Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

Podsumowanie

Genom wirusa grypy typu A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). Niniejsza praca opisuje oczyszczanie vRNP wirusa grypy A w gradiencie glicerolu oraz ich wizualizację za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

Genom wirusa grypy A składa się z ośmiu jednoniciowych cząsteczek RNA o orientacji ujemnej, z których każda jest osobno upakowana z wieloma kopiami nukleoproteiny (NP) wirusa grypy A w cząsteczki wirusowych rybonukleoprotein (vRNP). Wirusowe vRNP znajdują się wewnątrz otoczki wirusa. Podczas wnikania do komórki kompleksy vRNP są jednak uwalniane do cytoplazmy, gdzie uzyskują dostęp do mechanizmów transportu jądrowego gospodarza. Aby badać import jądrowy vRNP grypy oraz replikację genomu wirusa grypy, przydatne jest stosowanie izolowanych vRNP, tak aby pozostałe komponenty wirusa nie zakłócały tych procesów. W niniejszej pracy opisujemy procedurę oczyszczania vRNP z wirusa grypy A. Procedura rozpoczyna się od rozbicia wirionu grypy A za pomocą detergentów w celu uwolnienia kompleksów vRNP z otoczkowego wirionu. Następnie vRNP są oddzielane od pozostałych składników wirionu grypy A w 33-70% nieciągłym gradiencie glicerolu metodą sedymentacji prędkościowej. Frakcje otrzymane z gradientu glicerolu są następnie analizowane za pomocą SDS-PAGE po barwieniu błękitem Coomassie. Frakcje szczytowe zawierające NP są łączone i zagęszczane poprzez wirowanie. Po zagęszczeniu integralność vRNP jest weryfikowana poprzez wizualizację vRNP za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej po barwieniu negatywowym. Oczyszczanie w gradiencie glicerolu jest modyfikacją metody opisanej przez Kemleraet al.(1994)¹, a barwienie negatywne zostało wykonane przez Wuet al.(2007).²

Protokół

Część 1: Dezintegracja wirionu grypy A

1. Do jednej poliwęglanowej probówki wirówki Beckman (11 mm x 34 mm), przeznaczonej do rotora TLA-120.2 w ultrawirówce Beckman Optima Max-E, dodać 750 µl buforu MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7.5).
2. Do probówki dodać 500 µl wirusa grypy A (szczep H3N2 X-31 A/AICHI/68; 2 mg/ml). Wirus wymieszać z buforem MNT, pipetując ciecz kilkukrotnie w górę i w dół.
3. Wirować przez 10 minut przy 109,000 x g w temperaturze 4 °C w wirówce Beckman Optima Max-E z wykorzystaniem rotora TLA-120.2.
4. Usunąć nadsącz, a osad zawiesić ponownie w 500 µl buforu do lizy (100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 5% (w/v) glicerolu, 50 mM oktyloglukozyd, 10 mg/ml lizolecytyny, 1.5 mM ditiotreitolu, 100 mM MES, pH 5.5).
5. Intensywnie wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie inkubować przy wstrząsaniu w temperaturze 31 °C przez 20 minut w termomikserze Eppendorf.

Część 2: Centryfugacja w gradiencie glicerolu metodą prędkości sedymentacji

1. Przygotuj gradient glicerolu, wlewając do probówki do ultrawirowania Beckman ultraclear (13 mm x 51 mm) następujące ilości glicerolu: 1 ml 70% (v/v) glicerolu, 0,75 ml 50% glicerolu, 0,375 ml 40% glicerolu oraz 1,8 ml 33% glicerolu. Roztwory glicerolu przygotowuje się poprzez zmieszanie czystego glicerolu z buforem NM (150 mM NaCl, 50 mM MES, pH 5,5). Przygotuj również probówkę przeciwwagę zawierającą zarówno glicerol, jak i bufor.
2. Ponownie wymieszaj na wortexie próbkę z rozbitymi wirusami, a następnie nałóż ją na gradient glicerolu.
3. Wiruj gradient przez 3,75 godziny przy 217 000 x g w temperaturze 4 °C w rotorze z ruchomymi koszykami Beckman MLS-50.
4. Po zakończeniu wirowania ręcznie pobierz frakcje o objętości 250 µl z gradientu, zaczynając od góry probówki. Przechowuj frakcje na lodzie lub w temperaturze 4 °C.

Część 3: Analiza frakcji gradientu glicerolowego za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS

1. Przenieś 20 µl z każdej frakcji do nowej probówki.
2. Dodaj 5 µl 5x buforu do próbek SDS-PAGE.
3. Ogrzewaj w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
4. Krótko odwiruj próbki i nałóż je na 10% żel poliakrylamidowy, umieszczając markery masy cząsteczkowej w jednym z dołków.
5. Elektroforezuj próbki w żelu, aż barwnik ładunkowy błękit bromofenolowy dotrze niemal do dolnej krawędzi żelu.
6. Przebarw żel błękitem Coomassie.

Część 4: Koncentracja frakcji vRNP

1. Wybrać frakcje glicerolowe zawierające głównie NP, połączyć je i rozdzielić do dwóch poliwęglanowych probówek wiriówek Beckman (11 mm x 34 mm).
2. Napełnić każdą probówkę wodą Ultrapure traktowaną dietylopirolokarbonianem (DEPC), a następnie kilkukrotnie pipetować w górę i w dół w celu wymieszania.
3. Wirować przez 4,5 godziny przy 157 000 x g w temperaturze 4 °C, używając rotora Beckman TLA-120.2.
4. Usunąć nadsącz i resuspender osad w 50 µl wody traktowanej DEPC.
5. W razie potrzeby można zmierzyć A₂₈₀ skoncentrowanych vRNP. Ponieważ NP jest głównym składnikiem obecnym w połączonych frakcjach, można obliczyć przybliżoną molarność NP, korzystając z jego współczynnika ekstynkcji wynoszącego 55 350 M^-1 cm^-1 (wyznaczonego za pomocą ProtParam³).
6. vRNP po oczyszczeniu podzielić na alikwoty i przechowywać w zamrożeniu w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.

Część 5: Barwienie negatywne vRNP

1. Rozcieńcz 1 µl oczyszczonego vRNP w 9 µl świeżo przygotowanego i dwukrotnie filtrowanego buforu MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7.5). Do rozcieńczania vRNP oraz do przemywania siatki z preparatem (krok 5.5) można użyć również innych buforów, jednak nie należy stosować PBS, jeśli do barwienia negatywowego używany jest octan uranylu.
2. Poddaj działaniu wyładowań żarowych (glow-discharge) siatkę z preparatem (miedzianą siatkę TEM), uprzednio pokrytą parlodionem i błoną węglową, przez 30 sekund.
3. Trzymając świeżo poddaną wyładowaniom siatkę pęsetą, nanieś na nią kroplę 5 µl rozcieńczonego vRNP.
4. Pozostaw kroplę preparatu na siatce na 8 minut.
5. W czasie oczekiwania połóż na blacie mały pasek Parafilmu i nanieś na niego 2 krople po 10 µl każda buforu MNT (do przemycia siatki) oraz kroplę 80 µl świeżo przygotowanego roztworu barwiącego (1% molibdenu amonu lub 1% octanu uranylu).
6. Po 8 minutach adsorpcji usuń część roztworu próbki z siatki za pomocą kawałka papieru filtracyjnego (wyciętego w trójkąty). Nie dopuszczaj do wyschnięcia siatki z preparatem.
7. Przemyj siatkę z preparatem w 2 kroplach buforu MNT po 10 µl każda przez łącznie 1 minutę. Należy to zrobić, ostrożnie zanurzając siatkę w kropli, a następnie usuwając część roztworu próbki za pomocą papieru filtracyjnego (nie dopuszczając do wyschnięcia siatki).
8. Natychmiast po usunięciu ostatniej kropli buforu z siatki, całkowicie zanurz ją w kropli barwnika i odczekaj 1 minutę.
9. Całkowicie usuń roztwór barwiący z siatki za pomocą kawałka papieru filtracyjnego.
10. Pozostaw siatkę z preparatem do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut przed obserwacją pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.

Część 6: Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1

Ponieważ białko NP wirusa grypy typu A (~56 kDa) jest głównym białkiem występującym w wirusowych kompleksach rybonukleoproteinowych, prążek NP jest zazwyczaj najsilniejszym prążkiem w frakcjach zawierających vRNP (Rycina 1). Oprócz białka NP każdy vRNP grypy zawiera również kopię trymerycznego kompleksu polimerazy RNA (masy cząsteczkowe 82, 86 i 86,5 kDa). Mogą one być widoczne lub niewidoczne przy barwieniu błękitem Coomassie, ponieważ ich zawartość jest niska w porównaniu z zawartością białka NP. Polimerazy można jednak wykryć, jeśli zamiast barwienia błękitem Coomassie przeprowadzi się barwienie żelu srebrem. Białko macierzy wirusa grypy M1 (~ 28 kDa) powinno występować w minimalnym stopniu we frakcjach, w których znajdują się frakcje szczytowe białka NP.

Rysunek 2

vRNP poddane barwieniu negatywnemu, wizualizowane za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego, powinny przypominać cząstki w kształcie pręcików o zmiennej długości, wynoszącej w przybliżeniu od 30 nm do 120 nm (Rycina 2a). Oligomeryczne NP są zorganizowane w łańcuch cząsteczek NP, który następnie zwija się w strukturę o powtórzeniach podwójnej helisy, w związku z czym na obu końcach tych pręcikowatych cząstek czasem widoczne mogą być pętle (Rycina 2b).

Dyskusja

Oczyszczanie vRNP opiera się na procedurze opisanej przez Kemlera et al. (1994).¹ My oraz inni autorzy wykorzystywali ten protokół do izolacji vRNP w celu badania ich importu do jądra komórkowego.^2,4,5

Zaleca się stosowanie końcówek i probówek wolnych od RNaz podczas manipulowania vRNP, ponieważ genom wirusa składa się z RNA, co sprawia, że ulega on łatwej degradacji w obecności RNaz. Ponadto wszystkie bufory powinny być przygotowane w wodzie wolnej od RNaz. Opi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
grypa A H3N2 X-31 A/AICHI/68	Charles River Laboratories	490715
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
MES	Sigma-Aldrich	M-8250
Glicerol	Fisher Scientific	G33-1
Oktyloglukozyd	Sigma-Aldrich	O-8001
Lizolecytyna	Sigma-Aldrich	L-4129
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	D-9779
Coomassie brilliant blue G-250	Kodak	1367796
woda traktowana pirokarbonianem dwuetylowym (DEPC)	Invitrogen	750024
Octan uranylu	Ted Pella, Inc.	19481
Molibden amonu	Fisher Scientific	A-674
Ultracentryfuga Optima MAX-E	Beckman Coulter Inc.	434491
Zestaw wirnika MLS-50, z koszykami wahadłowymi	Beckman Coulter Inc.	367280
TLA-120.2 Zespół rotora, stałego kąta, tytanowy	Beckman Coulter Inc.	362046
Eppendorf Thermomixer	Lauda Brinkmann	022670000