie en geneesmiddelontwikkeling.

Ontwikkeling en optimalisatie van een humaan hepatocellulair carcinoom-patiënt-afgeleid organoïdemodel voor potentiële doelidentificatie en ontdekking van geneesmiddelen (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling en optimalisatie van een humaan hepatocellulair carcinoom-patiënt-afgeleid organoïdemodel voor potentiële doelidentificatie en ontdekking van geneesmiddelen

Meer video's verkennen