Scheiding en differentiële karakterisering van microbiële extracellulaire blaasjes in de darm bij zoutgevoelige ratten onder zoutrijke dieetomstandigheden

Dit onderzoek onderzoekt de rol van darmmicrobiële extracellulaire blaasjes bij zoutgevoelige hypertensieve ratten met een zoutrijk dieet, en onderzoekt hoe een zoutrijk dieet de blaasjes verandert en hypertensieve en immuuninteracties beïnvloedt. Recente ontwikkelingen op dit gebied zijn onder meer het begrijpen van de rol van darmmicrobiële extracellulaire blaasjes bij hypertensie, het beoordelen van de impact van zoutrijke diëten op de microbiële diversiteit en het implementeren van plantaardige interventies gericht op blaasjes van metabole en immuunregulatie. Huidige experimentele uitdagingen zijn onder meer het isoleren van extracellulaire blaasjes met hoge prioriteit, het onderscheiden van afgeleide blaasjes van microbioomblaasjes, het minimaliseren van monsterverlies in de standaard verfprotocollen om reproduceerbaarheid in alle onderzoeken te garanderen. Dit dichtheidsraster en centrifugatieprotocol geeft een hogere prioriteit aan extracellulaire blaasjes met verbeterde integriteit en reproduceerbaarheid in vergelijking met traditionele methoden, waardoor betrouwbaarder extracellulair onderzoek naar extracellulaire blaasjes in hypertensiestudies mogelijk is.

[Verteller] Breng om te beginnen vijf gram uitwerpselen over in een vooraf gewogen centrifugebuis van 50 milliliter. Voeg 50 milliliter voorverwarmde 37 graden Celsius endotoxinevrije PBS toe aan de buis en draai de buis 30 minuten. Koel de hogesnelheidscentrifuge af tot 4 graden Celsius. Plaats het monster vervolgens symmetrisch in de centrifuge en draai gedurende 15 minuten op 8.000 G. Zuig na het centrifugeren het bovenstaande op en breng het over in een nieuwe steriele centrifugebuis. Zuig na opnieuw 15 minuten centrifugeren het bovenstaande voorzichtig op en gebruik het voor verdere analyse. Plaats een steriele filtereenheid van 0,22 micrometer op ijs. Breng het bovenstaande over op de bovenkant van het filter en zet de vacuümpomp aan om de gefilterde monsters te verzamelen. Breng het filtraat over in een centrifugaalfilter met een cutoff van 10 kilodalton en een inhoud van 15 milliliter. Centrifugeer bij 4 graden Celsius 3000G gedurende 30 minuten om het monster te concentreren tot minimaal 1.400 microliter. Leg het monster onmiddellijk op ijs. Meng één volume gradiëntbuffer A met vijf volumes dichtheidsgradiëntmedium om de werkoplossing te bereiden. Bereid een 10% jodixanoloplossing door één eenheid werkoplossing te mengen met vier eenheden buffer B. Meng op dezelfde manier twee eenheden werkoplossing met drie eenheden buffer B voor een 20% jodixanoloplossing en vier eenheden werkoplossing met één eenheid buffer B voor een 40% jodixanoloplossing. Meng nu het eerder bereide geconcentreerde monster met zeven milliliter dichtheidsgradiëntmedium om een 50% jodixanol-oplossing te maken. Om een dichtheidsgradiënt voor te bereiden, voegt u trypanblauwoplossing toe aan de 40% en 10% jodixanoloplossingen. Breng acht milliliter 50% jodixanoloplossing over op de bodem van een dunwandige polypropyleen centrifugebuis. Kantel de buis naar 70 graden en breng acht milliliter 40% jodixanoloplossing over op het vloeistofoppervlak. Voeg vervolgens acht milliliter 20% jodixanoloplossing toe, gevolgd door zeven milliliter 10% jodixanoloplossing en twee milliliter endotoxinevrije PBS. Neem de voorbereide dichtheidsgradiëntbuis en plaats deze in een voorgekoelde ultracentrifuge. Stel de ultracentrifugatieparameters in op 100.000 G, 20 uur en 10 graden Celsius en start de run. Voor handmatige scheiding van de gradiëntdichtheid voor de verzameling is de dichtheidsgradiënt ongeveer 34 milliliter vloeistof. Twee milliliter oplossing wordt langzaam uit het midden van het vloeistofoppervlak geëxtraheerd en elke oplossing van twee milliliter is een gradiënt. De oplossing van de dichtheidsgradiënt is dus verdeeld in 17 gradiënten. Breng ten slotte met behulp van een pipet de dichtheidsfracties over in steriele monsterbuisjes en plaats ze onmiddellijk op ijs. Analyse van het volgen van nanodeeltjes onthulde de grootte, distributie en concentratieprofielen van extracellulaire blaasjes verzameld uit verschillende dichtheidsgradiëntfracties. De meerderheid van de extracellulaire blaasjes in alle fracties was geconcentreerd binnen het bereik van 30 tot 100 nanometer volgens een typisch distributiepatroon. De concentratie van extracellulaire blaasjes bereikte het hoogste niveau in fractie negen, met een piek van ongeveer 3,85 keer 10 tot de macht van negen deeltjes per milliliter. Het eiwitgehalte, gemeten met behulp van een bicinchoninezuurkit, was ook het hoogst in fractie negen met 0,417 microgram per microliter. Bovendien waren de expressieniveaus van lipopolysachariden, bepaald met behulp van een endotoxinedetectiekit, significant verhoogd in fractie negen en 10. Grotere hoeveelheden eiwit werden ook waargenomen in fractie negen tijdens de elektroforese-analyse van natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegel. Transmissie-elektronenmicroscopie, of TEM-beelden, onthulden de extracellulaire blaasjes die bezeten waren als cirkelvormige membraanachtige morfologie.