Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy A

Podsumowanie

Genom wirusa grypy A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). W artykule opisano oczyszczanie gradientu glicerolu i wizualizację vRNP wirusa grypy A za pomocą gradientu glicerolu i jego transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

Genom wirusa grypy A składa się z ośmiu jednoniciowych cząsteczek RNA o ujemnym sensie, indywidualnie upakowanych z wieloma kopiami nukleoproteiny grypy A (NP) w cząsteczki rybonulceoproteiny wirusa (vRNP). vRNP wirusa grypy są zamknięte w otoczce wirusa. Jednak podczas wnikania do komórki te kompleksy vRNP są uwalniane do cytoplazmy, gdzie uzyskują dostęp do maszynerii transportu jądrowego gospodarza. W celu zbadania importu jądrowego vRNP wirusa grypy i replikacji genomu grypy, przydatna jest praca z wyizolowanymi vRNP, aby inne składniki wirusa nie zakłócały tych procesów. W tym miejscu opisujemy procedurę oczyszczania tych vRNP z wirusa grypy A. Procedura rozpoczyna się od rozbicia wirionu grypy A za pomocą detergentów w celu uwolnienia kompleksów vRNP z wirionu otoczkowego. vRNP są następnie oddzielane od innych składników wirionu grypy A w nieciągłym gradiencie glicerolu o 33-70% przez sedymentację prędkościową. Frakcje uzyskane z gradientu glicerolu są następnie analizowane za pomocą SDS-PAGE po zabarwieniu kolorem Coomassie blue. Frakcje pikowe zawierające NP są następnie łączone razem i zagęszczane przez odwirowanie. Po zagęszczeniu integralność vRNP jest weryfikowana poprzez wizualizację vRNP za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej po barwieniu ujemnym. Oczyszczanie gradientowe glicerolu jest modyfikacją tego z Kemler i in. (1994)¹, a barwienie ujemne zostało przeprowadzone przez Wu i in. (2007). ^{cyfra arabska}

Protokół

Część 1: Zakłócenie wirusa grypy A

1. Dodać 750 μl buforu MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) do jednej probówki wirówkowej z poliwęglanu Beckman (11 mm x 34 mm) zaprojektowanej tak, aby pasowała do wirnika TLA-120.2 do użytku w ultrawirówce Beckman Optima Max-E.
2. Dodać 500 μl wirusa grypy A (szczep H3N2 X-31 A/AICHI/68; 2 mg/ml) do tej probówki. Wymieszać wirusa z buforem MNT, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
3. Wirować przez 10 minut w temperaturze 109 000 x g, 4 °C, w wirówce Beckman Optima Max-E z wirnikiem TLA-120.2.
4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu rozrywającego (100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 5% (w/v) glicerolu, 50 mM oktyloglukozydu, 10 mg/ml lizolecytyny, 1,5 mM ditiotreitolu, 100 mM MES, pH 5,5).
5. Energicznie mieszać, a następnie wstrząsać w temperaturze 31 °C przez 20 minut w termomikserze eppendorf.

Część 2: Wirowanie prędkości osadu w gradiencie glicerolu

1. Przygotuj gradient glicerolu, umieszczając następujące ilości glicerolu w ultraprzezroczystej probówce wirówkowej Beckman (13 mm x 51 mm): 1 ml glicerolu 70% (v/v), 0,75 ml 50% glicerolu, 0,375 ml 40% glicerolu i 1,8 ml 33% glicerolu. Roztwory glicerolu wytwarza się przez zmieszanie czystego glicerolu z buforem NM (150 mM NaCl, 50 mM MES, pH 5,5). Przygotuj również probówkę balansową zawierającą zarówno glicerol, jak i bufor.
2. Ponownie zawiruj rozerwaną próbkę wirusa i załaduj ją na gradient glicerolu.
3. Wirować gradient przez 3,75 godziny przy 217 000 x g, 4 °C, w wirniku wahliwym Beckman MLS-50.
4. Po zakończeniu wirowania należy ręcznie zebrać 250 μl podwielokrotności gradientu, zaczynając od góry probówki. Frakcje należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C.

Część 3: Analiza frakcji gradientu glicerolu za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS

1. Usunąć 20 μl z każdej frakcji do świeżej probówki.
2. Dodać 5 μl 5 razy więcej bufora do próbek SDS-PAGE.
3. Podgrzewać do 95 °C przez 5 minut.
4. Odkręć krótko próbki i załaduj je do 10% żelu poliakrylamidowego, a następnie umieść markery masy cząsteczkowej w jednym z dołków.
5. Umieść próbki na żelu, aż barwnik ładujący błękit bromfenolowy zbliży się do dna żelu.
6. Odbarwić żel kolorem Coomassie blue.

Część 4: Stężenie frakcji vRNP

1. Wybierz frakcje glicerolu zawierające głównie NP, połącz je i rozprowadź w dwóch probówkach wirówkowych z poliwęglanu Beckman (11 mm x 34 mm).
2. Napełnij każdą probówkę ultraczystą wodą nasączoną pirowęglanem dietylu (DEPC) i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.
3. Wirować przez 4,5 godziny w temperaturze 157 000 x g, 4°C, w wirniku Beckman TLA-120.2.
4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl wody uzdatnionej DEPC.
5. W razie potrzeby można zmierzyć A₂₈₀ stężonych vRNP. Ponieważ NP jest głównym składnikiem obecnym we frakcjach zbiorczych, oszacowanie molowości NP można obliczyć na podstawie jego współczynnika ekstynkcji wynoszącego 55 350 ^{M-1 cm-1} (określonego za pomocą ProtParam³).
6. Podwielokrotnić oczyszczone vRNP i przechowywać je zamrożone w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

Część 5: Negatywne barwienie vRNP

1. Rozcieńczyć 1 μl oczyszczonego vRNP w 9 μl świeżo przygotowanego i dwukrotnie przefiltrowanego buforu MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5). Inne są również odpowiednie do rozcieńczania vRNP i mycia siatki próbki (krok 5.5), ale nie należy używać PBS, jeśli octan uranylu jest używany do barwienia ujemnego.
2. Jarzenie rozładowuje siatkę próbki (miedź TEM) uprzednio pokrytą parlodionem i folią węglową przez 30 sekund.
3. Przytrzymaj świeżo rozżarzoną siatkę próbki pęsetą i nałóż 5 μl kropli rozcieńczonego vRNP na siatkę próbki.
4. Pozostaw kroplę próbki na siatce na 8 minut.
5. Czekając, umieść mały pasek Parafilmu na ławce i dozuj 2 krople zawierające po 10 μl buforu MNT (do umycia siatki) oraz 80 μl kropli świeżo przygotowanego roztworu barwiącego (1% molibdenianu amonu lub 1% octanu uranylu) na Parafilm.
6. Po 8 minutach adsorpcji odciąć część roztworu próbki z siatki próbki za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej (pociętej na trójkąty). Nie pozwól, aby siatka próbki wyschła.
7. Przemyć siatkę próbki w 2 kroplach zawierających po 10 μl buforu MNT przez łączny czas 1 minuty. Odbywa się to poprzez ostrożne opuszczenie siatki próbki na kropli, a następnie odprowadzenie części roztworu próbki z siatki próbki za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej (nie dopuszczając do wyschnięcia siatki próbki).
8. Natychmiast po odsączeniu ostatniej kropli buforu z siatki próbki, całkowicie zanurz siatkę próbki w kropli plamy i odczekaj 1 minutę.
9. Całkowicie odsącz roztwór plamy z siatki próbki za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej.
10. Pozostawić siatkę próbki do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut przed obserwacją pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.

Część 6: Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1

Ponieważ grypa A NP (~56 kDa) jest głównym białkiem występującym w kompleksach rybonukleoprotein wirusa, pasmo NP jest zazwyczaj najsilniejszym pasmem we frakcjach zawierających vRNP (Rysunek 1). Oprócz NP, każdy vRNP grypy zawiera również kopię kompleksu trimerycznej polimerazy RNA (o masie cząsteczkowej 82, 86 i 86,5 kDa). Mogą, ale nie muszą, być widoczne przez niebieskie zabarwienie Coomassie, ponieważ ich obfitość jest niska w porównaniu z NP. Polimerazy można jednak wykryć, jeśli zamiast niebieskiego barwienia Commassie zostanie wykonane srebrne barwienie żelu. Białko macierzy grypy M1 (~ 28 kDa) powinno być minimalnie obecne we frakcjach, w których obecne są pikowe frakcje białka NP.

Rysunek 2

Ujemnie barwione vRNP, jak to uwidoczniono pod transmisyjną mikroskopią elektronową, powinny dać vRNP przypominające cząstki w kształcie prętów o zmiennej długości, które mają około 30 nm do 120 nm długości (Rysunek 2a). Oligomeryczny NP jest zorganizowany jako łańcuch cząsteczek NP, który jest dalej zawinięty w strukturę podwójnej helisy, więc czasami można zobaczyć pętle na obu końcach tych cząstek w kształcie prętów (ryc. 2b).

Dyskusja

Oczyszczanie vRNP opiera się na procedurze opisanej przez Kemlera i wsp. (1994). ¹ My i inni również wykorzystaliśmy ten protokół do wyizolowania vRNP w celu zbadania ich importu jądrowego. ^2,4,5

Zalecamy stosowanie końcówek i probówek wolnych od RNaz podczas manipulowania vRNP, ponieważ genom wirusa składa się z RNA, a zatem łatwo ulega degradacji w obecności RNA. Ponadto wszystkie powinny być wykonane w wodzie wolnej od RNazy. Opisany tutaj protokół został prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
H3N2 X-31 A/AICHI/68 grypa A	Charles River Laboratories	490715
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
MES	Sigma-Aldrich	M-8250
Glicerol	Fisher Scientific	G33-1
Oktyloglukozyd	Sigma-Aldrich	O-8001
Lizolecytyna	Sigma-Aldrich	L-4129
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D-9779
Coomassie brylantowy niebieski G-250	Kodak	1367796
woda uzdatniona pirowęglanem dietylu (DEPC)	Invitrogen	750024
Octan uranylu	Ted Pella, Inc.	19481
Molibdenian amonu	Fisher Scientific	A-674
Optima MAX-E Ultrawirówka	Beckman Coulter Inc.
Pakiet wirnika MLS-50, łyżka wahadłowa	Beckman Coulter Inc.	367280
TLA-120.2 Zespół wirnika, kąt stały, tytan	Beckman Coulter Inc.
Eppendorf Thermomixer	Lauda Brinkmann	022670000