Intrawitalne przełączanie fotofizyczne i śledzenie komórek nowotworowych znakowanych Dendra2 za pomocą okna obrazowania gruczołu mlekowego (Mammary Imaging Window) to technika, która pozwala na obrazowanie zachowania przerzutowego komórek nowotworowych w wybranych mikrośrodowiskach guza w skali czasowej obejmującej wiele dni.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przełączanie fotonowe Dendra2 przez okno obrazowania piersi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W ciągu ostatniej dekady mikroskopia intravitalna guzów piersi u myszy i szczurów z rozdzielczością pojedynczych komórek1-4doprowadziło do uzyskania ważnych informacji na temat mechanizmów zachowań przerzutowych, takich jak migracja, inwazja i intrawasacja komórek nowotworowych5, 6, angiogeneza3i odpowiedź komórek odpornościowych7-9Niedawno opisaliśmy technikę obrazowania ortotopowych raków piersi w trakcie wielu sesji obrazowania intravitalnego u żywych myszy10W tym celu opracowaliśmy okno obrazowania gruczołu mlekowego (Mammary Imaging Window, MIW) oraz zoptymalizowaliśmy parametry obrazowania dla białka Dendra211fotoprzełączanie i obrazowaniein vivoW niniejszym opracowaniu opisujemy protokół wytwarzania MIW, umieszczania MIW na powierzchni guza oraz obrazowania komórek nowotworowych znakowanych Dendra2 przy użyciu specjalnie skonstruowanej komory obrazującej. Protokół ten może być wykorzystany do obrazowania zachowań metastatycznych komórek nowotworowych w różnych mikrośrodowiskach w obrębie guzów i umożliwia długotrwałe obrazowanie naczyń krwionośnych, komórek nowotworowych oraz komórek gospodarza.
Protokół
1. Generowanie fluorescencyjnych guzów poprzez wstrzyknięcie komórek nowotworowych do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego:
- Hodować linię komórkową wykazującą ekspresję białka Dendra2 (jako markera cytoplazmatycznego) do 40 - 80% konfluencji.
- Przepłukać szalki co najmniej 3 razy PBS bez Ca2+ lub Mg2+.
- Dodać 3 ml trypsyny na każdą szalkę 10 cm i inkubować w 37 °C, aż większość komórek odklei się, a następnie uderzyć szalką o płaską powierzchnię, aby ją wstrząsnąć.
- Spłukać wszystkie komórki z szalki, a następnie użyć skrobaka (gumowego policemana), aby zebrać również macierz. Dodać 5 ml PBS. Pobrać alikwot do policzenia podczas wirowania.
- Wirować przy 800 g przez 5 min.
- Odssać nadsącz i resuspendować w PBS do stężenia 5- 10x 106/ml. Przechowywać w lodzie do momentu iniekcji (wykonać iniekcję w ciągu 30 min).
- Umieścić klatkę zawierającą 4-5 tygodniowe samice myszy z niedoborem odporności (np. SCID) wewnątrz sterylnego komina.
- Spryskać obszar wokół 4. sutka (brzusznego) 70% etanolem.
- Wstrzyknąć 0,1 ml do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego. Jeśli dostępny jest asystent, jedna osoba może unieruchomić mysz, podczas gdy druga wprowadza igłę do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego. W przypadku wykonywania iniekcji samodzielnie, poddać mysz lekkiej anestezji z użyciem izofluranu.
- Gdy guz urośnie do 5-7 mm, należy wprowadzić okno obrazowania gruczołu piersiowego (MIW).
Uwaga: Alternatywnie, w niektórych zastosowaniach MIW można wprowadzić na zdrową tkankę tłuszczową gruczołu piersiowego, a komórki wstrzyknąć później. Takie podejście umożliwia obrazowanie komórek przejściowo transfekowanych w środowisku fizjologicznym.
2. Ręczne wykonanie okna obrazowania gruczołu mlekowego (Mammary Imaging Window, MIW):
- MIW (rycina 1A) są wykonane z tworzywa sztucznego klasy tkankowej, aby zagwarantować biokompatybilność. Do konstrukcji ręcznej używamy szalek o średnicy 5 lub 10 cm.
- Założyć rękawiczki lateksowe.
- Podgrzać szalkę do hodowli tkanek i utworzyć zakrzywioną powierzchnię, dociskając rozgrzaną szalkę za pomocą zaokrąglonego, twardego przedmiotu (w tym celu używamy bitu do dremela o rozmiarze 1 cala).
- Wyciąć środek szalki za pomocą podgrzanej żyletki.
- Użyć małego, stożkowatego bitu do dremela, aby wykonać otwór w centrum kopulastej podstawy z tworzywa sztucznego (o średnicy 6-7 mm).
- Wygładzić całkowicie krawędzie podstawy z tworzywa sztucznego, szlifując ją dremelem i dodatkowo opiłowując.
- Opiłować górną część podstawy z tworzywa sztucznego, tworząc płaską powierzchnię pod szkiełko podstawowe. Średnica opiłowanej, płaskiej powierzchni powinna wynosić 9-10 mm.
- Przykleić okrągłe szkiełko podstawowe o średnicy 8 mm (numer 1) do wypłaszczonej powierzchni za pomocą superglue (kleju cyjanoakrylowego).
- Odczekać do wyschnięcia kleju (15 minut).
- Użyć podgrzanej igły 26G, aby wykonać osiem otworów szwalnych, przebijając podstawę od zewnątrz (od strony szkła) do wewnątrz. Otwory powinny być rozmieszczone równomiernie wokół szkiełka, w odległości 0,5-1 mm od jego krawędzi.
- Poszerzyć otwory za pomocą igły szwalnej 5-0.
- Przebijanie otworów w plastikowej podstawie spowoduje nierówności wewnętrznej powierzchni. Używając papieru ściernego, należy całkowicie wygładzić tę powierzchnię.
- Zmienić rękawiczki i usunąć małe cząsteczki plastiku z MIW za pomocą małego pędzla.
- Przemyć MIW wodą dejonizowaną.
- Przemyć MIW 70% etanolem. Użyć patyczka higienicznego do oczyszczenia szkła, aby było całkowicie przezroczyste. W przypadku wystąpienia zamglonych plam powstałych z oparów kleju, ostrożnie użyć acetonu i patyczka higienicznego.
- Zsterylizować MIW poprzez ekspozycję na promieniowanie UV przez 3 h z każdej strony.
Półautomatyczne wykonanie okna obrazowania gruczołu mlekowego (MIW):
W celu wykonania plastikowej podstawy obecnie stosujemy formy odlewnicze z gumy silikonowej, stworzone przy użyciu ręcznie wykonanych MIW. Forma składa się z dwóch części z gumy silikonowej, które po wypełnieniu żywicą poliestrową i natychmiastowym połączeniu tworzą dokładną replikę zarówno przodu, jak i tyłu oryginału. Płynna żywica poliestrowa jest mieszana w proporcji 9:10, co po pełnym utwardzeniu w ciągu 48h daje twardą strukturę. Plastik jest chroniony przed promieniowaniem UV i ma właściwości archiwalne, nie ulegając rozpadowi ani nie żółknąc z upływem czasu.
Po utwardzeniu podstawy kroki 2.8-2.16 wykonuje się w ten sam sposób, co w przypadku ręcznie wykonanych MIW.
3. Wprowadzenie MIW:
- Obszar wokół 4th sutka powinien zawierać mały guz (o średnicy 5-7 mm) kilka dni/tygodni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, w zależności od typu komórek (Rycina 1B). Czas, który upłynął po wstrzyknięciu komórek wykazujących ekspresję fotoprzełączalnego białka Dendra2 lub innych białek fluorescencyjnych, zależy od użytej linii komórkowej. Guz nie powinien wykazywać widocznej martwicy i powinien być pokryty nienaruszoną skórą z owłosieniem. Myszy z guzami martwiczymi należy poddać eutanazji.
- Przygotować sterylną przestrzeń do operacji – rozłożyć kawałek sterylnej tkaniny wewnątrz sterylnego dygestorium. Na środku położyć kawałek sterylnej gazy, a wokół niej kilka okien mikroskopowych (MIW) oraz sterylne narzędzia: używamy małych standardowych nożyczek, nożyczek sprężynowych, pęset mikrosekcyjnych, pęset mikrochirurgicznych oraz prowadnika igieł. W rogu dygestorium należy umieścić sterylne patyczki bawełniane, butelkę z 70% etanolem i sterylne rękawiczki.
- Mysz zostaje znieczulona w sterylnym dygestorium poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo (IP) 2,5% awertyny (20 μl/g) w HBSS lub alternatywnie 10 μg/kg ketaminy + 10 μg/g ksylazyny (należy skontaktować się z Instytutem Opieki nad Zwierzętami w celu uzyskania zgód i zamówienia środków).
Uwaga: Roztwór awertyny należy przygotowywać co dwa tygodnie, sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w alikwotach po 500 μl w temperaturze 4 °C (w ciemności). - Usunąć owłosienie, goląc obszar nad guzem za pomocą trymera dla małych zwierząt.
- Usunąć resztę włosów za pomocą kremu do depilacji Nair (dostępnego w drogeriach). Oczyścić skórę za pomocą patyczków bawełnianych nasączonych etanolem.
- Przenieść zwierzę na sterylną gazę i nałożyć maść oftalmiczną do oczu, aby zapobiec ich wysuszeniu i infekcji.
- Zdezynfekować skórę betadyną i oczyścić 70% etanolem.
- Przenieść zwierzę na sterylną tkaninę chirurgiczną wewnątrz sterylnego dygestorium.
- Odciągnąć skórę bezpośrednio przyśrodkowo od sutka za pomocą pęsety i wykonać nacięcie skóry o długości ok. 2 mm.
- Oddzielić leżący poniżej tkankowy podkład tłuszczowy gruczołu mlekowego od skóry za pomocą nożyczek sekcyjnych i pęsety. Podczas tego etapu oddzielania skóra i otwór rozciągają się do rozmiaru umożliwiającego włożenie okna mikroskopowego (MIW).
- Jeśli podczas operacji przypadkowo zostanie uszkodzone naczynie, należy użyć sterylnego patyczka bawełnianego, aby usunąć krew lub zapobiec nadmiernemu krwawieniu.
- Włożyć MIW w taki sposób, aby nad jego podstawą znajdowała się skóra, a następnie zaszyć go, używając nici niewchłanialnej i igły tnącej w kierunku odwrotnym.
- Użyć kleju tkankowego lub cyjanoakrylanu, aby wypełnić otwory po szwach i przymocować MIW do skóry.
- Dodać mieszankę antybiotyków TMP-SMX (sulfametoksazol 0,6 mg/ml, trimetoprim 0,12 mg/ml) do wody w poidełku klatkowym na 3 dni przed i po operacji.
- Zwierzę pozostaje pod wpływem znieczulenia przez 1-4 h po wstrzyknięciu awertyny IP. Ponieważ operacja trwa zazwyczaj ok. 45 min, ważne jest wsparcie zwierzęcia w rekonwalescencji:
- Umieścić ręczny podkład grzewczy (37 °C) (dostępny w aptekach) na dnie klatki i przykryć go gazą.
- Trzymać zwierzę na podkładzie do momentu, aż obróci się na brzuch i zacznie chodzić.
- Jeśli zwierzę pozostaje nieprzytomne przez więcej niż 3 h, wstrzyknąć 0,3 ml HBSS dootrzewnowo w celu rehydratacji.
- Zwierzęciu pozwala się na rekonwalescencję przez kolejne 3-4 dni przed przeprowadzeniem pierwszej sesji obrazowania.
4. Budowa komory obrazowania
Komora do obrazowania zapewnia, że MIW spoczywa płasko, bezpośrednio nad obiektywem mikroskopu. Ułatwia ona również kontrolę temperatury i znieczulenia poprzez stały przepływ izofluranu. Komora jest wykonana z pleksiglasu i sklejona za pomocą spoiny plastikowej. Jest ona dostosowana do konkretnego stolika mikroskopowego, dlatego kształt jej dna różni się w zależności od użytego mikroskopu (rycina 2 przedstawia schemat komory dostosowanej do stolika mikroskopu Leica SP5).
Wymiary komory w centymetrach to l=11,4 cm, w=7,6 cm, h=4,4 cm (rycina 2A). Dno komory składa się z pustej płyty o rozmiarach 12,7x8,4 cm, która pasuje do stolika mikroskopu Leica SP5, oraz dwóch przesuwnych „drzwi” o wymiarach 5,7 X 5,7 cm każda, które po zamknięciu tworzą okrągły otwór (d=2,22 cm). MIW jest dopasowany do tego otworu. Przednia część zawiera otwór wlotowy do podawania środka znieczulającego, natomiast jedna z części bocznych zawiera otwór wylotowy prowadzący do pompy próżniowej.
Należy pamiętać, że przed umieszczeniem komory do obrazowania należy usunąć kondensator i uchwyt na preparat.
5. Stosowanie komory obrazowej
- Zpodaj zwierzęciu znieczulenie izofluranem i nałóż maść oftalmiczną na oczy.
- Podłącz wylot izofluranu z aparatu do znieczulania do przodu skrzynki obrazującej, na zewnątrz otworu wlotowego (Rycina 2B).
- Podłącz drugą rurkę do otworu wylotowego skrzynki obrazującej. Rurka ta powinna być podłączona do filtra gazowego, a następnie do odsysacza.
- Otwórz pokrywę oraz drzwiczki skrzynki, umieść zwierzę stroną MIW skierowaną do dołu i przesuń drzwiczki do wnętrza skrzynki.
- Przytrzymaj skrzynkę i dostosuj dolne drzwiczki tak, aby podstawa MIW była między nimi utrzymana i unieruchomiona. Podstawa MIW powinna znajdować się na tym samym poziomie co drzwiczki skrzynki obrazującej, natomiast szkiełko okrywowe MIW powinno znajdować się zaledwie kilka milimetrów poniżej tego poziomu. Upewnij się, że ułożenie MIW między dolnymi przesuwnymi drzwiczkami gwarantuje, że szkiełko okrywowe (szklana część MIW) leży płasko i równolegle do dolnych drzwiczek skrzynki. Zapewni to prawidłowe ustawienie ostrości.
- Obniż obiektyw mikroskopu, aby zrobić miejsce na umieszczenie skrzynki na stoliku mikroskopowym.
- Umieść skrzynkę na stoliku mikroskopowym i ustaw stolik tak, aby szkiełko okrywowe MIW znajdowało się nad obiektywem.
- Ustaw ostrość obiektywu i rozpocznij obrazowanie.
- Podczas stosowania izofluranu stan zwierzęcia należy monitorować poprzez wizualną kontrolę częstotliwości oddechów. Można to robić bezpośrednio lub poprzez monitorowanie częstotliwości artefaktów oddechowych pojawiających się podczas zbierania obrazów (mogą one zakłócać akwizycję danych). Z sukcesem stosowano system pulsoksymetrii MouseOx (Starr life Sciences Corp). W ten sposób dane mogą być zbierane w sposób ciągły bez konieczności zapalania światła w pomieszczeniu w celu sprawdzenia stanu zwierzęcia.
Uwaga: Po każdej sesji obrazowania należy wspomóc wybudzanie zwierzęcia, owijając małą ręczną podkładkę grzewczą w gazę lub chusteczki Kimwipes i kładąc ją pod zwierzęciem w klatce.
Uwaga: Jeśli do obrazowania przez MIW używany jest obiektyw imersyjny, medium imersyjne (glicerol, woda, olej) należy usunąć z okna obrazującego. Należy sprawdzić, czy MIW nie posiada pęknięć ani innych uszkodzeń, które mogły powstać podczas obrazowania. Jest to kluczowe dla zbierania danych podczas wielu sesji obrazowania.
6. Fotoprzekluczanie i obrazowanie komórek znakowanych Dendra2
Procedura została opisana dla mikroskopu konfokalnego Leica SP5; moc lasera w płaszczyźnie ogniskowej, dostępne obiektywy oraz opcje oprogramowania różnią się w zależności od stosowanego mikroskopu konfokalnego lub zestawu do obrazowania wielofotonowego, w związku z czym poniższy protokół należy traktować jako wskazówkę do optymalizacji eksperymentu na własnym mikroskopie.
- Obserwując nowotwór przez okular (10x) z użyciem filtru fluorescencji zielonej, należy zlokalizować główne naczynia krwionośne, w których widoczny jest przepływ i które leżą płasko w tej samej płaszczyźnie ogniskowania.
- Należy ustawić jedno z naczyń w centrum pola widzenia i przełączyć się na detekcję PMT.
- Należy skonfigurować sekwencyjny pobór obrazów dla dwóch kanałów. Jeden z kanałów wykorzystuje linię lasera 488nm (moc 10%) i rejestruje rozproszenie z macierzy zewnątrzkomórkowej (480-495nm) oraz emisję z zielonej formy Dendra2 (505-540nm). Drugi kanał wykorzystuje linię lasera 543nm (moc 90%) i rejestruje emisję z czerwonej formy Dendra2 (555-600nm). Należy zebrać obrazy 3D przed fotoprzełączeniem.
- Należy użyć opcji skanowania ROI, aby przeprowadzić fotoprzełączenie wybranej populacji komórek za pomocą linii lasera 405nm (moc 30%, 20-40 skanowań). W celu monitorowania przełączania należy rejestrować emisję czerwonej formy białka.
- Korzystając z tej samej procedury sekwencyjnej co w punkcie 6.3, należy zebrać obrazy 3D po przełączeniu.
- W przypadku fotoprzełączania więcej niż jednego obszaru w nowotworze zaleca się wykonanie zdjęć przez okulary za pomocą kamery cyfrowej, w obu kanałach – zielonym i czerwonym (Rysunek 3A, B). Ułatwi to orientację podczas kolejnych sesji obrazowania.
Uwaga: Dodatkowo naczynia krwionośne można tymczasowo oznakować, wstrzykując do żyły ogonowej fluorescencyjny dekstran (Cascade Blue lub Alexa Fluor 647, oba 10kDa). Kilka godzin po wstrzyknięciu dekstrany opuszczą naczynia krwionośne i trwale oznakują makrofagi.
Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 3C przedstawia prostokątny obszar poddany fotoprzełączaniu (czerwony), zorientowany ortogonalnie względem naczynia krwionośnego (brak fluorescencji). Komórki niepoddane fotoprzełączaniu są zielone, natomiast rozproszenie z macierzy zewnątrzkomórkowej ma kolor fioletowy. Obraz stanowi projekcję maksymalnej intensywności czterech obrazów wzdłuż osi Z (głębokość 20-50 μm).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Departament Obrony USA (BC075554 dla B.G. i BC061403 dla D.K.), Narodowe Instytuty Zdrowia USA (U54GM064346 dla J.v.R.; CA100324 dla J.C., J.E.S. i J.W.; CA77522 dla J.E.S., U54CA126511 dla J.C. i B.G.). Dziękujemy D. Entenberg za pomoc w mikroskopii, M. Rottenkolber za pomoc w wykonaniu komory obrazowej oraz J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) za przeciwciało F4/80.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PBS bez Ca, Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsyna | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | |
| Pożywka DMEM (komórki MDA-MB-231) | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Izofluran (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | # NDC 10019-773-40 | |
| Mysz SCID | National Cancer Institute | N/A | |
| Szalki hodowlane | BD Biosciences | 353003 | Zamówienie specjalne |
| Okrągłe szkiełko nakrywkowe 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
Bibliografia
- Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein. Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).
- Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis. J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).
- Brown, E. B. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Med. 7, 864-868 (2001).
- Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling. Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).
- Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).
- Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
