Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

Podsumowanie

Genom wirusa grypy typu A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). Niniejsza praca opisuje oczyszczanie vRNP wirusa grypy A w gradiencie glicerolu oraz ich wizualizację za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

Genom wirusa grypy A składa się z ośmiu jednoniciowych cząsteczek RNA o orientacji ujemnej, z których każda jest osobno upakowana z wieloma kopiami nukleoproteiny (NP) wirusa grypy A w cząsteczki wirusowych rybonukleoprotein (vRNP). Wirusowe vRNP znajdują się wewnątrz otoczki wirusa. Podczas wnikania do komórki kompleksy vRNP są jednak uwalniane do cytoplazmy, gdzie uzyskują dostęp do mechanizmów transportu jądrowego gospodarza. Aby badać import jądrowy vRNP grypy oraz replikację genomu wirusa grypy, przydatne jest stosowanie izolowanych vRNP, tak aby pozostałe komponenty wirusa nie zakłócały tych procesów. W niniejszej pracy opisujemy procedurę oczyszczania vRNP z wirusa grypy A. Procedura rozpoczyna się od rozbicia wirionu grypy A za pomocą detergentów w celu uwolnienia kompleksów vRNP z otoczkowego wirionu. Następnie vRNP są oddzielane od pozostałych składników wirionu grypy A w 33-70% nieciągłym gradiencie glicerolu metodą sedymentacji prędkościowej. Frakcje otrzymane z gradientu glicerolu są następnie analizowane za pomocą SDS-PAGE po barwieniu błękitem Coomassie. Frakcje szczytowe zawierające NP są łączone i zagęszczane poprzez wirowanie. Po zagęszczeniu integralność vRNP jest weryfikowana poprzez wizualizację vRNP za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej po barwieniu negatywowym. Oczyszczanie w gradiencie glicerolu jest modyfikacją metody opisanej przez Kemleraet al.(1994)¹, a barwienie negatywne zostało wykonane przez Wuet al.(2007).²

Protokół

Część 1: Dezintegracja wirionu grypy A

1. Do jednej poliwęglanowej probówki wirówkowej Beckman (11 mm x 34 mm), przeznaczonej do rotora TLA-120.2 stosowanego w ultrawirówce Beckman Optima Max-E, należy dodać 750 µl buforu MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7.5).
2. Do tej probówki należy dodać 500 µl wirusa grypy A (szczep H3N2 X-31 A/AICHI/68; 2 mg/ml). Wirus należy wymieszać z buforem MNT, kilkakrotnie pipetując roztwór w górę i w dół.
3. Próbkę należy wirować przez 10 minut przy 109,000 x g w temperaturze 4 °C w wirówce Beckman Optima Max-E z wykorzystaniem rotora TLA-120.2.
4. Należy usunąć nadsącz i resuspender osad w 500 µl buforu do lizy (100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 5% (w/v) glicerolu, 50 mM oktyloglukozyd, 10 mg/ml lizolecytyny, 1.5 mM ditiotreitolu, 100 mM MES, pH 5.5).
5. Próbkę należy energicznie wymieszać w wortexie, a następnie inkubować przy 31 °C przez 20 minut w termomikserze Eppendorf.

Część 2: Centryfugacja w gradiencie glicerolu metodą sedymentacji prędkościowej

1. Przygotować gradient glicerolu, wprowadzając następujące ilości glicerolu do probówki do ultrawirówki Beckman ultraclear (13 mm x 51 mm): 1 ml 70% (v/v) glicerolu, 0,75 ml 50% glicerolu, 0,375 ml 40% glicerolu oraz 1,8 ml 33% glicerolu. Roztwory glicerolu przygotowuje się poprzez zmieszanie czystego glicerolu z buforem NM (150 mM NaCl, 50 mM MES, pH 5.5). Przygotować również probówkę równoważącą zawierającą zarówno glicerol, jak i bufor.
2. Ponownie wymieszać próbkę z rozbitymi wirusami za pomocą vortexa, a następnie nanieść ją na gradient glicerolu.
3. Wirować gradient przez 3,75 godziny przy 217,000 x g i 4 °C w rotorze z ruchomymi kątami Beckman MLS-50.
4. Po zakończeniu wirowania ręcznie zebrać frakcje gradientu o objętości 250 µl, zaczynając od góry probówki. Frakcje przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C.

Część 3: Analiza frakcji gradientu glicerolu za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS

1. Przenieś 20 µl z każdej frakcji do nowej probówki.
2. Dodaj 5 µl 5x buforu do próbek SDS-PAGE.
3. Podgrzej do 95 °C przez 5 minut.
4. Krótko odwiruj próbki, a następnie nanieś je na 10% żel poliakrylamidowy, umieszczając markery masy cząsteczkowej w jednej z dziurek.
5. Elektroforezuj próbki w żelu, aż barwnik ładunkowy błękit bromofenolowy dotrze niemal do dolnej krawędzi żelu.
6. Zabarw żel błękitem Coomassie.

Część 4: Koncentrowanie frakcji vRNP

1. Wybrać frakcje glicerolu zawierające głównie NP, połączyć je i rozdzielić do dwóch poliwęglanowych probówek do wirowania Beckman (11 mm x 34 mm).
2. Napełnić każdą probówkę wodą Ultrapure traktowaną diethylopirokarbonianem (DEPC), a następnie kilkukrotnie pipetować w górę i w dół w celu wymieszania.
3. Wirować przez 4,5 godziny przy 157 000 x g w temperaturze 4°C, używając rotora Beckman TLA-120.2.
4. Usunąć nadnadpłyn i resuspender osad w 50 µl wody traktowanej DEPC.
5. W razie potrzeby można zmierzyć A₂₈₀ skoncentrowanych vRNP. Ponieważ NP jest głównym składnikiem obecnym w połączonych frakcjach, można obliczyć przybliżoną molarność NP, korzystając z jego współczynnika ekstynkcji wynoszącego 55 350 M^-1 cm^-1 (wyznaczonego za pomocą ProtParam³).
6. Podzielić oczyszczone vRNP na aliquoty i przechowywać je w zamrażarce w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.

Część 5: Barwienie negatywne vRNP

1. Rozcieńczyć 1 µl oczyszczonego vRNP w 9 µl świeżo przygotowanego i dwukrotnie filtrowanego buforu MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7.5). Do rozcieńczania vRNP oraz przemywania siatki z preparatem (krok 5.5) można użyć innych buforów, jednak nie należy stosować PBS, jeśli do barwienia negatywowego używany jest octan uranylu.
2. Poddać działaniu wyładowań żarowych (glow-discharge) siatkę do preparatów (miedzianą TEM), uprzednio pokrytą warstwą parlodionu i filmu węglowego, przez 30 sekund.
3. Trzymając świeżo poddaną działaniu wyładowań siatkę z preparatem za pomocą pęsety, nanieść na nią kroplę 5 µl rozcieńczonego vRNP.
4. Pozostawić kroplę preparatu na siatce na 8 minut.
5. W czasie oczekiwania położyć na blacie niewielki pasek Parafilmu i nanieść na niego 2 krople po 10 µl każda buforu MNT (do przemywania siatki) oraz kroplę 80 µl świeżo przygotowanego roztworu barwiącego (1% molibdanu amonu lub 1% octanu uranylu).
6. Po 8 minutach adsorpcji odessać część roztworu próbki z siatki z preparatem za pomocą kawałka papieru filtracyjnego (wyciętego w trójkąty). Nie dopuścić do wyschnięcia siatki z preparatem.
7. Przemyć siatkę z preparatem w 2 kroplach po 10 µl każda buforu MNT przez łącznie 1 minutę. Należy to zrobić, ostrożnie opuszczając siatkę z preparatem do kropli, a następnie odessąwszy część roztworu próbki za pomocą kawałka papieru filtracyjnego (nie dopuszczając do wyschnięcia siatki z preparatem).
8. Natychmiast po odessaniu ostatniej kropli buforu z siatki z preparatem, całkowicie zanurzyć siatkę w kropli barwnika i odczekać 1 minutę.
9. Całkowicie odessać roztwór barwiący z siatki z preparatem za pomocą kawałka papieru filtracyjnego.
10. Pozostawić siatkę z preparatem do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut przed obserwacją pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.

Część 6: Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1

Ponieważ białko NP grypy A (~56 kDa) jest głównym białkiem występującym w wirusowych kompleksach rybonukleoproteinowych, prążek NP jest zazwyczaj najsilniejszym prążkiem w frakcjach zawierających vRNP (Rysunek 1). Oprócz NP każda vRNP grypy zawiera również kopię kompleksu trymerycznej polimerazy RNA (masy cząsteczkowe 82, 86 i 86,5 kDa). Mogą one być widoczne lub niewidoczne po barwieniu błękitem Coomassie, ponieważ ich zawartość jest niska w porównaniu z NP. Polimerazy można jednak wykryć, jeśli zamiast barwienia błękitem Coomassie przeprowadzi się barwienie żelu srebrem. Białko macierzy grypy M1 (~28 kDa) powinno występować w minimalnym stopniu w frakcjach, w których znajdują się frakcje szczytowe białka NP.

Rysunek 2

vRNP barwione negatywnie, wizualizowane za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego, powinny ukazywać vRNP przypominające cząstki w kształcie pręta o zmiennej długości, wynoszącej w przybliżeniu od 30 nm do 120 nm (Rysunek 2a). Oligomeryczne NP są zorganizowane w łańcuch cząsteczek NP, który jest dalej sfałdowany w strukturę podwójnej helisy, dlatego na obu końcach tych pręcikowatych cząstek można niekiedy dostrzec pętle (Rysunek 2b).

Dyskusja

Oczyszczanie vRNP opiera się na procedurze opisanej przez Kemlera et al. (1994).¹ My oraz inni autorzy wykorzystywali ten protokół do izolacji vRNP w celu badania ich importu do jądra komórkowego.^2,4,5

Zaleca się stosowanie końcówek i probówek wolnych od RNaz podczas manipulowania vRNP, ponieważ genom wirusa składa się z RNA, co sprawia, że ulega on łatwej degradacji w obecności RNaz. Ponadto wszystkie bufory powinny być przygotowane w wodzie wolnej od RNaz. Opi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
grypa A H3N2 X-31 A/AICHI/68	Charles River Laboratories	490715
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
MES	Sigma-Aldrich	M-8250
Glicerol	Fisher Scientific	G33-1
Oktyloglukozyd	Sigma-Aldrich	O-8001
Lizolecytyna	Sigma-Aldrich	L-4129
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	D-9779
Coomassie brilliant blue G-250	Kodak	1367796
woda traktowana pirokarbonianem dwuetylowym (DEPC)	Invitrogen	750024
Octan uranylu	Ted Pella, Inc.	19481
Molibden amonu	Fisher Scientific	A-674
Ultracentryfuga Optima MAX-E	Beckman Coulter Inc.	434491
Zestaw wirnika MLS-50, z koszykami wahadłowymi	Beckman Coulter Inc.	367280
TLA-120.2 Zespół rotora, stałego kąta, tytanowy	Beckman Coulter Inc.	362046
Eppendorf Thermomixer	Lauda Brinkmann	022670000