Transformacja bakteryjna
Tło
Na początku XX wieku zapalenie płuc było odpowiedzialne za dużą część zgonów z powodu chorób zakaźnych1. Aby opracować skuteczną szczepionkę przec…
Na początku XX wieku brytyjski bakteriolog Frederick Griffith pracował nad bakterią wywołującą zapalenie płuc Streptococcus pneumoniae. Przeprowadził prosty eksperyment z użyciem dwóch różnych szczepów. Jeden szczep jest znany jako szczep S ze względu na ochronną kapsułkę, która sprawia, że tworzone przez nią kolonie lub grudki wydają się gładkie, a także sprawiają, że są zjadliwe lub szkodliwe. Drugi był szczep R, wersja bakterii pozbawiona ochronnej kapsułki, co nadawało koloniom szorstki wygląd i sprawiało, że nie były zjadliwe.
Po pierwsze, Griffith wziął niektóre bakterie szczepu S i podgrzał je, wytwarzając zabitą termicznie wersję szczepu S. Następnie zebrał kilka myszy i podzielił je na cztery grupy. Pierwszej grupie wstrzyknął zjadliwy szczep S, a drugiej niezjadliwy szczep R. Podał trzeciej grupie zabity termicznie szczep S, a na koniec połączył ze sobą zabity termicznie szczep S i szczep R i wstrzyknął tę mieszankę do czwartej grupy. Zgodnie z oczekiwaniami myszy w pierwszej grupie zmarły, a te w drugiej i trzeciej grupie przeżyły. Ale ku zaskoczeniu Griffitha, myszy z ostatniej grupy również zdechły.
Kiedy opublikował swoje badania w 1928 roku, nazwał ten tajemniczy proces transformacją, ponieważ spekulował na temat obecności ukrytej zasady transformacji, która pozwoliła wcześniej niezjadliwemu szczepowi stać się śmiertelnym. Później, w 1943 roku, Avert, MacLeod i McCarty poinformowali, że tą zasadą transformacji był prawdopodobnie kwas dezoksyrybonukleinowy lub DNA, o którym teraz wiemy, że jest materiałem dziedzicznym. Zasadniczo to, co wydarzyło się w eksperymencie Griffitha, polegało na tym, że kiedy bakterie zostały połączone, część DNA wyciekła z zabitego termicznie szczepu S do komórek szczepu R, przekształcając te niezjadliwe bakterie i przekazując informację, aby stworzyć kapsułkę ochronną, zamieniając szczep R w zjadliwy, teraz zdolny do zabicia zwierząt w czwartej grupie.
Naukowcy opracowali znacznie prostszy sposób badania transformacji bakteryjnej, wykorzystując bakterie E. coli i małe, okrągłe pętle DNA zwane plazmidami. Zwykle plazmid używany w eksperymentach transformacyjnych zawiera gen o specjalnej funkcji, takiej jak oporność na antybiotyki. Bakterie E. coli są doskonałym obiektem transformacji, ponieważ mogą wykazywać właściwość zwaną kompetencją, zdolnością do pobierania DNA ze środowiska. Zasadniczo oznacza to, że w pewnych warunkach środowiskowych, takich jak szok chemiczny lub elektryczny lub cieplny, ściana komórkowa E. coli może stać się tymczasowo przepuszczalna i umożliwić pobieranie DNA ze środowiska. Gdy plazmid znajdzie się wewnątrz E. coli, może albo przebywać w cytoplazmie nowej komórki gospodarza i być replikowany i wyrażany przez pokolenia wraz z genomem, albo może w pełni włączyć się do genomu gospodarza. Jeśli bakterie stracą plazmid w dowolnym momencie, komórka straci również swoją oporność na antybiotyki, dlatego naukowcy hodują bakterie w pożywce zawierającej antybiotyk, aby upewnić się, że jedynymi ocalałymi są te zawierające plazmid, który jest przedmiotem zainteresowania.
W tym laboratorium nauczysz się, jak przekształcać komórki E. coli w plazmid zawierający gen oporności na antybiotyki, jednocześnie ćwicząc sterylne techniki mikrobiologiczne.
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Na początku XX wieku brytyjski bakteriolog Frederick Griffith pracował nad bakterią wywołującą zapalenie płuc Streptococcus pneumoniae. Przeprowadził prosty eksperyment z użyciem dwóch różnych szczepów. Jeden szczep jest znany jako szczep S ze względu na ochronną kapsułkę, która sprawia, że tworzone przez nią kolonie lub grudki wydają się gładkie, a także sprawiają, że są zjadliwe lub szkodliwe. Drugi był szczep R, wersja bakterii pozbawiona ochronnej kapsułki, co nadawało koloniom szorstki wygląd i sprawiało, że nie były zjadliwe.
Po pierwsze, Griffith wziął niektóre bakterie szczepu S i podgrzał je, wytwarzając zabitą termicznie wersję szczepu S. Następnie zebrał kilka myszy i podzielił je na cztery grupy. Pierwszej grupie wstrzyknął zjadliwy szczep S, a drugiej niezjadliwy szczep R. Podał trzeciej grupie zabity termicznie szczep S, a na koniec połączył ze sobą zabity termicznie szczep S i szczep R i wstrzyknął tę mieszankę do czwartej grupy. Zgodnie z oczekiwaniami myszy w pierwszej grupie zmarły, a te w drugiej i trzeciej grupie przeżyły. Ale ku zaskoczeniu Griffitha, myszy z ostatniej grupy również zdechły.
Kiedy opublikował swoje badania w 1928 roku, nazwał ten tajemniczy proces transformacją, ponieważ spekulował na temat obecności ukrytej zasady transformacji, która pozwoliła wcześniej niezjadliwemu szczepowi stać się śmiertelnym. Później, w 1943 roku, Avert, MacLeod i McCarty poinformowali, że tą zasadą transformacji był prawdopodobnie kwas dezoksyrybonukleinowy lub DNA, o którym teraz wiemy, że jest materiałem dziedzicznym. Zasadniczo to, co wydarzyło się w eksperymencie Griffitha, polegało na tym, że kiedy bakterie zostały połączone, część DNA wyciekła z zabitego termicznie szczepu S do komórek szczepu R, przekształcając te niezjadliwe bakterie i przekazując informację, aby stworzyć kapsułkę ochronną, zamieniając szczep R w zjadliwy, teraz zdolny do zabicia zwierząt w czwartej grupie.
Naukowcy opracowali znacznie prostszy sposób badania transformacji bakteryjnej, wykorzystując bakterie E. coli i małe, okrągłe pętle DNA zwane plazmidami. Zwykle plazmid używany w eksperymentach transformacyjnych zawiera gen o specjalnej funkcji, takiej jak oporność na antybiotyki. Bakterie E. coli są doskonałym obiektem transformacji, ponieważ mogą wykazywać właściwość zwaną kompetencją, zdolnością do pobierania DNA ze środowiska. Zasadniczo oznacza to, że w pewnych warunkach środowiskowych, takich jak szok chemiczny lub elektryczny lub cieplny, ściana komórkowa E. coli może stać się tymczasowo przepuszczalna i umożliwić pobieranie DNA ze środowiska. Gdy plazmid znajdzie się wewnątrz E. coli, może albo przebywać w cytoplazmie nowej komórki gospodarza i być replikowany i wyrażany przez pokolenia wraz z genomem, albo może w pełni włączyć się do genomu gospodarza. Jeśli bakterie stracą plazmid w dowolnym momencie, komórka straci również swoją oporność na antybiotyki, dlatego naukowcy hodują bakterie w pożywce zawierającej antybiotyk, aby upewnić się, że jedynymi ocalałymi są te zawierające plazmid, który jest przedmiotem zainteresowania.
W tym laboratorium nauczysz się, jak przekształcać komórki E. coli w plazmid zawierający gen oporności na antybiotyki, jednocześnie ćwicząc sterylne techniki mikrobiologiczne.
View the full transcript and gain access to JoVE Lab Manual videos
Q1: What was Frederick Griffith's transformation experiment and why was it significant?
Griffith studied two Streptococcus pneumoniae strains: the virulent S strain with a protective capsule and the non-virulent R strain without it. When he combined heat-killed S strain with live R strain and injected mice, they died unexpectedly. This discovery of bacterial transformation in 1928 revealed that genetic material could transfer between bacteria, fundamentally changing our understanding of heredity and laying the foundation for modern genetic engineering.
Q2: How did scientists identify DNA as the transforming principle in Griffith's experiment?
In 1943, Avery, MacLeod, and McCarty demonstrated that the transforming principle was desoxyribonucleic acid, or DNA, the heredity material. They showed that DNA leaked from heat-killed S strain bacteria into R strain cells, carrying genetic information that encoded the protective capsule. This discovery proved DNA was responsible for passing hereditary traits between bacterial cells.
Q3: What are plasmids and why are they useful for bacterial transformation in the laboratory?
Plasmids are small, circular loops of double-stranded DNA found in bacterial cytoplasm that replicate independently from chromosomal DNA. They often carry genes for beneficial traits like antibiotic resistance. Scientists use plasmids as vectors to introduce foreign DNA into bacteria like E. coli because bacteria can easily take in exogenous genetic material and rapidly amplify it, making plasmids ideal tools for genetic engineering research.
Q4: What is bacterial competence and how does it enable DNA uptake?
Competence is the ability of bacteria like E. coli to take up DNA from their environment. Under specific conditions—such as chemical treatment with calcium chloride, electrical shock, or heat shock—the bacterial cell wall becomes temporarily permeable. This allows plasmids and other DNA molecules to cross the membrane and enter the cell, where they can be replicated and expressed alongside the bacterial genome.
Q5: Why do scientists grow transformed bacteria on antibiotic-containing media?
Scientists use antibiotic-containing media as a selection method to identify successfully transformed cells. Plasmids typically carry antibiotic resistance genes, so only bacteria that have taken up the plasmid survive on these plates. Non-transformed bacteria lack the resistance gene and die, ensuring that visible colonies contain the plasmid of interest and have been successfully transformed.
Q6: What happens to a transformed bacterium if it loses its plasmid?
If a transformed bacterium loses its plasmid, it also loses the genes carried on that plasmid, including antibiotic resistance. The cell reverts to its original phenotype and can no longer survive on antibiotic-containing media. This is why continuous selection on antibiotic plates is necessary to maintain populations of successfully transformed bacteria carrying the plasmid of interest.
Q7: How does bacterial transformation using plasmids differ from Griffith's original experiment?
Griffith's experiment involved natural DNA transfer between bacterial strains, while modern bacterial transformation using plasmids is a controlled laboratory process. Scientists artificially introduce recombinant plasmids containing specific genes into competent E. coli cells using heat shock or chemical treatment. This allows precise genetic manipulation and is the foundation for bacterial transformation using plasmids procedure in contemporary genetic engineering and biotechnology research.