Wytwarzanie elektrod amperometrycznych

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania elektrod z włókna węglowego. Elektrody te są następnie wykorzystywane do detekcji uwalniania katecholamin z pęcherzyków za pomocą amperometrii włóknem węglowym.

Streszczenie

Elektrody z włókna węglowego są kluczowe dla detekcji uwalniania katecholamin z pęcherzyków w pojedynczych komórkach podczas pomiarów amperometrycznych. W niniejszym opracowaniu opisujemy techniki niezbędne do wytworzenia elektrod o niskim poziomie szumów (<0,5 pA). Techniki te zostały zmodyfikowane na podstawie opisów opublikowanych przez poprzednich badaczy (1,2). Elektrody wykonuje się poprzez przygotowanie włókien węglowych i indywidualne wprowadzanie ich do każdej rurki kapilarnej z wykorzystaniem próżni z filtrem w celu zasysania włókna. Następnie rurkę kapilarną z włóknem przeciąga się w wyciągaczu do elektrod, tworząc dwie połowy, z których każda posiada cienką, ostrą końcówkę. Elektrody zanurza się w gorącej, płynnej żywicy epoksydowej zmieszanej z utwardzaczem, aby stworzyć uszczelnienie epoksydowo-szklane. Na koniec elektrody umieszcza się w piekarniku w celu utwardzenia żywicy. Ostrożne obchodzenie się z elektrodami jest krytyczne dla zapewnienia ich powtarzalnego wykonania i braku uszkodzeń. Niniejszy protokół przedstawia sposób wytwarzania i przycinania elektrod amperometrycznych do rejestracji z pojedynczych komórek.

Protokół

Część 1: Przygotowanie włókna węglowego

1. Odetnij pęk włókien węglowych (stosujemy włókna o średnicy 7μm) o długości wynoszącej około 1,25 X długości pipety kapilarnej.
2. Usuń apreturę, gotując około 100 mL acetonu w naczyniu i umieszczając włókna w gorącym, wrzącym acetonie na 30 minut lub dłużej.
3. Wyjmij włókna z ciepłego acetonu i przenieś je do czystego zlewki zawierającej 50-100 mL świeżego acetonu.
4. Wysusz włókna, kładąc pęk na otwartej szalce Petriego o średnicy 150 mm i pozostawiając do wyschnięcia na powietrzu przez noc.

Część 2: Wypalanie końcówek szklanych kapilar

1. Wypoleruj ogniowo każdą rurkę kapilarną (stosujemy kapilary do mikrohematokrytu o średnicy zewnętrznej 1,5mm, średnicy wewnętrznej 1,3mm i długości 7,5cm), trzymając rurkę w środku pęsetą i wystawiając koniec na działanie płomienia. Obracaj rurkę około 3 razy podczas przebywania w płomieniu.
2. Odwróć rurkę i umieść przeciwległy koniec w płomieniu, ponownie obracając ją 3 razy.
3. Umieść wypolerowane ogniowo rurki w szklanym naczyniu i przełóż do pieca do czasu, aż będą gotowe do wypełnienia włóknami węglowymi.

Część 3: Przewlekanie włókna węglowego do rurki kapilarnej

1. Zgodnie z opisami Machado et al. (2008) oraz Mundroff and Wightman (2002), wciągnij włókno do szklanej rurki, używając plastikowego przewodu podłączonego do pompy próżniowej z filtrem.
2. Odetnij włókno za pomocą skalpela. Pozostaw ¼ cala włókna poza rurką.

Część 4: Wytwarzanie pipet światłowodowych w wyciągaczu elektrod

1. Umieść rurkę kapilarną w wyciągaczu elektrod (używamy modelu PP-830 firmy Narishige Japan) i dokręć pokrętła, aby unieruchomić kapilarę.
2. Użyj przełączników, aby wykonać dwa wyciągnięcia, stosując optymalne ustawienia urządzenia.
3. Gdy pipeta zostanie wyciągnięta i podzielona na pół, rozdziel obie części, przecinając gołe włókno w centrum za pomocą nożyczek.
4. Wyjmij każdą z połówek elektrody i pociągnij za wystające włókno, aby przełamać szklaną uszczelkę. Przytnij włókno nożyczkami tak, aby poza rurką pozostało jedynie 1/8 inch włókna.
5. Powtarzaj kroki 1-4, aż do przygotowania około 16 elektrod włóknistych.

Część 5: Przygotowanie uszczelnienia z epoksydowego szkła

1. Podgrzać przygotowaną wcześniej alikwot żywicy epoksydowej na płycie grzejnej ustawionej na 55°C przez 6 minut w dygestorium.
2. Podczas podgrzewania żywicy, owinąć ok. 16 wyciągniętych elektrod w pęk za pomocą taśmy.
3. Po 6-minutowym podgrzaniu żywicy Epon, dodać 0,7 g MPDA do gorącej żywicy Epon (14%, w/v). Wymieszać, obracając fiolką.
4. Zanurzyć pęk elektrod w gorącym roztworze żywicy epoksydowej z utwardzaczem. Po około 20 s odpowiednia ilość żywicy wpłynie do szklanych końcówek dzięki działaniu kapilarnemu.
5. Rozwiązać pęk, ułożyć elektrody na tekturze z nacięciami i umieścić tackę w piekarniku ustawionym na 100°F.
6. Po co najmniej 48 godzinach zbadać każdą elektrodę pod mikroskopem stereoskopowym. Odrzucić elektrody, które nie wypełniły się żywicą, mają zmiażdżoną końcówkę, zawierają więcej niż jedno włókno itp. Po sprawdzeniu każdej elektrody umieścić je z powrotem w uchwycie tekturowym i ponownie włożyć do piekarnika. Elektrody są zazwyczaj zdatne do użytku przez około 1 miesiąc od momentu wykonania.

Część 6: Cięcie włókna węglowego

1. Ostrożnie umieść elektrodę z włókna węglowego na szkiełku przedmiotowym za pomocą taśmy teflonowej.
2. Obejrzyj końcówkę pod mikroskopem stereoskopowym.
3. Używając czystego ostrza skalpela, wykonaj cięcie prostopadłe do włókna węglowego, aby uzyskać płaską i czystą powierzchnię umożliwiającą przykładanie włókna do komórki.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje sposób wytwarzania i przycinania elektrod amperometrycznych. Podczas pomiarów amperometrycznych elektrodę z włókna węglowego umieszcza się przy powierzchni komórki wydzielniczej. Aktywność egzocytarną obserwuje się w postaci skoków amperometrycznych, które wskazują na prąd elektrochemiczny wywołany transferem elektronów po utlenieniu katecholamin. Dzięki praktyce w wykonywaniu i przycinaniu elektrod amperometrycznych można znacznie zredukować poziom szumów w porównaniu do wielu dostępnych komer...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Utwardzacz epoksydowy, płatki 1,3-fenylenodiaminy	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P23954-100G04 716AJ	Aliquoty przechowuje się w eksykatore i nie należy ich wystawiać na działanie światła.
Włókna węglowe	Materiał	Goodfellow	C005725
Kapilary do mikrohematokrytu	Materiał	Fisher Scientific	NC9836768
Żywica epoksydowa	Odczynnik	Miller-Stephenson	Epon Resin 828
Mikroskop stereotypowy	Instrument
Wytwornica elektrod (puller)	Instrument	Narishige International	PP-830	1. wyciągnięcie = 24.8 °C; 2. wyciągnięcie = 62.7 °C
Piec	Instrument			ustawiony na 100 °F.
Płyta grzewcza	Instrument			ustawiona na 55 °C