Pomiar replikatywnej długości życia pączkujących drożdży

Summary

W tym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru żywotności replikacyjnej komórek macierzystych drożdży.

Abstract

Starzenie się to proces zwyrodnieniowy charakteryzujący się postępującym pogarszaniem się składników komórkowych i organelli, co prowadzi do śmiertelności. Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae były szeroko stosowane do badania biologii starzenia się i wykazano, że kilka determinantów długowieczności drożdży jest konserwatywnych u wielokomórkowych eukariontów, w tym robaków, much i myszy ¹. Ze względu na brak łatwych do określenia ilościowego fenotypów związanych z wiekiem, starzenie się drożdży było badane prawie wyłącznie poprzez pomiar długości życia komórek w różnych kontekstach, z dwoma różnymi paradygmatami długości życia w powszechnym użyciu ². Chronologiczna długość życia odnosi się do czasu, w którym komórka macierzysta może przetrwać w stanie niedzielącym się, podobnym do spoczynku i proponuje się, aby służyła jako model starzenia się komórek postmitotycznych u wielokomórkowych eukariontów. Z kolei replikacyjna długość życia odnosi się do liczby komórek potomnych wytwarzanych przez komórkę macierzystą przed starzeniem się i uważa się, że zapewnia model starzenia się w komórkach aktywnych mitotycznie . W tym miejscu przedstawiamy uogólniony protokół pomiaru replikatywnej długości życia pączkujących komórek macierzystych drożdży. Celem replikacyjnego testu długości życia jest określenie, ile razy każda komórka macierzysta zawiązkuje się. Komórki macierzyste i potomne mogą być łatwo rozróżnione przez doświadczonego badacza za pomocą standardowego mikroskopu świetlnego (całkowite powiększenie 160X), takiego jak Zeiss Axioscope 40 lub inny porównywalny model. Fizyczne oddzielenie komórek potomnych od komórek macierzystych odbywa się za pomocą ręcznego mikromanipulatora wyposażonego w igłę światłowodową. Typowe laboratoryjne szczepy drożdży wytwarzają 20-30 komórek potomnych na matkę, a jeden eksperyment z długością życia wymaga 2-3 tygodni.

Protocol

Część 1: Przygotowanie szczepów i płytek do replikacyjnej analizy żywotności

Ta sekcja opisuje przygotowanie stałych płytek YEPD do użycia w eksperymencie replikacyjnym długości życia oraz przygotowanie komórek drożdży do analizy długości życia.

1. Stosując odpowiednią sterylną technikę, przygotuj płytki agarowe YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% baktopeptonu, 2% agaru, 2% glukozy), które zostaną wykorzystane do hodowli komórek drożdży i do replikacyjnej analizy długości życia. Należy przygotować co najmniej 2 płytki na każde 4-5 szczepów, które mają być analizowane w eksperymencie dotyczącym długości życia. Płytki należy przygotować co najmniej 2 dni przed eksperymentem dotyczącym długości życia i pozostawić do wyschnięcia przed rozpoczęciem badania długości życia. Jeśli eksperyment nie zostanie rozpoczęty w ciągu 4-5 dni od wylania płytek, należy je umieścić w inkubatorze z chłodzeniem i owinąć w parafilm lub plastik, aby zapobiec wysuszeniu.
2. Usuń szczepy drożdży z zamrożonych wywarów i rozprowadź smugi dla pojedynczych kolonii na płytkach agarowych YEPD. Na tej samej płycie YEPD można łatwo rozsiać do 6 szczepów, dzieląc płytkę na kawałki w kształcie ciasta o równej wielkości.
3. Inkubować komórki w temperaturze 30°C przez 2 dni.
4. Usunąć komórki z inkubatora i umieścić komórki z pojedynczej kolonii na świeżej płytce YEPD. Dla każdego szczepu należy wygenerować dwie łaty z dwóch różnych kolonii. W tym czasie szczepy, które mają być analizowane, powinny być zakodowane, aby zapewnić, że eksperyment replikatywnej długości życia jest przeprowadzany "na ślepo", gdzie sekcje nie znają tożsamości poszczególnych szczepów.
5. Inkubować połatane, zakodowane komórki w temperaturze 30°C do następnego wieczora.
6. Usuń komórki i lekko załataj komórki z każdego kodowanego szczepu na świeże płytki YEPD, które posłużą jako płytki eksperymentalne używane do replikacyjnej analizy długości życia. Komórki należy załatać wzdłuż pionowej linii po lewej stronie płytki YEPD (ryc. 1). Optymalna jest około 3-5 plastrów na płytkę, przy założeniu replikacyjnej analizy żywotności na 20 komórkach z każdej łaty. Nie jest konieczne (ani pożądane) przenoszenie dużej liczby komórek na świeżą płytkę YEPD, ponieważ spowoduje to gęsty wzrost komórek podczas inkubacji przez noc, co może ograniczyć ich późniejszą żywotność replikacyjną.
7. Inkubuj świeżo załatane płytki przez noc na blacie stołu.

Część 2: Umieść komórki do replikacyjnej analizy długości życia.

W tej sekcji opisujemy, jak umieścić komórki drożdży na płytce i jak uzyskać pierwotne komórki potomne do replikacyjnej analizy długości życia. Od tego momentu wszystkie płytki powinny być parafilmowane, z wyjątkiem okresów poddawanych sekcji, aby zapobiec wysuszeniu.

1. Za pomocą mikroskopu wyposażonego w aparat do mikrodysekcji odpowiedni dla drożdży, przenieś około 50 komórek z pierwszego załatanego szczepu do pozycji na płytce dystalnej do połatanych komórek. Jeśli stolik mikroskopu jest stopniowany, te gradacje można zastosować, aby zapewnić, że komórki będą łatwe do znalezienia podczas kolejnych iteracji. W Zeiss Axioscope 40 komórki z pierwszego załatanego szczepu można umieścić na współrzędnych 90 x 10 i stamtąd ułożyć pionowo.
2. Oczyść igłę z komórek, wielokrotnie dotykając powierzchni agaru, a następnie utwórz otwór w agarze poprzez przepchnięcie igły przez powierzchnię agaru. Otwór ten posłuży jako znacznik do orientacji na płytce podczas kolejnych iteracji sekcji i usuwania komórek potomnych. Uważaj, aby komórki drożdży nie dostały się do otworu, w przeciwnym razie będą rosły i tworzyły kolonię.
3. Bezpośrednio nad otworem wyrównaj pionowo poszczególne komórki drożdży w 20 równomiernie rozmieszczonych pozycjach, z 1-3 średnicami igieł (~100 μM) między każdą pozycją komórki (ryc. 1). Co kilka komórek umieść dwie sąsiadujące ze sobą komórki w tym samym miejscu w linii, a nie jedną. Pozwala to na redundancję podczas selekcji pierwotnych komórek potomnych, jeśli jedna z przenoszonych komórek nie dzieli się.
4. Pomiędzy 10^a 11 pozycją w linii utwórz poziomą serię 7-8 otworów w agarze. Będzie to służyć jako marker do orientacji na płytce podczas kolejnych iteracji sekcji i usuwania komórek potomnych. Uważaj, aby komórki drożdży nie dostały się do otworów, w przeciwnym razie będą rosły i tworzyły kolonię.
5. Powtórz kroki 2.1-2.4 dla każdej łaty na płytce, kontynuując układanie komórek pionowo wzdłuż tej samej osi. W kroku 2.2 liczba utworzonych otworów powinna odpowiadać numerowi łaty (jeden otwór dla pierwszej łatki, dwa otwory dla drugiej itd.).
6. Po ułożeniu komórek na każdym plastrze, należy sparafilmować płytkę i inkubować w temperaturze 30°C przez około 2 godziny.
7. Powtórz kroki 2.1-2.6 dla każdej płytki w doświadczeniu.

Część 3: Uzyskanie pierwotnych komórek potomnych do analizy długości życia

W tej sekcji rozpoczynamy analizę długości życia, upewniając się, że każda komórka zaczyna się jako pierwotna komórka potomna.

1. Wyjąć płytki z inkubatora i sprawdzić, czy większość ułożonych komórek została poddana podziałowi komórkowemu. Jeśli potrzeba więcej czasu, aby umożliwić zakończenie podziału komórek, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
2. Zaczynając od pierwszej komórki w układzie, użyj igły, aby odłączyć komórki potomne od komórki macierzystej, delikatnie umieszczając igłę na przymocowanych komórkach. Czasami pomocne jest stuknięcie w bok podstawy mikroskopu, gdy igła spoczywa na komórkach.
3. Umieść odłączoną komórkę potomną w linii pionowej, zastępując komórkę macierzystą i wszelkie dodatkowe komórki potomne i tymczasowo odsuwając je na bok.
4. Powtórz kroki 3.2 i 3.3 dla każdej z komórek w tablicy. Jeśli komórka nie może się podzielić, weź komórkę potomną z jednej z nadmiarowych komórek umieszczonych w kroku 2.3. Po zakończeniu powinieneś mieć 20 komórek potomnych dla każdej łatki wyrównanych pionowo na płytce żywotności.
5. Zbierz wszystkie komórki macierzyste i dodatkowe komórki potomne w stos i przenieś je z powrotem do obszaru w pobliżu plam ("cmentarz"). Ważne jest, aby trzymać niechciane komórki z dala od komórek poddawanych analizie długości życia, aby zapobiec tworzeniu się mikrokolonii i wyczerpaniu lokalnych składników odżywczych.
6. Sparafilmować płytkę i inkubować w temperaturze 30°C przez około 2 godziny.
7. Powtórz kroki 3.2-3.6 dla każdej płytki w eksperymencie.

Część 4: Pomiar zdolności replikacyjnej poszczególnych komórek

1. Przygotuj arkusze danych dotyczących długości życia. Arkusz danych dotyczących długości życia może być prostą siatką, w której każdy wiersz odpowiada pojedynczej komórce macierzystej, a każda kolumna odpowiada punktowi wiekowemu (rysunek 2). Oznacz każdy arkusz danych zgodnie z liczbą szczepów, które mają być analizowane.
2. Wyjąć płytki z inkubatora i sprawdzić, czy większość ułożonych komórek przeszła co najmniej jeden podział komórkowy. Jeśli potrzeba więcej czasu, aby umożliwić zakończenie podziału komórek, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
3. Zaczynając od pierwszej komórki ułożonej w układzie na pierwszej płytce, obserwuj wzrokowo komórkę (komórki) matkę i komórkę potomną i określ liczbę podziałów komórkowych, które wystąpiły. Ogólnie rzecz biorąc, łatwo jest określić, ile komórek potomnych wyprodukowała matka, na podstawie charakterystycznych wzorców ułożenia komórek. Zapisać liczbę komórek potomnych wytworzonych przez komórkę macierzystą w odpowiednim polu na arkuszu oceny długości życia.
4. Użyj igły, aby odłączyć komórki potomne od komórki macierzystej, jak opisano w kroku 3.2.
5. Pozostaw komórkę macierzystą na swoim miejscu w linii pionowej i tymczasowo odsuń komórkę potomną (komórki potomne) na bok.
6. Powtórz kroki 4.3-4.5 dla każdej z komórek w tablicy.
7. Zbierz wszystkie odrzucone komórki potomne i przenieś je na "cmentarz", znajdujący się w pobliżu oryginalnych łatek.
8. Parafilmować płytkę i inkubować w temperaturze 30°C przez 2-3 godziny.
9. Powtórz kroki 4.3-4.8 dla każdej płytki w doświadczeniu.
10. Powtarzaj kroki 4.2-4.9, aż wszystkie komórki macierzyste przestaną się dzielić. Wraz ze starzeniem się komórek macierzystych postęp cyklu komórkowego staje się wolniejszy i pożądane będzie inkubowanie płytki przez dłuższe okresy czasu między punktami starczymi. Talerze można umieszczać w temperaturze 4°C na noc.

Część 5: Reprezentatywne wyniki.

Surowe dane uzyskane w eksperymencie replikacyjnym długości życia to lista liczb odpowiadających komórkom potomnym wyprodukowanym przez każdą komórkę matkę w każdym punkcie wieku (Rysunek 2). Sumując każdy wiersz arkusza wyników, uzyskuje się replikacyjną długość życia dla każdej komórki macierzystej. Dane dla komórek macierzystych z tej samej grupy eksperymentalnej można połączyć w celu wygenerowania krzywej przeżycia (ryc. 3A) i wykonania obliczeń statystycznych, takich jak średnia długość życia, mediana długości życia i odchylenie standardowe. Test nieparametryczny, taki jak test sumy rang Wilcoxona, można przeprowadzić w celu określenia, czy wykryto znaczące różnice w długości życia między grupami eksperymentalnymi. Gdy eksperyment przebiegnie poprawnie, krzywa przeżycia powinna być w przybliżeniu zgodna z kinetyką Gompertza-Makehama, wykazującą sigmoidalny kształt z niską wczesną śmiertelnością, po którym nastąpił stosunkowo szybki spadek przeżycia i spłaszczenie krzywej w późniejszym wieku. Większość szczepów typu dzikiego ma powtarzalne wartości długości życia w zakresie 20-30 pokoleń, chociaż odnotowano różnice poza tym zakresem.

Rysunek 1. Schemat typowej replikacyjnej tabliczki żywotności. Wieczorem przed rozpoczęciem mikrodysekcji komórek drożdży, 3-5 szczepów jest lekko łatanych na powierzchni płytki YEPD (czerwone pudełka) w pionowej linii wzdłuż jednej strony płytki. Po nocnym wzroście około 30 pojedynczych komórek z każdego szczepu jest ustawianych pionowo w linii zawierającej 20 pozycji. Analiza długości życia zostanie przeprowadzona na v dziewiczych komórkach potomnych uzyskanych z tych początkowych komórek. Dodatkowe komórki uzyskane z mikrodysekcji podczas eksperymentu (np. niechciane komórki potomne) umieszcza się na "cmentarzu" (szary owal), który znajduje się z dala od komórek doświadczalnych, aby uniknąć miejscowego wyczerpania składników odżywczych podczas tworzenia kolonii.

Rysunek 2. Replikacyjny arkusz podsumowujący żywotność. Pokazane są nieprzetworzone dane z eksperymentu replikacyjnego dotyczącego długości życia. Każdy wiersz odpowiada pojedynczej komórce macierzystej drożdży, a każda kolumna odpowiada punktowi wieku. Liczba wpisana w każde pole to liczba komórek potomnych wytworzonych przez tę komórkę macierzystą w tym punkcie wieku. Każdy szczep jest oznaczony zakodowanym numerem, tak aby osoba przeprowadzająca sekcję komórek drożdży nie miała wiedzy na temat tożsamości analizowanych szczepów. Dla każdego szczepu bada się dwadzieścia komórek.

Rysunek 3. Reprezentatywne krzywe przeżycia i wzrostu z replikacyjnego eksperymentu długości życia. (A) Krzywe przeżycia uzyskuje się przez wykreślenie frakcji komórek macierzystych wciąż żyjących w funkcji wieku replikacyjnego (liczba podziałów komórkowych. (B) Krzywe wzrostu uzyskuje się poprzez wykreślenie średniej liczby komórek potomnych wytwarzanych przez dany szczep w funkcji punktu wieku. W tym przykładzie szczep #2 jest dłużej żyjący, ale rośnie wolniej, o czym świadczy zmniejszone początkowe nachylenie poletka wzrostowego.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik agarowy		Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Odczynnik	bakto-peptonowy	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Odczynnik do ekstraktu drożdżowego		Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glukoza