Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

umieszczanie koralików pokrytych czynnikiem wzrostu na eksplantatach grzbietowego przodomózgowia

Ten film pokazuje dwie metody przygotowania i umieszczania koralików, które zostały pokryte czynnikiem wzrostu, na eksplantatach rozwijającej się kory mózgowej. Kulki te mogą być używane do indukowania ograniczonej przestrzennie ekspresji genów na rozwijającej się tkance nerwowej, takiej jak eksplantaty przodomózgowia. Podano metody stosowania zarówno kulek Affi-Gel, jak i kulek akrylowych heparyny.

Umieszczanie koralików pokrytych czynnikiem wzrostu na eksplantatach grzbietowego przodomózgowia

Więc to są pierwszy rodzaj koralików, których użyję. Są to żelowe niebieskie kulki żelowe. Są miękkie.Muszę więc użyć szklanej pipety z pulą na końcu pipety do ust, aby umieścić te koraliki na Xs.Drugim rodzajem koralików, które zademonstruję, są koraliki akrylowe heparyny. Są to sztywne koraliki i umieszczę je na X eksplantatach za pomocą igły wolframowej. To są szklane rurki kapilarne, które najpierw stopię za pomocą palnika Bunsena.Następnie wyciągnę je, aby stworzyć drobniejszą końcówkę. Trzymam więc rurkę kapilarną w środku płomienia i zwijam ją, gdy rurka się topi. Czuję, jak mięknie.Podniosę go z płomienia, a następnie wyciągnę. Zamierzam wytrawić linię w poprzek rurki kapilarnej za pomocą tego pisaka z diamentową końcówką, aby uzyskać ładne proste cięcie. Następnie wypoleruję końcówki na płomieniu, aby to posprzątać.Zamierzam przepuścić kapilę przez płomień, aby wypolerować koniec i zmniejszyć otwór, aby mógł uchwycić koralik, a nie koralik przechodzący przez kapilarę. Ważną rzeczą, na którą należy zwrócić uwagę, jest to, że nie chcesz trzymać rurki kapilarnej w płomieniu zbyt długo. W rzeczywistości jest to bardzo szybkie przejście, w przeciwnym razie się uszczelni.Zwykle robię kilka z nich, ponieważ wiele z nich okazuje się tam, gdzie końcówka jest uszczelniona przez płomień. Trudno to kontrolować, więc po prostu robisz kilka. Jest to przykład takiego, w którym końcówka została uszczelniona.To jest przykład dobrej pipety. Odpipetowałem 250 mikrolitrów kulek agel do tej rurki einor i zamierzam umyć je pięć razy jednym mililitrem PBS, aby usunąć roztwór azi, w którym się moczyły. Poczekam około trzech minut, aż kulki opadną, a następnie odessam nadmiar PBS i powtórzę to jeszcze cztery razy.Koraliki jeszcze się nie ustabilizowały, więc koraliki już opadły, a ja zamierzam odessać nadmiar PBS i powtórzyć to cztery razy. A na koniec dodam 300 mikrolitrów PBS i zacznę pracować z koralikami. To jest standardowa pipeta do ust i zamierzam po prostu wezwać kapilarę, którą wyciągnąłem, i wepchnąć ją tam około jednej trzeciej wysokości.Najpierw napełnij pipety PBS. Zwykle wypełnia się tylko przez działanie kapilarne. Więc to jest pokrywka z 30-milimetrowego naczynia hodowlanego i umieściłem kroplę koralików w kolorze niebieskim.A obok znajduje się mała kropelka PBS. A w tym naczyniu znajduje się pięć mikrolitrowych kropelek roztworu białka. W tym przypadku jest to B i P cztery, ale możesz użyć wybranego białka za pomocą pipety doustnej.Zamierzam przenieść koralik z tego niebieskiego koła tutaj, spłukać go raz w kropli PBS. Następnie wezmę koralik za pomocą pipety doustnej i umieszczę go w kropelce roztworu białkowego i inkubuję w temperaturze pokojowej przez około godzinę lub cztery stopnie przez kilka godzin. Więc tam widzisz pulę koralików w PBS i muszę wybrać koraliki o odpowiednim rozmiarze.Jeśli są za małe, po prostu przejdą przez pipetę doustną. Muszą po prostu usiąść na końcu. Więc teraz widzisz, że wybrałem tam kilka koralików, trzy większe koraliki i trzy mniejsze koraliki.W eksperymencie użyję większych koralików. Zamierzam teraz przenieść duży koralik z kropli PBS na kropelkę roztworu białkowego. Aby to zrobić, delikatnie odsunę język od pipety do ust.Nie jest to ruch ssania, ale po prostu po to, aby wywrzeć trochę podciśnienia. A potem przeniosę go na drugą stronę, a następnie w zasadzie położę język z powrotem nad ustami. Główka rury, nie, ale po prostu dodając trochę pozytywnego ciśnienia, aby zepchnąć rytm z końca.Mam teraz pięć kulek w kropelce roztworu białka i będę je inkubować w temperaturze czterech stopni przez kilka godzin lub alternatywnie w temperaturze pokojowej przez pół godziny do godziny. To jest danie hodowlane, które zawiera błonę, która unosi się w pożywce wraz z bakłażanem, które już przeanalizowałem. Wezmę końcówkę pipety i wezmę trochę mediów.Zamierzam opłukać koraliki w kropli pożywki tylko jeden raz, bezpośrednio przed umieszczeniem koralika na X explan. To są igły wolframowe, których użyję do podniesienia i umieszczenia koralików akrylowych. To jest igła wolframowa i jest teraz w uchwycie.A to są cienkie kleszcze. pod kątem 45 stopni. Zamierzam użyć mojej wolframowej igły w kleszczach, aby podnieść koralik z tej puli PBS i przenieść koralik na kropelkę roztworu białka.Tak jak zrobiłam to z koralikami agel. Podobnie jak w przypadku koralików agel, spłukałem te akrylowe koraliki pięć razy w PBS i przeniosłem kroplę na tę płytkę. Następnie użyję mojej wolframowej igły w kleszczach, aby przenieść kulkę do kropli białka i inkubować, tak jak zrobiłem to z kulkami żelowymi.Więc jest to podniesienie koralika. Prawą rękę mocno opieram o stół, a lewego palcem wskazującym podtrzymuję igłę, gdy schodzę do płynu, delikatnie dotykam igłą koralika i powoli wyjmuję go z płynu. Czasami spada z igły, więc po prostu wróć po inną.Teraz lewą ręką mam kleszcze pod kątem 45 stopni. Czubkami skierowanymi w dół dotykam koralika i igły płynu i używam. Użyj końcówki kleszczy, aby delikatnie go docisnąć.Więc teraz mam pięć koralików w białku. Okej, więc prawą ręką mam wolframową igłę w koraliku, a lewą ręką, moimi kleszczami znowu czubkiem w dół w taki sam sposób, w jaki je odpycham od czterech, zrobię to ponownie tutaj na x explan. Inkubuj w temperaturze 37 stopni, a czas zależy od konkretnego testu.

growth-factor-coated-bead-placement-on-dorsal-forebrain-explants

Research

JoVE Journal

Biology

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

University of California, Irvine (UCI).  Ten film pokazuje dwie metody przygotowania i umieszczania koralików, które zostały pokryte czynnikiem wzrostu, na eksplantatach rozwijającej się kory mózgowej. Kulki te mogą być używane do indukowania ograniczonej przestrzennie ekspresji genów na rozwijającej się tkance nerwowej, takiej jak eksplantaty przodomózgowia. Podano metody stosowania zarówno kulek Affi-Gel, jak i kulek akrylowych heparyny.

Umieszczanie koralików pokrytych czynnikiem wzrostu na eksplantatach grzbietowego przodomózgowia

In This Article

Summary

Disclosures

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles