Przedstawiono procedurę chirurgicznego wprowadzenia komórek śródbłonka pochodnych z embrionalnych komórek macierzystych do niedokrwionej kończyny dolnej, z zastosowaniem nieinwazyjnego śledzenia za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Komórki śródbłonka pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych w leczeniu niedokrwienia kończyny dolnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Peripheralna choroba tętnic (PAD) wynika z zwężenia tętnic obwodowych doprowadzających utlenowaną krew i składniki odżywcze do nóg i stóp. Patologia ta powoduje takie objawy, jak przerywająca utykanie (ból podczas chodzenia), bolesne owrzodzenia niedokrwienne, a nawet zagrażającą kończynie gangrenę. Przyjmuje się powszechnie, że śródbłonek naczyniowy, czyli jednowarstwowa warstwa komórek endotelialnych wyścielająca powierzchnię światła wszystkich naczyń krwionośnych i limfatycznych, odgrywa dominującą rolę w homeostazie i regeneracji naczyniowej. W związku z tym regeneracja śródbłonka oparta na komórkach macierzystych może stanowić obiecujące podejście w leczeniu PAD.
W tym filmie demonstrujemy transplantację komórek śródbłonka pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych (ESC) w celu leczenia jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej jako modelu PAD, a następnie nieinwazyjne śledzenie homingu i przeżywalności komórek za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Opisane zostaną konkretne materiały i procedury dotyczące dostarczania komórek oraz obrazowania. Niniejszy protokół opiera się na innej publikacji autorstwa Niiyama i wsp. w zakresie indukcji niedokrwienia kończyny tylnej.1
Protokół
1. Różnicowanie mysich ESC w komórki śródbłonka
- Protokół różnicowania ESC w komórki śródbłonka został opisany w innej publikacji i nie stanowi głównego celu niniejszego protokołu2,3. W skrócie, komórkom pozwala się na różnicowanie, a następnie komórki wykazujące pozytywny wynik dla markerów śródbłonka, takich jak CD31 lub naczyniowa kadheryna śródbłonka (VE-cadherin), są oczyszczane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS).
2. Konstrukcja podwójnego genu reporterowego fuzyjnego oraz transdukcja lentiwirusowa
- Bioluminescencję można wykorzystać do śledzenia komórek zmodyfikowanych w celu ekspresji genów reporterowych, takich jak lucyferaza świetlika (fluc). W tej aplikacji nasze komórki zawierają zarówno fluc, jak i gen fuzyjny wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) pod kontrolą wewnętrznego promotora ubikwityny. W celu modyfikacji komórek, do stabilnej transdukcji komórek po różnicowaniu można użyć lentiwirusowego wektora transgenicznego pFU-FG opracowanego w naszym laboratorium, który niesie gen reporterowy fuzji fluc-eGFP i zawiera kluczowe zoptymalizowane elementy genetyczne, aby spełnić kryteria bezpieczeństwa biologicznego oraz zwiększyć wydajność transdukcji. Konstrukt fuzyjny ten umożliwia śledzenie przeszczepionych komórek zarówno za pomocą bioluminescencji, jak i fluorescencji. Procedura generowania cząsteczek wirusa, transdukcji i produkcji znakowanych komórek wykazujących ekspresję genów reporterowych została opisana w innym opracowaniu4.
3. Transplantacja komórek śródbłonka pochodzących z ESC do niedokrwionej kończyny tylnej
- Procedurę rozpoczyna się od przygotowania myszy z indukowanym niedokrwieniem kończyny tylnej do transplantacji komórek. W tym celu należy umieścić mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej 1–3% izofluranu w 100% tlenie przy przepływie 1L/min.
- Pozostawić mysz w komorze indukcyjnej do momentu utraty reakcji na bodźce zewnętrzne, a następnie wyjąć zwierzę z komory.
- Następnie zwierzę należy ułożyć na stole operacyjnym w pozycji grzbietnej i podłączyć do ciągłego przepływu 1–3% izofluranu w 100% tlenie przy przepływie 1L/min.
- Skórę kończyny tylnej przemyć trzykrotnie, naprzemiennie używając betadyny i alkoholu.
- Po oczyszczeniu skóry przygotować milion komórek śródbłonka pochodzących z ESC w 30 μL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Komórki te należy nabrać do igły o rozmiarze 28 G.
- Po przygotowaniu komórek należy delikatnie unieść i wyprostować kończynę tylną, aby lepiej uwidocznić położenie mięśnia brzuchatego łydki. Przy wyprostowanej nodze wprowadzić igłę przez skórę do leżącego poniżej mięśnia, uważając, aby nie dotrzeć do kości. Powoli i ostrożnie wstrzyknąć 30 μL zawiesiny komórek do mięśnia brzuchatego łydki. W przypadku iniekcji domięśniowej 30 μL jest objętością bliską granicy możliwości wstrzyknięcia. Dlatego zaleca się stosowanie strzykawek insulinowych o rozmiarze 28 G, ponieważ w naszym doświadczeniu eliminują one utratę objętości w igłach strzykawki.
- Po zakończeniu iniekcji przenieść mysz do klatki regeneracyjnej i monitorować ją w sposób ciągły do momentu wybudzenia. Pozostawić zwierzę do regeneracji na kilka godzin, a następnie przystąpić do obrazowania bioluminescencyjnego in vivo przeszczepionych komórek.
4. Obrazowanie bioluminescencyjne komórek śródbłonka pochodzących z ESC in vivo
- Przeszczepione komórki śródbłonka pochodzące z ESC zostały zmodyfikowane tak, aby wykaziwały ekspresję zarówno genu fluc, jak i genu fuzyjnego eGFP pod kontrolą wewnętrznego promotora ubikwityny. Dzięki temu bioluminescencję można wykorzystać do śledzenia komórek w niedokrwionej kończynie tylnej.
- Aby rozpocząć ten etap, należy włączyć system obrazowania bioluminescencyjnego oraz oprogramowanie do akwizycji obrazu Living Image. Następnie należy zainicjować system akwizycji i określić wymiary pola widzenia.
- Następnie na skrzynce obrazującej należy umieścić czarny matowy papier w celu pochłaniania emisji tła.
- Po przygotowaniu skrzynki obrazującej należy umieścić mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej 1–3% izofluranu w tlenie przy przepływie 1 L/min. Myszy należy pozostawić w komorze indukcyjnej do momentu, aż przestanie ona reagować na bodźce zewnętrzne. Następnie należy wyjąć zwierzę z komory indukcyjnej.
- W razie potrzeby należy usunąć owłosienie z obu kończyn tylnych za pomocą strzygarki elektrycznej.
- Do otrzewnej należy wstrzyknąć 10 μL D-lucyferyny na gram masy ciała. D-lucyferynę przygotowuje się wcześniej w postaci przefiltrowanych roztworów zapasowych o stężeniu 15 mg/mL w PBS.
- Po wstrzyknięciu lucyferyny zwierzę należy umieścić w pozycji grzbietowej w skrzynce obrazującej na czarnym papierze, podłączając je do ciągłego przepływu izofluranu.
- Umieszczanie zwierzęcia w skrzynce obrazującej i podłączanie do izofluranu.
- Należy rozpocząć akwizycję obrazów przez 10–60 sekund, aby określić optymalny czas ekspozycji, przy którym obraz nie będzie przesycony. Jeśli obraz stanie się przesycony, należy skrócić czas ekspozycji. Jeśli sygnał bioluminescencyjny jest bardzo słaby, należy wydłużyć czas ekspozycji.
- Stosując optymalny czas ekspozycji, należy kontynuować akwizycję zdjęć co 1–3 minuty, aż sygnał osiągnie maksimum, a następnie zacznie słabnąć. Po zakończeniu akwizycji należy zapisać plik.
- Aby przeanalizować dane, należy zaznaczyć obszary zainteresowania (ROI), które obejmują miejsce wstrzyknięcia. Jako kontrolę negatywną można zaznaczyć podobny ROI dla nogi nieoperowanej. Za pomocą oprogramowania należy zmierzyć całkowitą radiancję dla ROI w każdym punkcie czasowym, wyrażoną w jednostkach fotonów/sekunda/cm2/steradian (p/s/cm2/sr). W końcowych danych należy wykorzystać wartość maksymalną. Dane można również wyeksportować do arkusza Excel w celu późniejszego wykorzystania.
- Po zgromadzeniu wszystkich danych zwierzę należy przenieść do klatki rekonwalescencyjnej i stale monitorować do momentu przebudzenia.
- Należy powtórzyć tę procedurę, aby śledzić komórki w czasie.
- W wybranym punkcie czasowym zwierzę można poddać eutanazji w celu oceny funkcji tkanek.
5. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywny obraz bioluminescencji przeszczepionych komórek w lewym niedokrwionym kończynie tylnej przedstawiono na rysunku 1. Podczas akwizycji bioluminescencji intensywność będzie wzrastać w czasie, a maksymalną wartość uzyskaną w trakcie tego procesu należy podać jako wartość końcową.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
ESC są obiecującym źródłem komórek do leczenia niedokrwienia tkanek ze względu na ich plastyczność różnicowania oraz zdolność do tworzenia linii komórkowych obejmujących wszystkie trzy listki zarodkowe, w tym komórki śródbłonka. Aby uniknąć kwestii etycznych związanych z ESC, alternatywnym źródłem pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą być indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poza ESC można wykorzystać komórki macierzyste dorosłych, takie jak komórki progenitorowe śródbłonka (EPC) i hematopoetyc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Autorzy dziękują Andrei Axtell, dr. med. Satoshi Itoh, dr. med. Jeffowi Velottcie, Grantowi Hoytowi, dr. med. Robertowi C. Robbinsowi, dr. med. Jin Yu, dr. Timowi Doyle'owi oraz Stanford Small Animal Imaging Core za pomoc techniczną. Autorzy dziękują również firmie A.M. Bickford, Inc. za udostępnienie sprzętu weterynaryjnego. Niniejsze badania były finansowane z grantów badawczych National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), California Tobacco Related Disease Research Program Uniwersytetu Kalifornijskiego (15IT-0257 i 1514RT-0169) oraz California Institute for Regenerative Medicine (RS1-00183).
N.H. jest wspierany stypendium z American Heart Association. can Heart Association.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Narzędzia chirurgiczne | Narzędzie | Fine Science Tools | ||
| Igła strzykawki | Narzędzie | BD Biosciences | Preferowana jest strzykawka insulinowa 28G | |
| Fosforanowy bufor solny (PBS) | Odczynnik | Invitrogen | ||
| D-lucyferyna | Odczynnik | Biosynth International, Inc | Należy wcześniej przygotować D-lucyferynę w postaci filtrowanych roztworów zapasowych o stężeniu 15 mg/mL w PBS | |
| System obrazowania bioluminescencyjnego IVIS 200 oraz oprogramowanie do akwizycji danych | Sprzęt |  Xenogen Corporation |
Bibliografia
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. JoVE. , (2008).
- Levenberg, S., Golub, J. S., Amit, M., Itsakovitz-Eldor, J., Langer, R. Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4391-4396 (2002).
- Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., Nakao, K., Nishikawa, S. Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors. Nature. 408, 926-926 (2000).
- De, A., Yaghoubi, S. S., Gambhir, S. S. Applications of lentiviral vectors in noninvasive molecular imaging. Methods Mol Biol. 433, 177-202 (2008).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Med. 4, 245-247 (1998).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Huang, N. F., Lee, R. J., Li, S. Chemical and physical regulation of stem cells and progenitor cells: potential for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1809-1823 (2007).
- Cao, F., Lin, S., Xie, X., Ray, P., Patel, M., Zhang, X., Drukker, M., Dylla, S. J., Connolly, A. J., Chen, X., Weissman, I. L., Gambhir, S. S., Wu, J. C. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113, 1005-1114 (2006).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells. J Vis Exp. , (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
