Bereiding van ingevroren foetale eilandjes van niet-menselijke primaten voor gecombineerde RNA-sequencing met één kern en ATAC-sequencing, en bulkmetabolomics
8 november 2024
Dit protocol beschrijft procedures voor het isoleren van hoogwaardige kernen uit bevroren niet-menselijke pancreaseilandjes van primaten voor gebruik in single-nucleus gelijktijdige RNA-sequencing en ATAC-sequencing, terwijl de bulkcytosolische fractie voor metabolomische analyses uit dezelfde monsters behouden blijft.
We gebruiken een zeer translationeel, niet-menselijk primatenmodel om te beoordelen hoe maternale voeding en medicatieconsumptie tijdens de zwangerschap de embryonale ontwikkeling en postnatale functie van pancreaseilandjes bij het nageslacht beïnvloeden. Ontwikkelingsgeprogrammeerde veranderingen kunnen de vatbaarheid voor ziekten later in het leven veranderen. Een uitdaging bij het werken met moeilijk te verkrijgen monsters, zoals die van niet-menselijke primaten, is het efficiënt evalueren van meerdere vragen van dezelfde persoon.
Helaas kan het gelijktijdig extraheren van informatie uit het metaboloom en het genoom moeilijk zijn vanwege de incompatibiliteit van testreagentia bij tijdgevoelige afbraak van te kwantificeren moleculen. Ons protocol maakt extrapolatie mogelijk van de hoeveelheid metabolieten, de toegankelijkheid van chromatine en de differentiële genexpressie van hetzelfde uitgangsmateriaal. Deze meerlagige benadering geeft inzicht in hoe metabolisme het genoom in pancreaseilandjes kan veranderen.
Overzicht
Dit protocol beschrijft methoden om kwalitatief hoogwaardige kernen te isoleren uit bevroren pancreaseilandjes van niet-menselijke primaten voor gelijktijdige RNA-sequencing en ATAC-sequencing. Daarnaast wordt de bulk van de cytosolische fractie bewaard voor metabolomische analyses, wat een uitgebreid begrip van metabolische en genomische interacties mogelijk maakt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Metabolomics
Achtergrond
- Modellen van niet-menselijke primaten zijn cruciaal voor het bestuderen van menselijke ziektemechanismen.
- Het dieet en de medicatie van de moeder kunnen de ontwikkeling van de pancreaseilandjes bij het nageslacht beïnvloeden.
- Gelijktijdige analyse van het metaboloom en het genoom is uitdagend vanwege monsterdegradatie.
- Deze studie richt zich op de behoefte aan efficiënte meerlaagse analyses vanuit beperkte monsters.
Doel van de studie
- Om de impact van maternale factoren op de ontwikkeling van embryonale pancreaseilandjes te beoordelen.
- Om te onderzoeken hoe metabole veranderingen de genomische expressie kunnen beïnvloeden.
- Om een protocol te ontwikkelen dat een uitgebreide analyse vanuit hetzelfde monster mogelijk maakt.
Gebruikte methoden
- Isolatie van kernen uit pancreaseilandjes.
- Gelijktijdige RNA-sequencing en ATAC-sequencing.
- Bewaring van cytosolische fracties voor metabolomische studies.
- Gelaagde analyse om de abundantie van metabolieten en genexpressie te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van hoogwaardige kernen en cytosolische fracties.
- Inzichten in hoe het dieet van de moeder de functie van de pancreaseilandjes beïnvloedt.
- Aangetoonde haalbaarheid van gelijktijdige genomische en metabolomische analyses.
- Onthulling van potentiële verbanden tussen het metabolisme en de genexpressie in de eilandjes.
Conclusies
- Dit protocol maakt een uitgebreide analyse van pancreaseilandjes mogelijk.
- De bevindingen kunnen toekomstige studies naar ziektegevoeligheid informeren.
- Benadrukt het belang van moederlijke invloeden op de gezondheid van het nageslacht.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De integratie van single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq en bulk-metabolomics uit bevroren eilandjes van niet-menselijke primaten pakt een kritiek knelpunt aan in multi-omische ontdekkingen met zeldzame of kostbare monsters. Deze aanpak maakt uitgebreide moleculaire profilering mogelijk vanuit beperkt materiaal, wat bijdraagt aan voorspellend vertrouwen bij vroege targetvalidatie en mechanistische risicoreductie. Het protocol maximaliseert de dataopbrengst per monster, wat risico-gecorrigeerde portfoliobeslissingen ondersteunt in onderzoek naar metabole en ontwikkelingsziekten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar metabole en epigenetische mechanismen die ten grond liggen aan de cellulaire identiteit in ziekterelevante systemen.
- Ondersteunt functionele target-validatie door de abundantie van metabolieten te koppelen aan genexpressie en chromatine-toegankelijkheid.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door gelaagde moleculaire data uit dezelfde biologische bron te integreren.
Screening & assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde kern- en cytosolische fracties voor voor downstream high-throughput sequencing- en metabolomics-workflows.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays door batch-effecten in multi-cohortstudies te minimaliseren.
- Maakt kwantitatieve, multi-omische outputs mogelijk voor een robuuste evaluatie van verbindingen of perturbaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt moleculaire read-outs uit met ziekterelevante metabole en epigenetische biomarkers in translationele modellen.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door gebruik te maken van systemen met niet-menselijke primaten.
- Biedt voorspellende inzichten in ontwikkelingsprogrammering en mechanismen van ziektegevoeligheid.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol slaat een brug tussen vroege ontdekking, targetvalidatie en translationeel onderzoek door multi-omische profilering mogelijk te maken vanuit zeldzame weefselmonsters.
- Discovery-biologie: Ondersteunt hypothese-testen over metabool-epigenetische interacties bij de ontwikkeling van eilandjes.
- Screening: Levert reproduceerbare kern- en metabolietpreparaten voor schaalbare omics-assays.
- Analytica: Biedt kwantitatieve gegevens over genexpressie, chromatine-toegankelijkheid en metabolietovervloed voor comparatieve analyses.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire bevindingen met ziekterelevante fenotypen in modellen van niet-menselijke primaten.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbare workflow voor het maximaliseren van data-extractie uit beperkte of gearchiveerde monsters.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in onderzoek in een vroeg stadium.
- Operationele waarde: Standaardiseert de monsterbereiding voor multi-omics en minimaliseert batch-effecten.
- Strategische waarde: Maakt beter geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt gebruik van zeldzame monsters mogelijk.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van programma's voor metabole en ontwikkelingsziekten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in kernisolatie, single-nucleus sequencing en metabolomics-workflows.
- Vereist toegang tot infrastructuur voor high-throughput sequencing en massaspectrometrie.
- Noodzaak van strikte standaardisatie tussen teams om batch-effecten te beheersen.
- Aanpasbaar aan andere weefseltypen, maar kan protocoloptimalisatie vereisen voor verschillende monstermatrices.
- Schaarsheid van monsters en gevoeligheid voor degradatie leggen praktische beperkingen op aan de doorvoer en timing.
