Izolacja protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana

Podsumowanie

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę izolacji nienaruszonych protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis. Biorąc pod uwagę, że wyizolowane protoplasty pozostają nienaruszone przez co najmniej 96h i są izolowane z siewek zamiast z miesięcznych, dojrzałych roślin, procedura ta przyspiesza analizy wymagające zastosowania nienaruszonych protoplastów.

Streszczenie

Protoplasty to komórki roślinne, z których ściany komórkowe zostały usunięte enzymatycznie. Izolacja protoplastów z różnych tkanek roślinnych została po raz pierwszy opisana ponad 40 lat temu¹i od tego czasu była adaptowana do badania różnych procesów komórkowych, takich jak lokalizacja subkomórkowa białek, izolacja nienaruszonych organelli oraz ukierunkowana inaktywacja genów poprzez interferencję RNA (RNAi) za pomocą dwuniciowego RNA^2-5Większość protokołów izolacji protoplastów wykorzystuje tkanki liściowe dojrzałych roślin Arabidopsis (np. roślin w wieku 35 dni)^2-4Zmodyfikowaliśmy istniejące protokoły, wykorzystując 14-dniowe siewki *Arabidopsis*. W tej procedurze jeden gram 14-dniowych siewek dostarczył 5 10⁶-10⁷protoplasty, które pozostają nienaruszone przez co najmniej 96 godzin. Wydajność uzyskiwania protoplastów z siewek jest porównywalna z preparatami z liści dojrzałych roślin Arabidopsis, jednak izolacja protoplastów zostaje zakończona w ciągu 15 dni, a nie 35-36 dni. Pozwala to na skrócenie czasu oraz zmniejszenie zapotrzebowania na przestrzeń w komorze wzrostowej, wymaganych do izolacji protoplastów z dojrzałych roślin, i przyspiesza dalsze badania wymagające nienaruszonych protoplastów.

Protokół

Część 1. Przygotowanie pożywki stałej do hodowli roślin.

Rośliny hodujemy zazwyczaj na skoncentrowanym pożywce Murashige i Skoog (MS) z dodatkiem 1% sacharozy i 0,7% agaru. Zawiera ona wszystkie niezbędne składniki do utrzymania roślin w dobrej kondycji.

Do przygotowania 1L pożywki MS o pH 5,7

1. Wlać 800 ml wody do butelki autoklawowalnej o pojemności 1,5–2,0 L i dodać 2,15 g proszku MS.
2. Włożyć do butelki mieszadło magnetyczne i rozpuścić proszek MS, mieszając pożywkę na mieszalniku magnetycznym.
3. Podczas mieszania dodawać kroplami 1N KOH, aby dostosować pH pożywki MS do wartości 5,7.
4. Dodać 10 g sacharozy, cały czas mieszając.
5. Dodać 7 g agaru *.
6. Dopełnić przygotowaną pożywkę do końcowej objętości 1000 ml i wysterylizować w autoklawie.*
7. Umieścić wysterylizowaną pożywkę na mieszalniku magnetycznym i schłodzić ją podczas mieszania, aby agar nie osadził się na dnie butelki. Schłodzić pożywkę do temperatury ~ 60 °C.*
8. Wylać pożywkę na płytki Petriego o średnicy 100 mm. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.

*Wskazówka 1: Nie próbuj rozpuszczać agaru. Rozpuści się on podczas autoklawowania.
*Wskazówka 2: Pozostaw mieszadełko magnetyczne w butelce podczas autoklawowania, będzie ono potrzebne później.
*Wskazówka 3: Jeśli możesz trzymać dłonie na autoklawowanej butelce przez 10 s, oznacza to, że pożywka wystarczająco ostygła i można rozpocząć wlewanie na płytki.

Część 2. Materiał roślinny i warunki wzrostu.

1. Sterylizacja nasion Arabidopsis thaliana
   1. Umieścić 100 mg nasion w probówkach typu Eppendorf i dodać 1 ml 70% etanolu. Dobrze wymieszać i inkubować przez 2 min. Wirować nasiona, a następnie odessać nadsącz.
   2. Dodać 1 ml 1,8% roztworu wybielacza* zawierającego 0,1% Tween-20. Mieszać przez 10 min. Wirować nasiona i odessać roztwór wybielacza.
   3. Ten etap musi być wykonany w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Dodać 1 ml sterylnej wody do nasion i dobrze wymieszać. Wirować nasiona i odessać wodę. Powtórzyć ten krok 5 razy.
2. Rozsiać nasiona na płytkach przygotowanych w kroku 1 (100 nasion/płytka).
3. Przechowywać wysiane płytki przez 24-48 h w temperaturze 4 °C w ciemności w celu przeprowadzenia stratyfikacji.
4. Uprawiać rośliny przez 14 dni w komorze wzrostowej z fotoperiodem 8 h światła/16 h ciemności (przy gęstości strumienia fotonów fotosyntetycznych 250 μmol m^-2s^-1), w reżimie temperatury 23/19 °C (światło/ciemność) i przy 75% wilgotności względnej.

*Wskazówka 1: Roztwór wybielacza przygotowuje się poprzez rozcieńczenie domowego środka Clorox, zawierającego 6% podchlorynu sodu, i dodanie Tween-20 do stężenia końcowego 0,1%.

Część 3. Izolacja protoplastów z siewek Arabidopsis.

1. Posiekaj 2 g 14-dniowych siewek za pomocą nowej żyletki w 15 ml filtrowanego i sterylizowanego roztworu TVL. Materiał roślinny siekamy w sterylnych jednorazowych szalkach Petriego.
2. Przenieś posiekane tkanki do zlewki o pojemności 200 ml, dodaj 20 ml filtrowanego i sterylizowanego roztworu enzymatycznego, zamieszaj zlewkę, aby tkanki wymieszały się z roztworem enzymatycznym, a następnie przykryj parafilmem i folią aluminiową.
3. Wstrząsaj tkankami roślinnymi z prędkością 35 rpm w ciemności, w temperaturze pokojowej przez 16-18 h.
4. Zabierz uwolnione protoplasty do probówki Falcon 50 ml, przeciskając materiał przez 8 warstw gazy, uprzednio zwilżonej roztworem W5.
5. Przeciągnij protoplasty z gazy jeszcze raz, przemywając ją 15 ml roztworu W5.
6. Ostrożnie nałóż 10 ml roztworu W5 na protoplasty, nie naruszając gradientu cukrowego; wiruj przez 7 min przy 100 g.
7. Zbierz 10 ml protoplastów z granicy roztworu enzymatycznego i roztworu W5 (Rys. 1B) i przenieś je do nowej probówki Falcon 50 ml.
8. Dodaj 15 ml roztworu W5, wiruj przez 5 min przy 60 g. Usuń nadsącz.
9. Wypłucz protoplasty z roztworu enzymatycznego, resuspendując je w 15 ml roztworu W5, a następnie wiruj przez 5 min przy 60 g.
10. Usuń nadsącz, resuspenduj osad protoplastów w 1-3 ml roztworu W5.
11. Oceń wydajność izolacji protoplastów, wykonując zliczenie komórek za pomocą hemocytometru.

Część 4. Odczynniki:

TVL: 0,3 M sorbitolu; 50 mM CaCl₂ Przefiltrować przez sterylizator i przechowywać w temperaturze -20 °C.

Roztwór enzymu: 0,5 M sacharozy, 10 mM MES-KOH [pH 5,7], 20 mM CaCl₂, 40 mM KCl, 1% celulazy (Onozuka R-10), 1% macerozymu (R10). Sterylizować przez filtr i używać bezpośrednio po przygotowaniu.

Roztwór W5: 0,1% (w/v) glukozy, 0,08% (w/v) KCl, 0,9% (w/v) NaCl, 1,84% (w/v) CaCl₂, 2 mM MES-KOH pH 5,7. Sterylizować przez filtr i przechowywać w temperaturze pokojowej.

Część 5: Reprezentatywne wyniki:

Zastosowanie warunków hodowli Arabidopsis opisanych w częściach 1 i 2 pozwala uzyskać zdrowe siewki, odpowiednie do izolacji protoplastów (Rys. 1A). Protoplasty są oczyszczane za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy i zbierane na granicy roztworów W5 oraz enzymów (Rys. 1B). Stosując procedurę izolacji protoplastów opisaną w części 3, zazwyczaj pozyskujemy 5-10 10⁶ nienaruszonych protoplastów (Rys. 1C) z jednego grama świeżych siewek.

Rysunek 1. Izolacja protoplastów z siewek Arabidopsis. A, Tkanki z 14-dniowych siewek Arabidopsis zostały pobrane i przekształcone w protoplasty zgodnie ze zmodyfikowaną procedurą według (Chen and Halkier, 2000). B, Protoplasty zostały oczyszczone metodą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy i zebrane na granicy roztworu enzymu i buforu W5 (białe strzałki). C, Mikroskopia protoplastów w polu jasnym. Mikrofotografie wykonano przy użyciu chłodzonej kamery CCD połączonej z mikroskopem Zeiss Axioscope 2 plus.

Dyskusja

Aby zapewnić wysoką wydajność uzyskania nienaruszonych protoplastów, bardzo ważne jest rozpoczęcie pracy ze zdrowymi roślinami. Do izolacji protoplastów należy używać roztworów sterylizowanych przez filtr. Należy pamiętać, że protoplasty są delikatne. Dlatego podczas pracy z protoplastami nie wolno ich intensywnie mieszać, pipetować ani wstrząsać na wortexie, ponieważ spowoduje to ich uszkodzenie. Zamiast tego protoplasty należy mieszać poprzez powolne obracanie lub delikatne opukiwanie probówki do wirowania. Opisana pro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podstawowa mieszanina soli Murashige i Skoog (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Szalki Petriego (100x15mm)	Krackeler Scientific, Inc.	82-4001
Celulaza (OnozukaR‐10)	Research Products International Corp.	C32200
Macerozyme (R10)	Research Products International Corp.	M22010
Gaza laboratoryjna	Fisher Scientific	06-665-29
Rotator laboratoryjny	Fisher Scientific	1167152Q
Wirówka AllegraX‐15R	VWR international	392932
Mikroskop Axioskop 2 Plus	Carl Zeiss, Inc.