Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Na początku XX wieku zapalenie płuc było odpowiedzialne za dużą część zgonów z powodu chorób zakaźnych1. Aby opracować skuteczną szczepionkę przeciwko zapaleniu płuc, Frederick Griffith postanowił zbadać dwa różne szczepy Streptococcus pneumoniae: niezjadliwy szczep o szorstkim wyglądzie (szczep R) i zjadliwy szczep o gładkim wyglądzie (szczep S) ze względu na zewnętrzną kapsułkę polisacharydową2. Ta zewnętrzna warstwa bakterii szczepu S umożliwiła im oparcie się układowi odpornościowemu gospodarza, co ostatecznie doprowadziło do choroby zagrażającej życiu. Kiedy Griffith oddzielnie wstrzykiwał myszom zabite termicznie bakterie któregokolwiek szczepu, myszy przeżyły. Jednak, kiedy wstrzyknął myszom kombinację zabitego termicznie szczepu S z żywym szczepem R, myszy zmarły2. Kiedy przeanalizował próbki uzyskane od martwych myszy, którym wstrzyknięto kombinację, zaobserwował, że obecne są żywe bakterie szczepu S. W 1928 roku Griffith zauważył, że musiał zajść proces "transformacji", aby zmienić niezjadliwe bakterie w zjadliwy szczep. Jego odkrycie, będące pierwszym znanym odkryciem transformacji bakteryjnej, utorowało drogę do opracowania niezbędnego narzędzia w inżynierii genetycznej - transformacji3.
Transformacja to zmiana genetyczna w komórce spowodowana pobraniem DNA ze środowiska. W eksperymencie Griffitha DNA, które koduje ochronną powłokę polisacharydową bakterii szczepu S, nie rozpadło się w wyniku szoku cieplnego i zostało wprowadzone do szczepu R, co pozwoliło temu ostatniemu ominąć układ odpornościowy myszy. Podczas gdy proces ten stale zachodzi w naturze między organizmami, a nawet różnymi gatunkami, naukowcy przekształcają bakterie w warunkach laboratoryjnychdo celów badawczych 4.
Bakterie są idealnymi organizmami do transformacji, ponieważ mogą łatwo wchłonąć egzogenny materiał genetyczny do swojego genomu i szybko go amplifikować3,5. Mają jeden kolisty chromosom i wiele małych okrągłych fragmentów dwuniciowego DNA zwanych plazmidami w cytoplazmie. Plazmidy te mogą replikować się niezależnie od chromosomalnego DNA i generalnie zapewniają pewne korzyści funkcjonalne, takie jak oporność na antybiotyki6,7. W swoim naturalnym środowisku bakterie przechodzą "transformację bakteryjną" poprzez pobieranie plazmidów od innych bakterii w procesie zwanym koniugacją8. Co więcej, kiedy się rozmnażają, każde z ich potomstwa otrzymuje kopię nowego plazmidu.
Plazmidy, które są używane do celów eksperymentalnych, nazywane są wektorami plazmidowymi. W warunkach laboratoryjnych naukowcy mogą sztucznie stworzyć "rekombinowane plazmidy" o długości około 5 000-10 000 par zasad, wprowadzając fragmenty DNA do wektora plazmidowego. Te rekombinowane plazmidy zwykle mają pewne składniki: pochodzenie replikacji (ORI), gen oporności na antybiotyki, miejsce wielokrotnego klonowania, promotor, marker selekcyjny i gen będący przedmiotem zainteresowania. Początek replikacji to miejsce, w którym rozpoczyna się replikacja. Gen oporności na antybiotyki pozwala bakteriom, które pobierają plazmid, przetrwać na płytkach w obecności określonego antybiotyku. Chociaż plazmidy są stosunkowo małymi fragmentami DNA, naukowcy muszą leczyć komórki gospodarza, aby umożliwić penetrację plazmidu przez błonę komórkową. W związku z tym efektywność przemiany jest bezpośrednio związana z porowatością błony gospodarza. Jednym z powszechnych podejść jest szok cieplny bakterii, które zostały potraktowane roztworem chlorku wapnia9. Bakterie, które nie zawierają plazmidu, nie przekształcają się, a zatem nie mają odporności, aby przetrwać na płytce i być widocznym. Wiele miejsc klonowania pomaga we wstawianiu DNA, zawierając miejsca dla enzymów restrykcyjnych do cięcia plazmidu, w którym można wprowadzić i zligować interesujący gen. Promotor napędza transkrypcję genu będącego przedmiotem zainteresowania. Jest znakowany markerem, zwykle białkiem fluorescencyjnym, takim jak białko zielonej fluorescencji (GFP), lub może być dodatkowym genem oporności na antybiotyki. Gen oporności na antybiotyki i inne markery selekcyjne pomagają nam określić, czy pobrane bakterie zawierają interesujący nas plazmid.
Skuteczne metody transformacji umożliwiły naukowcom wyizolowanie i sprofilowanie genów i produktów genowych oraz doprowadziły do wielu postępów w naukach przyrodniczych i medycynie, takich jak opracowanie skutecznych leków, generowanie genetycznie modyfikowanych upraw i zaawansowane narzędzia diagnostyczne10. Ponadto wraz z postępem technologicznym pojawiły się nowe metody transformacji. Na przykład klonowanie bramek umożliwia wprowadzanie wielu fragmentów DNA do różnych wektorów, a także przenoszenie sekwencji DNA między plazmidami11. Co więcej, zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)-Cas9 to technika edycji genów, która bezpośrednio modyfikuje nukleotydy w genomie i nie wymaga użycia plazmidów12. Po transformacji naukowcy często izolują i profilują interesujący nas gen i jego produkty. W związku z tym cały proces klonowania genetycznego otworzył nową dziedzinę manipulacji genetycznych. Dzięki klonowaniu genetycznemu naukowcy mogą manipulować bakteriami w celu wytwarzania dużych ilości określonych białek ludzkich, takich jak insulina, w leczeniu pacjentów z cukrzycą10. Klonowanie odgrywa również ważną rolę we współczesnym rolnictwie. Organizmy modyfikowane genetycznie (GMO) są bezpośrednim wynikiem klonowania genetycznego i transformacji bakteryjnej10. Na przykład naukowcy pracują nad generowaniem genetycznie modyfikowanych upraw z genami wiążącymi azot włączonymi do ich genomu, aby zwiększyć produkcję żywności i zmniejszyć zużycie nawozów, zmniejszając w ten sposób wpływ nawozów na gospodarkę i środowisko13. Podsumowując, transformacja bakteryjna jest pierwszym krokiem współczesnej biotechnologii i podstawą przyszłych odkryć badawczych.
Na początku XX wieku brytyjski bakteriolog Frederick Griffith pracował nad bakteriami wywołującymi zapalenie płuc Streptococcus pneumoniae. Przeprowadził prosty eksperyment z użyciem dwóch różnych szczepów. Jeden szczep jest znany jako szczep S ze względu na ochronną kapsułkę, która sprawia, że tworzone przez nią kolonie lub grudki wydają się gładkie, a także sprawiają, że są zjadliwe lub szkodliwe. Drugi był szczep R, wersja bakterii pozbawiona ochronnej kapsułki, co nadawało koloniom szorstki wygląd i sprawiało, że nie były zjadliwe.
Po pierwsze, Griffith wziął niektóre bakterie szczepu S i podgrzał je, wytwarzając zabitą termicznie wersję szczepu S. Następnie zebrał kilka myszy i podzielił je na cztery grupy. Pierwszej grupie wstrzyknął zjadliwy szczep S, a drugiej niezjadliwy szczep R. Podał trzeciej grupie zabity termicznie szczep S, a na koniec połączył ze sobą zabity termicznie szczep S i szczep R i wstrzyknął tę mieszankę do czwartej grupy. Zgodnie z oczekiwaniami myszy w pierwszej grupie zmarły, a te w drugiej i trzeciej grupie przeżyły. Ale ku zaskoczeniu Griffitha, myszy z ostatniej grupy również zdechły.
Kiedy opublikował swoje badania w 1928 roku, nazwał ten tajemniczy proces transformacją, ponieważ spekulował na temat obecności ukrytej zasady transformacji, która pozwoliła wcześniej niezjadliwemu szczepowi stać się śmiertelnym. Później, w 1943 roku, Avert, MacLeod i McCarty poinformowali, że tą zasadą transformacji był prawdopodobnie kwas dezoksyrybonukleinowy lub DNA, o którym teraz wiemy, że jest materiałem dziedzicznym. Zasadniczo to, co wydarzyło się w eksperymencie Griffitha, polegało na tym, że kiedy bakterie zostały połączone, część DNA wyciekła z zabitego termicznie szczepu S do komórek szczepu R, przekształcając te niezjadliwe bakterie i przekazując informację, aby stworzyć kapsułkę ochronną, zamieniając szczep R w zjadliwy, teraz zdolny do zabicia zwierząt w czwartej grupie.
Naukowcy opracowali znacznie prostszy sposób badania transformacji bakteryjnej, wykorzystując bakterie E. coli i małe, okrągłe pętle DNA zwane plazmidami. Zwykle plazmid używany w eksperymentach transformacyjnych zawiera gen o specjalnej funkcji, takiej jak oporność na antybiotyki. E. coli są doskonałym obiektem do transformacji, ponieważ mogą wykazywać właściwość zwaną kompetencją, zdolnością do pobierania DNA ze środowiska. Zasadniczo oznacza to, że w pewnych warunkach środowiskowych, takich jak szok chemiczny, elektryczny lub cieplny, ściana komórkowa E. coli może stać się tymczasowo przepuszczalna i umożliwić pobieranie DNA ze środowiska. Gdy plazmid znajdzie się wewnątrz E. coli, może albo przebywać w cytoplazmie nowej komórki gospodarza i być replikowany i wyrażany przez pokolenia wraz z genomem, albo może w pełni włączyć się do genomu gospodarza. Jeśli bakterie stracą plazmid w dowolnym momencie, komórka straci również swoją oporność na antybiotyki, dlatego naukowcy hodują bakterie w pożywce zawierającej antybiotyk, aby upewnić się, że jedynymi ocalałymi są te zawierające plazmid, który jest przedmiotem zainteresowania.
W tym laboratorium nauczysz się, jak przekształcać komórki E. coli z plazmidem zawierającym gen oporności na antybiotyki, jednocześnie ćwicząc sterylne techniki mikrobiologiczne.
