Choroba Parkinsona jest spowodowana utratą unerwienia dopaminergicznego prążkowia, którą można wywołać eksperymentalnie za pomocą 6-OH-dopaminy. Opisujemy sposób wykonania stereotaktycznej lekcji oraz monitorowania zachowania rotacyjnego indukowanego apomorfiną u myszy. Model ten jest użyteczny i wiarygodny w testowaniu nowych terapii choroby Parkinsona.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model mysi choroby Parkinsona: od uszkodzenia dopaminergicznego 6-OHDA do testów behawioralnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroba Parkinsona (PD) dotyka co najmniej 6,5 miliona ludzi na całym świecie, niezależnie od płci, pochodzenia społecznego, etnicznego, statusu ekonomicznego czy granic geograficznych. Kluczowe objawy, takie jak drżenie, sztywność i bradykinezja, rozwijają się, gdy w istocie czarnej dochodzi do utraty około 3/4 komórek dopaminergicznych, co uniemożliwia płynną i skoordynowaną regulację prążkowiowych obwodów ruchowych. Często występują depresja i halucynacje, a u 20% pacjentów ostatecznie rozwija się otępienie. Obecnie nie istnieje terapia pozwalająca opóźnić lub zatrzymać progresję PD. Dostępne obecnie leki są ukierunkowane przede wszystkim na łagodzenie tych objawów. Nowe strategie chirurgiczne mogą odwracalnie aktywować funkcjonalnie uszkodzone obwody poprzez elektryczną stymulację głębokich struktur mózgu, jednak mimo że głęboka stymulacja mózgu stanowi znaczący postęp, nie jest ona odpowiednia dla wszystkich pacjentów. W związku z tym konieczne pozostaje testowanie nowych podejść w ramach terapii komórkowej w modelach przedklinicznych.
Selektywne neurotoksyczne uszkodzenie szlaków dopaminergicznych można odtworzyć poprzez wstrzyknięcie 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) lub MPTP (1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny), podczas gdy leki wyczerpujące zapasy neurotransmiterów oraz związki wywołujące uszkodzenia oksydacyjne mogą również odtworzyć specyficzne cechy PD u gryzoni. W przeciwieństwie do MPTP, uszkodzenia wywołane 6-OHDA powodują masową, nieodwracalną utratę neuronów i mogą być jednostronne lub obustronne. Model uszkodzeń 6-OHDA jest niezawodny, prowadzi do znacznych deficytów motorycznych i jest najczęściej stosowany po 40 latach badań na szczurach1. Ponieważ interakcje między przeszczepionymi komórkami a organizmem biorcy mogą obecnie być dokładniej badane u myszy niż u szczurów, model ten został przeniesiony na myszy2,3, gdzie został niedawno scharakteryzowany4.
W tym filmie demonstrujemy, jak uszkodzić lewy szlak prążkowio-czarny u znieczulonych myszy poprzez powolne podanie 2.0 μL 6-OHDA za pomocą steryotaktycznie wprowadzonej igły mikrostrzykawki. Utrata dopaminergicznych wlotów następuje w ciągu kilku dni, a dysfunkcje można monitorować w tygodniach i miesiącach po operacji, oceniając rotacje zwierząt indukowane przez związki dopaminergiczne5. Tutaj pokazujemy przeciwstawne rotacje całego ciała występujące 10 minut po pojedynczym podskórnym podaniu apomorfiny, zmierzone miesiąc po uszkodzeniu. Wyniki i ograniczenia metody omówiono poniżej.
Protokół
Wszystkie odczynniki chemiczne przechowywane w formie stałej, takie jak 6-OHDA i apomorfina, rozpuszczono w sterylnej wodzie do wstrzykiwań i przefiltrowano w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć kontaminacji. Ponadto neurotoksyny i substancje neuroaktywne przechowywano, przygotowywano, przetwarzano i utylizowano zgodnie z przepisami określonymi w międzynarodowych wytycznych6 oraz przez lokalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego.
1 - Znieczulenie i operacja
Dorosłe samce myszy szwajcarskich (25-30 g) otrzymują premedykację Atropiną (0,2 mg/kg, s.c.) w celu zmniejszenia napięcia nerwu błędnego, a następnie zostają poddane znieczuleniu poprzez dożylne wstrzyknięcie Ketaminy (90-120 mg/kg) i Ksylazyny (10 mg/kg). Zwierzę umieszcza się na elektronicznie sterowanej podgrzewanej macie (Insight), aby zapewnić utrzymanie temperatury ciała na poziomie 37°C, ponieważ indukcja sedacji trwa kilka minut. Poziom znieczulenia jest sprawdzany przez cały czas trwania procedury poprzez testy braku odruchu wycofania. Dawkowanie środków znieczulających powinno być dostosowane do konkretnej szczepu/kolonii. W zależności od zwierzęcia i czasu trwania operacji, mogą być konieczne dodatkowe dawki Ketaminy. Następnie do obu oczu podaje się sól fizjologiczną (NaCl 0,9%), aby chronić rogówki przed wysychaniem oraz sprawdzić brak odruchu mrugania w pierwszej fazie. Sierść na całej głowie jest golenia trymerem, aby zapewnić minimalny kontakt z obszarami niesterylnymi. Do uchwytów usznych aplikuje się znieczulenie miejscowe (Xylocaine), aby zapobiec dyskomfortowi. Dopiero gdy odruch wycofania i mrugania zanikną, co wskazuje, że poziom znieczulenia jest wystarczająco głęboki do przeprowadzenia operacji (stadium 3), zwierzę zostaje umieszczone w aparacie stereotaksycznym przy użyciu uchwytu do pyska i uchwytów usznych zaprojektowanych specjalnie dla tego gatunku (Insight). Po ustawieniu zwierzęcia, aplikuje się maść okulistyczną (MARCA), aby chronić oczy przez cały czas trwania operacji. Dopiero po upewnieniu się, że oczy są odpowiednio chronione, procedura kontynuowana jest przez dezynfekcję skóry w obszarze operacyjnym poprzez trzykrotne zastosowanie powidonu jodowego, a następnie 70% etanolu, przy użyciu sterylnych patyczków bawełnianych. Następnie sprawdza się prawidłowe umieszczenie uchwytów usznych, testując boczny ruch głowy (głowa nie może się poruszać, aby upewnić się, że uchwyty są stabilnie zamocowane). Prawidłowe nachylenie grzbietowo-brzuszne głowy zostanie zweryfikowane później, gdy zostaną odsłonięte punkty orientacyjne czaszki. Wykonuje się nacięcie strzałkowe (1,5 cm) za pomocą sterylnego skalpela (ostrze nr 15). Okostnę nad obszarem zainteresowania delikatnie zeskrobuje się nowym ostrzem, a kość przeciera się sterylną gazą i patyczkami bawełnianymi, aby odsłonić punkty orientacyjne czaszki: bregma jest definiowana jako punkt przecięcia szwów strzałkowego i czołowego, natomiast lambda to punkt przecięcia szwu strzałkowego z linią najlepiej dopasowaną, przechodzącą przez lewe i prawe części szwu lambdoidalnego. Końcówkę pionowo ustawionej igły referencyjnej zeruje się najpierw na bregma, badając to pod mikroskopem chirurgicznym, a następnie przesuwa tak, aby dotknęła punktu lambda. Jeśli głowa jest prawidłowo ustawiona, lambda powinna znajdować się na tym samym poziomie grzbietowo-brzusznym co bregma, a oba punkty orientacyjne powinny być oddalone od siebie o 4,2 mm wzdłuż osi rostro-kaudalnej. W przeciwnym razie należy poluzować uchwyty uszne i uchwyt do nosa, a głowę delikatnie przechylić wokół osi międzyusznej, aby osiągnąć pożądaną pozycję, która definiuje referencję „płaskiej czaszki” (flat skull) dla pomiarów stereotaksycznych. Końcówkę igły referencyjnej ustawia się następnie w pożądanych współrzędnych: przednio-tylnych (AP +0,5 mm) i bocznych (L -2,0 mm, lewa strona). Lokalizacja zostaje zaznaczona na czaszce i za pomocą sterylnego wiertła otwiera się mały otwór (średnica 1,2 mm), stosując ruchy przerywane, aby zapobiec przegrzaniu obszaru. Fragmenty kości są ostrożnie usuwane kuretą stomatologiczną i przemywane sterylnym, ciepłym 0,9% NaCl. Sterylna strzykawka Hamiltona 5 μl (rozmiar 26s; średnica zewnętrzna 0,47 mm) jest napełniana roztworem 6-OHDA (lub nośnikiem dla zwierząt kontrolnych) i ustawiana pionowo w aparacie stereotaksycznym. Końcówkę igły (typ 2 lub ścięcie 12°) wprowadza się następnie do otworu, aż do dotknięcia powierzchni pialnej, aby wyznaczyć punkt referencyjny współrzędnej grzbietowo-brzusznej. Po wyznaczeniu tej współrzędnej igłę powoli obniża się, aby dotrzeć do współrzędnych prążkowia (AP: +0,5; L: -2,0 oraz DV: -3,0 mm poniżej powierzchni pialnej7). Roztwór 6-OHDA (10 μg 6-OHDA w 0,9% NaCl z 0,02% kwasem askorbinowym), który został przygotowany i przefiltrowany w komorze z laminarnym przepływem powietrza i musi być chroniony przed światłem za pomocą folii aluminiowej przez całą procedurę, jest wstrzykiwany z prędkością przepływu 0,1 μL/min. W przypadku zwierząt kontrolnych wstrzykuje się taką samą objętość nośnika (0,02% kwasu askorbinowego i 0,9% NaCl w sterylnej wodzie). Po wstrzyknięciu całej objętości 2,0 μL strzykawka pozostaje w miejscu przez 5 min, a następnie jest bardzo powoli wycofywana z mózgu w czasie nie krótszym niż 5 minut. Czaszkę oczyszcza się, a nacięcie zamyka szwem nylonowym nr 6-0 (Shalon). Aby zapewnić dodatkową ochronę przed infekcją, można zastosować miejscową maść antybiotykową, np. neomycynę, na zszytą skórę. Zwierzęta są usuwane z aparatu, podaje im się 0,5 ml soli fizjologicznej (s.c.), aby zapobiec odwodnieniu, i utrzymuje się je w cieple pod ścisłą obserwacją do pełnego powrotu do zdrowia. Następnie są umieszczane w klatkach z jedzeniem i wodą ad libitum. Do butelki z wodą do picia dodaje się lek przeciwbólowy przez pierwsze dwa dni po operacji (przy średnim dziennym spożyciu wody 5,5 ml i zalecanej dawce 0,03 mg Ibuprofenu/g masy ciała/dobę; należy dodać 0,82 mL zawiesiny Ibuprofen-Abbott 20 mg/mL do 100 mL wody pitnej). Myszy zazwyczaj szybko wracają do zdrowia po procedurze, swobodnie poruszając się i sięgając po pellety pokarmowe i wodę. W każdym przypadku wyraźnego dyskomfortu lub jakichkolwiek oznak infekcji zwierzęta powinny zostać poddane eutanazji zgodnie z lokalnymi wytycznymi.
2 - Test behawioralny
Chociaż zaburzenia motoryczne można zaobserwować już po tygodniu, przed wiarygodną kwantyfikacją za pomocą testu rotacji dopuszczalny jest miesięczny odstęp po uszkodzeniu. Zwierzę otrzymuje podskórny wtrysk apomorfiny, będącej agonistą DA (0,5 mg/Kg), a następnie zostaje umieszczone w nieprzezroczystym cylindrze o średnicy 30 cm, znajdującym się 45 cm poniżej kamery rejestrującej. Ważne jest, aby przed każdym testem usunąć wszelkie pozostałości i zapachy po wcześniej badanych zwierzętach. Po 5 min okresie habituacji ruchy są rejestrowane w ciągu 5 min. Pomiarowi i porównaniu z grupą kontrolną (wstrzyknięto nośnik) podlegają pełne obroty ciała zarówno w stronę przeciwległą, jak i tę samą. Jeśli procedura została przeprowadzona prawidłowo, zwierzęta kontrolne nie będą wykazywać żadnych rotacji, podczas gdy zwierzęta z uszkodzeniem wywołanym przez 6-OHDA zaczną obracać się w stronę przeciwległą, ponieważ agonista aktywuje przede wszystkim nadwrażliwy, odnerwiony prążkowie po stronie uszkodzonej. Za zwierzęta z pomyślnie wykonanym uszkodzeniem uznaje się te, których wynik przekracza 7 rpm (wykazujące co najmniej 7 pełnych obrotów ciała w stronę przeciwległą na minutę). Zwierzęta mogą zostać bezpiecznie zwrócone do klatek 30 min po teście, który można powtarzać co tydzień. W naszych badaniach mniej niż 5% myszy z uszkodzeniem wykazywało suboptymalną częstotliwość rotacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Szeroką jednostronną destabilizację drogi nigrostriatalnej u myszy można wiarygodnie osiągnąć poprzez pojedynczy wtrysk stereotaksyczny 6-OHDA do prążkowia. Zakres uszkodzenia można zweryfikować po śmierci za pomocą immunohistochemii w kierunku hydroksylazy tyrozynowej (która katalizuje etap ograniczający szybkość syntezy DA, czyli konwersję L-tyrozyny do dihydroksyfenyloalaniny), co przedstawiono na filmie.
In vivo rotacje kontralateralne wywołane apomorfina są lepszym wskaźnikiem maksymalne...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z międzynarodowymi Wytycznymi dotyczącymi Opieki i Wykorzystania Ssaków w Badaniach nad Neurobiologią i Zachowaniem6, po uzyskaniu zatwierdzenia przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Comissão de Avaliação de Uso de Animais em Pesquisa: UFRJ/CAUAP protokół nr DAHEICB 027). Podjęto odpowiednie środki w celu zminimalizowania bólu i dyskomfortu zwierząt doświadczalnych.
Podziękowania
Wspierane przez Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) oraz Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Jesteśmy wdzięczni anonimowym recenzentom, których uwagi pomogły nam ulepszyć zarówno manuskrypt, jak i film.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wodorochlorek ketaminy | König | 90-120 mg/Kg | |
| Wodorochlorek ksylazyny | König | 10 mg/Kg | |
| Siarczan atropiny | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Wodorochlorek hydroksydopaminy | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| Kwas L-askorbinowy | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (chlorowodorek lidokainy) | AstraZeneca | 5% 50 mg | |
| Nebacetin (siarczan neomycyny + bacitracyna) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| Wodorochlorek R-(-)-apomorfiny | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| Maść oftalmiczna GenTeal Hypromellose | Novartis AG | 0.33% | |
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml wody pitnej | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| Wodorochlorek R-(-)-apomorfiny | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
Bibliografia
- Ungerstedt, U. 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).
- Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease. J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).
- Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J. H., Mufson, E. J., Hartley, D. M., Ghosh, S., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Pahan, K. Selective inhibition of NF-kappaB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's Disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 18754-18759 (2007).
- Alvarez-Fischer, D., Henze, C., Strenzke, C., Westrich, J., Ferger, B., Höglinger, G. U., Oertel, W. H., Hartmann, A. Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and a-synuclein-deleted mice. Exp. Neurol. 210, 182-193 (2008).
- Ungerstedt, U. 6-Hydroxydopamine-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine pathway: The turning syndrome. Pharmacology and Therapeutics Part B: General and Systematic Pharmacology. 2, 37-40 (1976).
- Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behaviour Research. , National Academies Press. Comissão de Biosegurança, CCS-UFRJ. 209 (2003).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
- Hudson, J. L., Horne, C. G. van, Strömberg, I., Brock, S., Clayton, J., Masserano, J., Hoffer, B. J., Gerhardt, G. A. Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res. , 626-6167 (1993).
- Truong, L., Allbutt, H., Kassiou, M., Henderson, J. M. Developing a preclinical model of Parkinson's disease: A study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions. Behav. Brain Res. 169, 1-9 (2006).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochir. (Wien.). 101, 89-92 (2008).
- Isacson, O. Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease. JoVE. 3, (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
