Pozyskiwanie i kriokonserwacja oocytów chomika oraz embrionów myszy

Podsumowanie

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy szczegółową instrukcję krok po kroku, jak pobierać i krio konserwować oocyty chomika, aby uzyskać wysoki wskaźnik przeżywalności po rozmrożeniu. Tę samą procedurę można zastosować do skutecznego zamrażania i rozmrażania zarodków myszy na różnych etapach rozwoju przedimplantacyjnego.

Streszczenie

Zarodki i oocyty zostały po raz pierwszy pomyślnie kriokonserwowane ponad 30 lat temu, kiedy Whittinghamet al. ¹or Wilmut²opisali oddzielnie, że embriony myszy mogą być mrożone i przechowywane w temperaturze -196 °C, a kilka lat później Parkeninget alEmpty source HTML provided. No translation to perform.³zgłosili narodziny żywego potomstwa w wyniku zapłodnienia in vitro (IVF) kriokonserwowanych oocytów. Od tego czasu stosowanie technik kriokonserwacji szybko się upowszechniło, stając się niezbędnym elementem praktyki wspomaganej reprodukcji ludzi i zwierząt oraz ochrony zasobów genetycznych zwierząt. Obecnie stosuje się dwie główne metody kriokonserwacji oocytów i embrionów: powolne zamrażanie oraz witryfikację. W celu udoskonalenia obu tych technik zastosowano szeroką gamę podejść, a z kriokonserwowanych embrionów urodziły się miliony zwierząt i tysiące dzieci. Niemniej jednak wciąż należy wyeliminować istotne niedociągnięcia związane z kriokonserwacją, ponieważ tworzenie się kryształków lodu, efekty roztworu i szok osmotyczny wydają się powodować liczne uszkodzenia kriogeniczne w oocytach i embrionach po rozmrożeniu. Powolne zamrażanie z użyciem programowalnych zamrażarek ma tę zaletę, że pozwala na stosowanie niskich stężeń krioprotektantów, które zazwyczaj wiążą się z toksycznością chemiczną i szokiem osmotycznym, jednak ich zdolność do zapobiegania tworzeniu się kryształków lodu przy niskich stężeniach jest ograniczona. Powolne zamrażanie indukuje również efekty przechłodzenia, których należy unikać poprzez ręczne lub automatyczne zaszczepianie kryształów lodu⁴W procesie witryfikacji wysokie stężenia krioprotektantów hamują tworzenie się kryształków lodu i prowadzą do powstania szklistego stanu zwitryfikowanego, w którym woda ulega zestaleniu, ale nie zwiększa swojej objętości. Jednak ze względu na toksyczność krioprotektantów przy stosowanych stężeniach, oocyty/embriony mogą być poddane działaniu roztworu krioprotektanta tylko przez bardzo krótki czas i w minimalnej objętości roztworu, przed bezpośrednim zanurzeniem próbek w ciekłym azocie⁵W ostatniej dekadzie witryfikacja stała się bardziej popularna, ponieważ jest to metoda bardzo szybka i nie wymaga kosztownego sprzętu (zamrażarki programowalnej). Niemniej jednak wolne zamrażanie pozostaje najpowszechniej stosowaną metodą kriokonserwacji oocytów i embrionów. W niniejszym artykule wideo pokazujemy krok po kroku, jak pobierać i powoli zamrażać oocyty chomika, aby uzyskać wysoką przeżywalność po rozmrażaniu. Tą samą procedurę można zastosować do skutecznego zamrażania i rozmrażania embrionów myszy na różnych etapach rozwoju przedimplantacyjnego.

Protokół

Opieka nad zwierzętami oraz procedury były prowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami zatwierdzonymi przez Komisję Etyki Badań nad Zwierzętami i Ludźmi Uniwersytetu Autònoma w Barcelonie w Hiszpanii.

I. Pobieranie oocytów

1. Wybrać samice chomików syryjskich (Mesocricetus auratus; w wieku 8-12 tygodni) rasy Golden Syrian, sprawdzając obecność gęstej wydzieliny pochwowej (wydzieliny poowulacyjnej).
2. Indukować superowulację u wybranych samic poprzez domięśniowy wtrysk 40 IU PMSG (gonadotropiny z surowicy ciężarnej klaczy), a następnie 40 IU hCG (ludzkiej gonadotropiny kosmórkowej) po upływie 60 godzin.
3. Eutanazować samice chomików 16 godzin po podaniu hCG w komorze z dwutlenkiem węgla.
4. Wyizolować jajowody z samic zgodnie z instrukcją w materiale wideo i przenieść je do kropli pożywki KSOM-H.
5. zebrać kompleksy oocyt-cumulus poprzez rozrywanie ampuły jajowodu pod mikroskopem stereoskopowym w kropli hialuronidazy (156 U/ml) w temperaturze 37°C. Oocyty zostaną uwolnione z komórek cumulus w ciągu około 5 minut.
6. zebrać oocyty z hialuronidazy i przemyć je dwukrotnie w pożywce KSOM-H.

W celu pobrania embrionów myszy, u samic myszy (Mus musculus; w wieku 6-8 tygodni) indukuje się superowulację poprzez doszpikowe wstrzyknięcie 5 IU PMSG, a następnie 5 IU hCG po 48 godzinach, po czym samice są kojone z samcami. Samice są uśmiercane poprzez zwichnięcie szyjnego kręgu odpowiednio 24-26, 44-46 lub 54-56 godzin po podaniu hCG w celu uzyskania embrionów w stadium pronuklearnym, dwukomórkowym lub czterokomórkowym.
Uwaga: Stosując ten protokół, z każdej samicy można pobrać około 20 do 30 oocytów/embrionów.

II. Przygotowanie roztworów do zamrażania i rozmrażania

1. Przygotować roztwór I poprzez rozcieńczenie 0,57 ml propilenglikolu w 5 ml KSOM-H (1,5 M propilenglikolu).
2. Przygotować roztwór do rozmrażania, dodając 2 ml KSOM-H do probówki zawierającej 0,2052 g sacharozy (0,3 M sacharozy).
3. Przygotować roztwór do zamrażania, dodając 2 ml roztworu I do probówki zawierającej 0,0684 g sacharozy (1,5 M propilenglikolu i 0,1 M sacharozy).

Uwaga: Roztwór I oraz roztwory do zamrażania i rozmrażania należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Jednakże określone ilości sacharozy przeznaczone do przygotowania roztworów do zamrażania i rozmrażania można odważyć wcześniej i przechowywać w probówkach 3 ml w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.

III. Protokół mrożenia

1. Przenieś oocyty/embriony z pożywki KSOM-H do kropli roztworu I i inkubuj przez 7-15 minut w temperaturze pokojowej.
2. W tym czasie przygotuj szalkę Petriego o średnicy 90 mm do napełniania słomek, nanosząc krople roztworów do zamrażania i rozmrażania o objętości 90 µl, zgodnie z instrukcją w materiale wideo (1 kropla każdego roztworu na słomkę).
3. Przenieś odpowiednią liczbę oocytów/embrionów do kropli roztworu do zamrażania.
   Uwaga: Zazwyczaj przenosimy od 5 do 30 oocytów lub embrionów na kroplę.
4. Podłącz słomkę do systemu aspiracji sterowanego ustnikiem i napełnij ją w następującej kolejności: roztwór I, powietrze, kropla roztworu do zamrażania z oocytami, powietrze, kropla roztworu do rozmrażania, powietrze.
5. Po napełnieniu słomki kontynuuj aspirację, aż pierwsza wprowadzona kropla (roztwór I) dotrze do polimeru na górnym końcu słomki i go uszczelni. Zgrzej termicznie drugi koniec słomki lub zamknij go plastikowym korkiem.
6. Włącz programowalną zamrażarkę i wybierz program zamrażania. Program zamrażania zastosowany w tym protokole opiera się na szybkościach chłodzenia pierwotnie opublikowanych przez Lassalle et al. [7]:
   • 2°C/min od temperatury pokojowej do -7°C
     0°C/min przez 10 min w celu wyrównania temperatury i indukcji nukleacji (patrz poniżej)
   • 0,3°C/min od -7°C do -30°C
     0°C/min przez 2 min w celu wyrównania temperatury
   • 35°C/min od -30°C do -130°C
7. Umieść słomki w gniazdach uchwytu programowalnej zamrażarki, upewniając się, że część słomki z kroplą roztworu do rozmrażania jest skierowana na zewnątrz. Uruchom program zamrażania.
8. Gdy temperatura próbek osiągnie -7°C i chłodzenie zostanie wstrzymane, wykonaj manualne zaszczepianie: zanurz pęsetę w ciekłym azocie, delikatnie wysuń uchwyty z zamrażarki, aby odsłonić fragmenty słomek zawierające krople roztworu do rozmrażania, i natychmiast dotknij tego fragmentu słomek pęsetą. Powtórz czynność dla każdego uchwytu i każdej słomki w uchwycie, a następnie pozwól programowi zamrażania działać do końca.
9. Po zakończeniu programu zanurz uchwyty w ciekłym azocie.
10. Wyjmij słomki z uchwytów i przenieś je do oznakowanego kubka (gobelet).
11. Na koniec przechowuj kubek w zbiorniku z ciekłym azotem.

IV. Protokół rozmrażania

1. Wyjmij słomkę z pojemnika z ciekłym azotem.
2. Pozostaw słomkę w temperaturze pokojowej przez 40 sekund.
3. Zanurz słomkę w kąpieli wodnej o temperaturze 30°C na 40 sekund.
4. Usuń korek ze słomki lub odetnij termozgrzewany koniec.
5. Wylej zawartość słomki na szalkę Petriego o średnicy 35 mm i delikatnie wymieszaj dwie krople zawierające roztwory do zamrażania i rozmrażania.
6. Pozostaw oocyty/zarodki w mieszaninie przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
7. Przenieś oocyty/zarodki do świeżej kropli KSOM-H na kolejne 15 minut w temperaturze 37°C.
8. Oocyty/zarodki są teraz gotowe do dalszej manipulacji.

Uwaga: W podczas kroków 6 i 7 powinno być zauważalne powolne pęcznienie rozmrożonych oocytów/embrionów w wyniku rehydratacji.

V. Reprezentatywne wyniki

Zastosowanie opisanego tutaj protokołu kriokonserwacji pozwala uzyskać przeżywalność na poziomie około 95% dla oocytów chomąt oraz >90%, 85% i 80% dla zarodków myszy szczepu B6CBAF1 w stadium pronukleusowym, dwukomórkowym i czterokomórkowym, odpowiednio. W przypadku hodowli zarodków myszy in vitro w pożywce KSOM po rozmrożeniu, w optymalnych warunkach hodowlanych co najmniej 70 do 80% z nich powinno osiągnąć stadium blastocysty.

Zaleca się uwzględnienie w każdym eksperymencie mrożenia grupy kontrolnej (slomki) oocytów/zarodków oraz rozmrożenie tej grupy przed wykorzystaniem pozostałych oocytów/zarodków do dalszych manipulacji. Jeśli wskaźniki przeżywalności grupy kontrolnej będą niższe od oczekiwanych, należy rozmrozić kolejną slomkę z tej samej partii. Jeśli wskaźniki przeżywalności tej drugiej grupy również będą niskie, należy odrzucić pozostałe slomki z tej partii mrożenia.

Dyskusja

Dzięki temu protokołowi można z powodzeniem kriokonserwować oocyty chomika oraz embriony myszy. Po zamrożeniu oocyty/embriony mogą być przechowywane w zbiornikach z ciekłym azotem w nieskończoność i odzyskiwane w dowolnym czasie i miejscu. Daje to korzyść w postaci próbek niemal gotowych do użycia w dowolnym momencie. Z drugiej strony, protokół ten może być również wykorzystany do tworzenia kriobank embrionów z cennych szczepów myszy (takich jak linie transgeniczne), co stanowi ekonomiczną i bezpieczniejszą alternatywę d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nazwa materiału	Typ	Firma	Numer katalogowy	Komentarz
mini-słomka typu francuskiego 0,25 ml		Mini-kuweta	13407/0010
hCG		Farma-Lepori, Hiszpania	749036.4
Hialuronidaza		Sigma	H-3884
pożywka KSOM-H				Ref. [11]
Ciekły azot		Air Liquide
Zatyczki plastikowe		Mini-kuweta	19046
PMSG		Intervet, Hiszpania	1.614/8447
Propylenglikol		Fluka	82280
Sacharoza		Merck	107687
Nożyczki chirurgiczne		Aesculap	BC-060R; BG-061R
Zgrzewarka termiczna		SIZ	220
szalki hodowlane 35 i 90 mm		Nunc	153066; 150350
probówki 10 ml		Greiner Bio-one	163160
Zbiornik z azotem		MVE, kriogenika	XC 43/28
Zamrażarka programowalna		Planner Products Ltd.	Kryo-10 Series III
Pinceta		Aesculap	BD-331R; BD-053R; OC-020R