Tracking van enkele eiwitten in lipide-dubbellagen met behulp van fluorescentiemicroscopie

Eiwitten opereren in een complexe toestandsruimte en veel daarvan is verborgen. We gebruiken enkelmolecuulbeeldvorming om deze toestanden te onthullen. Bij het volgen van enkelmembraaneiwitten in een lipide-dubbellaag zijn de belangrijkste uitdagingen de voorbereiding van monsters, fotobleaching en tijdsresolutie.

Begin met het verwijderen van de lipidensteeloplossingen uit de vriezer en laat ze kamertemperatuur bereiken. Haal een schone 10 milliliter kolf uit de oven en laat hem afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 900 microliter spectroscopische kwaliteit chloroform en 100 microliter spectroscopische kwaliteit methanol toe aan de gekoelde ronde bodem kolf.

Voeg vervolgens de juiste hoeveelheden van elk lipide toe aan de kolf en draai het goed door elkaar om te mengen. Plaats nu een vacuümdestillatieconnector bovenop de ronde bodemkolf en sluit deze aan op de stikstofdroogleiding. Zet dan het stikstofgas aan en pas de druk aan totdat de stroming net voelbaar is op de achterkant van de hand.

Pipette één milliliter buffer voor elke vijf micromol totale lipide in de ronde bodemkolf. Plaats een glazen stop op de kolf en sluit deze af met paraffinefolie. Plaats de kolf en een klem op een ringstandaard en dompel de bodem onder in een sonicaterbad van 60 graden Celsius.

Controleer of de oplossing ondoorzichtig wordt en dat er geen lipiden aan de binnenwand van de kolf vastzitten. Na de incubatie van een uur zet je de sonicater aan en stel je de amplitude in op het hoogste niveau. Beweeg de kolf in het bad om de plek met de sterkste beweging te vinden waar de oplossing zichtbaar stoot en spuit in de fles.

Sonicate de oplossing 30 minuten. Observatie van de overgang van ondoorzichtig naar transparant en licht opalescent. Verwijder de lipideoplossing uit de kolf en doe deze over in een microcentrifugebuis.

Centrifugeer de buis op 100.000 G gedurende een uur op vier graden Celsius. Na centrifugatie verwijder je het supernatant en breng je het over in een nieuwe centrifugebuis. Plaats de 25 millimeter kwarts deksels in een beker en voeg gelijke hoeveelheden nano-zuiver water, 30% waterstofperoxide en geconcentreerd salpeterzuur toe.

Verhit de deksel in de voorbereide oplossing gedurende 30 minuten tot het begint te bubbelen. Controleer de oplossing elke 10 minuten en draai voorzichtig om te voorkomen dat de deksel aan elkaar plakt. Let op hoe de afdekking uit elkaar schuift en loskomt tijdens het draaien.

Eenmaal gescheiden, verlaag je geleidelijk de wervelsnelheid om hun scheiding te behouden en de bubbelende oplossing de dekselsglijdingen gelijkmatig te laten bedekken. Spoel daarna de afdek grondig af met gezuiverd water terwijl je voorzichtig draait om alle chemische resten te verwijderen. Alternatief kun je de kwartsafdekkingen reinigen met n-hexaan gevolgd door methanol, waarbij je met lensweefsel voor elk oplosmiddel afveegt.

Plaats de deksels in een UV-ozonreiniger, waarbij het te behandelen oppervlak naar de lamp toe is gericht. Laat zuurstof vijf minuten lang de kamer binnenstromen met vijf pond per vierkante inch. Zet dan de zuurstofstroom uit.

Zet nu de ultraviolette lampen 15 minuten aan en laat de deksels minstens 10 minuten rusten zodat de ozonlaag kan verdwijnen. Plaats een vers schoongemaakte afdekplaat in een 25 millimeter monsterhouder. Met een SM en één lens van een kwart inch snijd je een dubbellaagse par-filmpakking van acht millimeter en plaats deze in het midden van de monsterhouder.

Breng een druppel van 50 microliter van de kleine Unilamellaire blaasjes aan in het midden van de acht millimeter pakking. Na het afsluiten van de kamer, broed je een uur uit bij 37 graden Celsius. Gebruik na de incubatie een pipet om de oplossing weg te spoelen.

Voeg 50 microliter verse buffer toe aan de dubbellaag en herhaal dit proces in totaal 10 keer. Na de laatste spoeling verwijder je de buffer uit de monsterhouder. Voeg een aliquot van 50 microliter van het gewenste eiwit toe in detergent, zodat de concentratie op of onder de kritische micellaconcentratie ligt.

Incubeer het monster op 37 graden Celsius gedurende minstens een uur om eiwitopname mogelijk te maken, spoel het monster af met een buffer om eventuele niet-ingebrachte eiwitten en detergent te verwijderen. Stel de verticale pixelverschuiving in op ongeveer 600 nanoseconden en verhoog de verticale klokspanning met behulp van overclock-modus. Stel vervolgens de horizontale pixelweergave in op de maximale snelheid.

Stel de versterker van de voorversterker in op twee. Stel de versterkeruitgang in voor elektronenvermenigvuldiging en zet de versterking van de elektronenmultiplicator op het hoogste niveau. Stel vervolgens de belichtingstijd in op 25 milliseconden.

Controleer of de daadwerkelijke framerate de belichtingstijd iets overschrijdt. Pas nu het laservermogen aan totdat het signaal duidelijk afsteekt van het achtergrondgeluid. Verzamel voldoende beeldgegevens om minimaal 1000 sporen per monster te verkrijgen.

Voor trackinganalyse snijd je alle datasets bij tot een consistente grootte en voer je achtergrondcorrectie uit met Image J.In Fiji, sleep en drop je de film of stapel je het TIFF-bestand dat geanalyseerd moet worden in de interface. Om de pixelkalibratiedetails in te voeren, ga je naar het tabblad analyseren, selecteer je schaal instellen en pas je de pixel toe op afstandskalibratie die specifiek is voor het instrument. Sla vervolgens een kopie van de dataset op om het origineel te behouden en eventuele wijzigingen bij te houden.

Trek de achtergrond af van een geselecteerd interessegebied en pas deze toe op de opgeslagen kopie van de originele data. Ga naar het tabblad proces en kies achtergrond aftrekken. Selecteer in het tabblad plugins tracking, gevolgd door trackmate om het trackmate-dialoogvenster voor trackinganalyse te openen.

De mate van labeling voor AQP-vier tetrameren werd berekend op 4,12 met behulp van UV-zichtbare spectrometrie en de Poisson-distributieanalyse gaf aan dat 98% van de tetrameren ten minste één fluorescerende kleurstofmolecuul droeg. Het histogram toont een brede verdeling van stapgroottes die overeenkomen met diffusie van orthogonale deeltjesformaten van verschillende groottes, en de berekende gemiddelde diffusiecoëfficiënt was 0,0143 vierkante micrometer per seconde. In deze video hebben we belangrijke toestanden geïdentificeerd die belangrijk zijn voor de regulatie van aquaporine four en de bijbehorende thermodynamische krachten.

Dit protocol elimineert giswerk bij het creëren van biomimetische membranen met gezuiverde transmembraaneiwitten die geschikt zijn voor timelapse enkelmolecuultracking. Eiwitmachines die op inflectiepunten werken. Timelapse single protein tracking maakt directe observatie mogelijk van stochastische paden, vertakkingen en doodlopende wegen.