Bereiding van in agarkraal ingebedde Mycobacterium abscessus om immunocompetente muizen intratracheaal te inoculeren

We ontwikkelen een muismodel van chronische mycobacteriumabcessen longinfectie om de werkzaamheid van antibiotica te testen in preklinische studies. De eerste uitdaging is het overwinnen van de intrinsieke resistentie van muizen tegen mycobacterium-abcessen. De tweede uitdaging is het genereren van een reproduceerbare batch agar beat ingebedde bacteriën voor intratracheale infectie. We willen een gedetailleerd protocol voor de bereiding en infectie van agar beat delen dat gemakkelijk door andere laboratoria kan worden geïmplementeerd om nieuwe medicijnen bij muizen te testen.

Infecteren met agar beat ingebedde bacteriën in plaats van vrije bacteriën, overwint gedeeltelijk het vermogen van immunocompetente muizen om de infectie spontaan te verwijderen. Dit model biedt een robuust preklinisch hulpmiddel voor het evalueren van nieuwe antibiotica tegen mycobacterium abscessus, waardoor de ontdekking en ontwikkeling van de broodnodige antibiotica tegen longinfecties wordt vergemakkelijkt.

[Docent] Verkrijg om te beginnen exponentieel groeiende mycobacterium abscessus suspensieculturen die zijn aangepast aan een optische dichtheid van 30. Breng 27 milliliter gesmolten drieluik sojavijzel voorgebalanceerd bij 50 graden Celsius over in een buis met drie milliliter bacteriële suspensie. Meng de suspensie door te pipetteren. Piket het mengsel van de bacterievijzel voorzichtig in een kolf met 60 milliliter minerale olie in een kolf. Plaats de kolf in een secundaire container en begin onmiddellijk op gemiddelde snelheid te roeren met behulp van een magnetische roerstaaf. Zorg ervoor dat er een zichtbare draaikolk ontstaat in het mengsel van de olievijzel en blijf zes minuten roeren bij kamertemperatuur. Plaats ijs in de secundaire container om de suspensie te laten afkoelen. Breng vervolgens het slurrymengsel over in centrifugebuizen van 250 milliliter. Centrifugeer de suspensie gedurende zes minuten bij vier graden Celsius gedurende de eerste vijf cycli bij 3.700 G en suspendeer de korrel van de vijzelparel opnieuw met DPBS. Monteer ook een trechtercelzeef, connectorring en een buis van 50 milliliter tot één eenheid. Na de 10e wasbeurt suspendeert u de pellet opnieuw en verdunt u de kralensuspensie vier keer. Voeg het verdunde monstermateriaal toe aan de zeef om de kralensuspensie te filteren. Trek langzaam aan de zuiger van een spuit van 30 milliliter die aan de aansluitring is bevestigd om zuigkracht te creëren en de filtratie te verbeteren. Centrifugeer vervolgens de verdunde suspensie gedurende twee minuten bij 1000 G om deze te concentreren. Nadat je de kralenpellets in een buis van 50 milliliter hebt getrokken, bewaar je ze maximaal een week bij vier graden Celsius, maar bereid je verse kralen voor elke batch experimenten. Om te beginnen, bedwang verdoofde CD One-muizen met behulp van een speciaal ontworpen driedimensionale, bedrukte, gekantelde standaard. Zet de muis vast aan de snijtanden met behulp van een hechtkoord dat aan de centrale stang van de standaard is bevestigd. De muis in een buikligging positioneren met het hoofd omhoog. Bevestig een metalen 24 gauge voedingsnaald aan een glazen spuit gevuld met mycobacterium abscessus auger kraal suspensie. Plaats nylon clips of stoppers op de zuiger om een gecontroleerd inoculumvolume van 50 microliter per muis te garanderen. Plaats nu de metalen sondenaald verticaal boven de muis. Steek de naald voorzichtig aan de bovenkant in en schuif hem verder naar beneden in de luchtpijp. Verwijder de nylon clip of stop en doseer langzaam 50 microliter mycobacterium abscessus auger bead suspension in de longen. Laat de muis vijf minuten rusten. Herhaal vervolgens de inoculatieprocedure een tweede keer om een diepe en reproduceerbare afzetting van het volledige inoculum in de longen te garanderen. Avegaarkorrels die mycobacterium abscessus bevatten, brachten mCherry tot expressie De bacteriële belasting over zes onafhankelijke kralenpreparaten vertoonde een hoge reproduceerbaarheid. Bacteriële telling voor en na het passeren van de glazen spuit toonde geen significant verlies van bacteriële belasting. De intertracheale inoculatiemethode was reproduceerbaar in drie onafhankelijke kralenpreparaten, zoals blijkt uit het aantal CFU's in de longen 24 uur na infectie. De reproduceerbaarheid van de infectie tussen drie onafhankelijke operators werd bevestigd, aangezien het aantal CFU's in de longen 24 uur na infectie consistent bleef in alle groepen.