Pomiar replikacyjnej długości życia drożdży pączkujących

Podsumowanie

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru replikacyjnej długości życia komórek macierzystych drożdży.

Streszczenie

Starzenie się jest procesem degeneracyjnym charakteryzującym się postępującym pogorszeniem stanu komponentów komórkowych i organelli, co prowadzi do śmierci. Drożdże pączkująceSaccharomyces cerevisiaebył szeroko wykorzystywany do badania biologii starzenia się, a wykazano, że kilka czynników determinujących długowieczność drożdży jest konserwatywnych u eukariontów wielokomórkowych, w tym u nicieni, muszek i myszy¹Ze względu na brak łatwo mierzalnych fenotypów związanych z wiekiem, starzenie się drożdży badano niemal wyłącznie poprzez pomiar długości życia komórek w różnych kontekstach, stosując dwa powszechnie używane paradygmaty długości życia²Chronologiczna długość życia odnosi się do czasu, przez który komórka macierzysta może przetrwać w stanie niedzielącym się, podobnym do stanu spoczynku, i proponuje się, aby służyła ona jako model starzenia się komórek postmitotycznych u eukariotów wielokomórkowych. Z kolei replikacyjna długość życia odnosi się do liczby komórek potomnych wytworzonych przez komórkę macierzystą przed wystąpieniem starzenia i uważa się, że stanowi ona model starzenia w komórkach aktywnych mitotycznie. Przedstawiamy tutaj uogólniony protokół pomiaru replikacyjnej długości życia komórek macierzystych drożdży pączkujących. Celem testu replikacyjnej długości życia jest ustalenie, ile razy każda komórka macierzysta wypączkuje. Doświadczony badacz może łatwo odróżnić komórki macierzyste od potomnych, używając standardowego mikroskopu optycznego (całkowite powiększenie 160X), takiego jak Zeiss Axioscope 40 lub inny porównywalny model. Fizyczna separacja komórek potomnych od komórek macierzystych jest realizowana przy użyciu manualnego mikromanipulatora wyposażonego w igłę światłowodową. Typowe laboratoryjne szczepy drożdży produkują 20-30 komórek potomnych na jedną komórkę macierzystą, a jeden eksperyment dotyczący długości życia trwa od 2 do 3 tygodni.

Protokół

Część 1: Przygotowanie szczepów i płytek do analizy replikacyjnej długości życia

W tej sekcji opisano przygotowanie stałych płytek YEPD do wykorzystania w eksperymencie dotyczącym replikacyjnej długości życia oraz przygotowanie komórek drożdży do analizy długości życia.

1. Stosując odpowiednią technikę sterylną, przygotuj płytki z agarem YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% bacto-peptonu, 2% agaru, 2% glukozy), które zostaną wykorzystane do hodowli komórek drożdży oraz do analizy replikacyjnej długości życia. Należy przygotować co najmniej 2 płytki na każde 4-5 szczepów analizowanych w eksperymencie długości życia. Płytki powinny zostać przygotowane co najmniej 2 dni przed eksperymentem i pozostawione do wyschnięcia przed rozpoczęciem analizy. Jeśli eksperyment nie zostanie rozpoczęty w ciągu 4-5 dni od wylania płytek, należy umieścić je w inkubatorze chłodniczym i owinąć parafilmem lub folią plastikową, aby zapobiec wysychaniu.
2. Wyjmij szczepy drożdży z mrożonych zapasów i wykonaj posiew smugowy w celu uzyskania pojedynczych kolonii na płytkach z agarem YEPD. Do 6 szczepów można łatwo wysiać na jednej płytce YEPD, dzieląc ją na równoliczne sektory w kształcie kawałków tortu.
3. Inkubuj komórki w temperaturze 30°C przez 2 dni.
4. Wyjmij komórki z inkubatora i przenieś komórki z pojedynczej kolonii metodą patchingu na świeżą płytkę YEPD. Dla każdego szczepu należy przygotować dwa patche z dwóch różnych kolonii. Na tym etapie analizowane szczepy powinny zostać zakodowane, aby zapewnić przeprowadzenie eksperymentu replikacyjnej długości życia metodą „ślepej próby”, w której osoby dokonujące dyssekcji nie znają tożsamości poszczególnych szczepów.
5. Inkubuj zakodowane, przeniesione komórki w temperaturze 30°C do następnego wieczora.
6. Wyjmij komórki i delikatnie przenieś komórki z każdego zakodowanego szczepu metodą patchingu na świeże płytki YEPD, które będą służyć jako płytki eksperymentalne do analizy replikacyjnej długości życia. Komórki należy nanosić wzdłuż linii pionowej po lewej stronie płytki YEPD (Rycina 1). Optymalna liczba to około 3-5 patchy na płytkę, zakładając analizę replikacyjnej długości życia 20 komórek z każdego patcha. Nie jest konieczne (ani wskazane) przenoszenie dużej liczby komórek na świeżą płytkę YEPD, ponieważ spowoduje to gęsty wzrost komórek podczas inkubacji nocnej, co może ograniczyć ich późniejszą replikacyjną długość życia.
7. Inkubuj świeżo przygotowane płytki przez noc w temperaturze pokojowej na blacie.

Część 2: Ustawienie komórek do analizy replikacyjnej długości życia.

W tej sekcji opisujemy sposób rozmieszczania komórek drożdży na płytce oraz metodę pozyskiwania dziewiczych komórek potomnych do analizy replikacyjnego czasu życia. Od tego momentu wszystkie płytki powinny być zabezpieczone folią Parafilm, z wyjątkiem czasu przeprowadzania sekcji, aby zapobiec wysychaniu.

1. Używając mikroskopu wyposażonego w aparat do mikrodysekcji odpowiedni dla drożdży, przenieś około 50 komórek z pierwszego wysianego szczepu w miejsce na płytce oddalone od wysianych komórek. Jeśli stolik mikroskopu posiada podziałkę, można z niej skorzystać, aby ułatwić odnalezienie komórek podczas kolejnych iteracji. W przypadku mikroskopu Zeiss Axioscope 40 komórki z pierwszego wysianego szczepu można umieścić w współrzędnych 90 x 10 i układać stamtąd w pionie.
2. Oczyść igłę z komórek, wielokrotnie dotykając powierzchni agaru, a następnie wykonaj otwór w agarze, przebijając go igłą. Otwór ten będzie służył jako znacznik orientacyjny na płytce podczas kolejnych iteracji dysekcji i usuwania komórek potomnych. Należy uważać, aby do otworu nie dostały się komórki drożdży, w przeciwnym razie urosną one i utworzą kolonię.
3. Bezpośrednio nad otworem ułóż pionowo pojedyncze komórki drożdży w 20 równomiernie rozmieszczonych pozycjach, zachowując odstęp 1-3 średnic igły (~100 μM) między każdą pozycją (Ryc. 1). Co kilka komórek umieść dwie komórki obok siebie w tej samej pozycji w linii zamiast jednej. Zapewnia to redundancję podczas selekcji dziewiczych komórek potomnych, jeśli jedna z przeniesionych komórek nie podzieli się.
4. Między 10^th a 11^th pozycją w linii wykonaj poziomą serię 7-8 otworów w agarze. Będą one służyć jako znacznik orientacyjny na płytce podczas kolejnych iteracji dysekcji i usuwania komórek potomnych. Należy uważać, aby do otworów nie dostały się komórki drożdży, w przeciwnym razie urosną one i utworzą kolonię.
5. Powtórz kroki 2.1-2.4 dla każdego wysiania na płytce, kontynuując układanie komórek w pionie wzdłuż tej samej osi. W kroku 2.2 liczba wykonanych otworów powinna odpowiadać numerowi wysiania (jeden otwór dla pierwszego wysiania, dwa otwory dla drugiego itd.).
6. Po ułożeniu komórek dla każdego wysiania, zabezpiecz płytkę folią Parafilm i inkubuj w 30°C przez około 2 godziny.
7. Powtórz kroki 2.1-2.6 dla każdej płytki w eksperymencie.

Część 3: Pozyskiwanie dziewiczych komórek potomnych do analizy długości życia

W tej sekcji rozpoczynamy analizę długości życia, upewniając się, że każda komórka startuje jako dziewicza komórka potomna.

1. Wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź, czy większość rozmieszczonych komórek uległa podziałowi. Jeśli wymagany jest dodatkowy czas na zakończenie podziału komórek, zwróć płytkę do inkubatora.
2. Zaczynając od pierwszej rozmieszczonej komórki, użyj igły, aby oddzielić komórki potomne od komórki macierzystej, delikatnie przykładając igłę do przylegających do siebie komórek. Czasami pomocne jest stuknięcie w bok podstawy mikroskopu w momencie, gdy igła spoczywa na komórkach.
3. Umieść oddzieloną komórkę potomną w linii pionowej, zastępując komórkę macierzystą oraz wszelkie dodatkowe komórki potomne i przesuwając je tymczasowo na bok.
4. Powtórz kroki 3.2 i 3.3 dla każdej z rozmieszczonych komórek. Jeśli komórka nie uległa podziałowi, pobierz komórkę potomną z jednej z nadmiarowych komórek umieszczonych w kroku 2.3. Po zakończeniu powinieneś otrzymać 20 komórek potomnych dla każdego patcha, wyrównanych pionowo na płytce do analizy długości życia.
5. Zbierz wszystkie komórki macierzyste i nadmiarowe komórki potomne w jedną grupę i przenieś je z powrotem w obszar w pobliżu patchy („cmentarzysko”). Ważne jest, aby trzymać niepotrzebne komórki z dala od komórek poddawanych analizie długości życia, aby zapobiec tworzeniu się mikrokolonii i wyczerpaniu lokalnych składników odżywczych.
6. Zabezpiecz płytkę Parafilmem i inkubuj w temperaturze 30°C przez około 2 godziny.
7. Powtórz kroki 3.2-3.6 dla każdej płytki w eksperymencie.

Część 4: Pomiar zdolności replikacyjnej pojedynczych komórek

1. Przygotować arkusze danych dotyczące długości życia. Arkusz danych dotyczący długości życia może być prostą tabelą, w której każdy wiersz odpowiada pojedynczej komórce macierzystej, a każda kolumna odpowiada punktowi czasowemu wieku (Rysunek 2). Oznaczyć każdy arkusz danych zgodnie z liczbą analizowanych szczepów.
2. Wyjąć płytki z inkubatora i sprawdzić, czy większość rozmieszczonych komórek przeszła co najmniej jeden podział komórkowy. Jeśli potrzebny jest dodatkowy czas na zakończenie podziału komórek, zwrócić płytkę do inkubatora.
3. Zaczynając od pierwszej rozmieszczonej komórki na pierwszej płytce, wizualnie zaobserwować komórkę macierzystą i komórkę(i) potomną oraz określić liczbę przeprowadzonych podziałów komórkowych. Zazwyczaj łatwo jest określić, ile komórek potomnych wytworzyła komórka macierzysta, na podstawie charakterystycznych wzorów rozmieszczenia komórek. Zapisać liczbę komórek potomnych wytworzonych przez komórkę macierzystą w odpowiednim polu w arkuszu oceny długości życia.
4. Użyć igły, aby oddzielić komórki potomne od komórki macierzystej, zgodnie z opisem w kroku 3.2.
5. Pozostawić komórkę macierzystą w jej pozycji w linii pionowej i przesunąć komórkę(i) potomną(e) tymczasowo na bok.
6. Powtórzyć kroki 4.3-4.5 dla każdej z rozmieszczonych komórek.
7. Zebrać wszystkie odseparowane komórki potomne i przenieść je do „cmentarzyska” (graveyard), znajdującego się w pobliżu oryginalnych plamek.
8. Zabezpieczyć płytkę Parafilmem i inkubować w temperaturze 30°C przez 2-3 godziny.
9. Powtórzyć kroki 4.3-4.8 dla każdej płytki w eksperymencie.
10. Powtórzyć kroki 4.2-4.9, aż wszystkie komórki macierzyste przestaną się dzielić. W miarę starzenia się komórek macierzystych progresja cyklu komórkowego zwalnia, dlatego wskazane będzie inkubowanie płytek przez dłuższe okresy czasu pomiędzy punktami czasowymi wieku. Płytki można przechowywać w temperaturze 4°C przez noc.

Część 5: Reprezentatywne wyniki.

Surowe dane uzyskane w eksperymencie nad replikacyjną długością życia stanowią listę liczb odpowiadających komórkom potomnym wytworzonym przez każdą komórkę macierzystą w każdym punkcie czasowym (Rysunek 2). Poprzez zsumowanie każdego wiersza arkusza wyników otrzymuje się replikacyjną długość życia dla każdej komórki macierzystej. Dane dla komórek macierzystych z tej samej grupy eksperymentalnej można połączyć w celu wygenerowania krzywej przeżywalności (Rysunek 3A) oraz przeprowadzenia obliczeń statystycznych, takich jak średnia długość życia, mediana długości życia oraz odchylenie standardowe. Można zastosować test nieparametryczny, taki jak test sum rang Wilcoxona, aby określić, czy między grupami eksperymentalnymi wykryto istotne różnice w długości życia. Gdy eksperyment przebiega prawidłowo, krzywa przeżywalności powinna być w przybliżeniu zgodna z kinetyką Gompertza-Makehama, wykazując kształt sigmoidalny z niską śmiertelnością wczesną, po której następuje stosunkowo szybki spadek przeżywalności i spłaszczenie krzywej w późniejszym wieku. Większość szczepów typu dzikiego wykazuje wartości replikacyjnej długości życia w zakresie 20-30 pokoleń, choć zgłaszano odchylenia poza ten zakres.

Rycina 1. Schemat typowej płytki do badania replikatywnej długości życia. Wieczorem przed rozpoczęciem mikrodyssekcji komórek drożdży, 3-5 szczepów jest lekko nakładanych na powierzchnię płytki YEPD (czerwone ramki) w linii pionowej wzdłuż jednej krawędzi płytki. Po nocnym wzroście, około 30 pojedynczych komórek z każdego szczepu jest rozmieszczanych pionowo w linii zawierającej 20 pozycji. Analiza długości życia zostanie przeprowadzona na pierwotnych komórkach potomnych uzyskanych z tych komórek wyjściowych. Dodatkowe komórki uzyskane podczas mikrodyssekcji w trakcie eksperymentu (np. niepożądane komórki potomne) są przenoszone do „cmentarza” (szary owal), który znajduje się z dala od komórek eksperymentalnych, aby uniknąć lokalnego wyczerpania składników odżywczych podczas tworzenia się kolonii.

Rycina 2. Arkusz zliczania replikatywnej długości życia. Przedstawiono surowe dane z eksperymentu nad replikatywną długością życia. Każdy wiersz odpowiada pojedynczej matczynej komórce drożdży, a każda kolumna odpowiada punktowi wiekowemu. Liczba wpisana w każdym polu to liczba komórek potomnych wytworzonych przez tę komórkę matczyną w danym punkcie wiekowym. Każdy szczep jest oznaczony kodem liczbowym w taki sposób, aby osoba dokonująca dyssekcji komórek drożdży nie miała wiedzy o tożsamości analizowanych szczepów. Dla każdego szczepu badaniu poddano dwadzieścia komórek.

Rycina 3. Reprezentatywne krzywe przeżywalności i wzrostu z eksperymentu nad replikatywną długością życia. (A) Krzywe przeżywalności uzyskano poprzez wykreślenie frakcji wciąż żyjących komórek macierzystych w funkcji wieku replikatywnego (liczby podziałów komórkowych). (B) Krzywe wzrostu uzyskano poprzez wykreślenie średniej liczby komórek potomnych wytworzonych przez dany szczep w funkcji punktu czasowego wieku. W tym przykładzie szczep nr 2 żyje dłużej, ale rośnie wolniej, co potwierdza mniejsze początkowe nachylenie wykresu wzrostu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Odczynnik	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Pepton	Odczynnik	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Ekstrakt drożdżowy	Odczynnik	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glukoza